Plakophilin-2 gene knockout using CRISPR/Cas9 system

Full Text

Введение Мутации гена плакофиллина-2 (PKP2) являются одной из причин аритмогенной кардиомиопатии - заболевания, характеризующегося замещением миокарда соединительной и жировой тканью, что приводит к нарушению сократительной функции сердца [1]. В основе этого процесса лежит нарушение сигнальных путей, ответственных за дифференцировку и пролиферацию клеток. Одним из этих путей является сигнальный путь Wnt. Ранее было показано, что недостаточность плакофиллина-2 в результате мутации или искусственно вызванного нокдауна гена PKP2 приводит к снижению активности сигнального пути Wnt [2, 3]. Введение же PKP2 дикого типа, напротив, повышает активность этого сигнального пути [4, 5]. В совокупности, эти данные позволяют говорить о том, что уровень PKP2 способен регулировать активность сигнального пути Wnt. Целью настоящей работы являлось создание и тестирование системы нокаута гена PKP2 с использованием методики CRISPR/Cas9, получившей широкое распространение в последнее время. Система CRISPR (короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами) II типа представляет собой систему распознавания ДНК-мишеней у бактерий и архей [6-8]. Центральным компонентом системы является нуклеаза Cas9, направляемая одноцепочечной РНК. Созданные на основе Cas9 системы геномного редактирования включают Cas9 Streptococcus pyogenes и гид-РНК, распознающие участок ДНК длиной 20 п.о. с расположенным неподалёку PAM-сайтом, в районе которого осуществляется двуцепочечный разрыв ДНК [9]. Двуцепочечные разрывы ДНК репарируются двумя основными механизмами - гомологичной рекомбинацией в присутствии донорной цепи ДНК, содержащей участки, гомологичные повреждённой матрице, и негомологичным соединением концов ДНК, приводящим к образованию точечных мутаций в месте соединения и выпадению участков ДНК в случае множественных разрывов [10]. Таким образом, открываются широкие возможности для проведения различных манипуляций с геномом, в частности, на основе системы CRISPR/ Cas9 созданы системы внесения и коррекции мутаций, генного нокаута, активации и ингибирования транскрипции, визуализации отдельных участков ДНК [10-14]. Для тестирования полученной в ходе работы системы нокаута PKP2 использовалась линия клеток HEK 293T. Для оценки влияния нокаута PKP2 на активность сигнального пути Wnt использовались линии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК), направленных к дифференцировке в кардиомиоциты. Материал и методы Культивирование линии клеток HEK 293T Клетки линии HEK 293T культивировали на среде, содержащей DMEM, 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мМ глутамина, 50 МЕ/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина (все Life Technologies, США). Получение и дифференцировка иПСК Подробно процесс получения, характеристики и дифференцировки иПСК описан ранее [5]. иПСК получали путём репрограммирования мультипотентных мезенхимных стромальных клеток жировой ткани, используя Cyto Tune 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Life Technologies, США) согласно рекомендациям производителя. Дифференцировку иПСК осуществляли методом сокультивирования их с клеточной линией END-2, согласно описанной ранее методике [15]. Конструирование векторов и их доставка Для экспрессии Cas9 и гид-РНК использовали векторы pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) и lentiCRISPRv2, любезно предоставленные Feng Zhang (плазмиды e-mail: amalashicheva@gmail.com Гены & Клетки Том XI, № 2, 2016 96 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Addgene #48138 и #52961 соответственно) [16, 17]. Последовательности гид-РНК подбирали при помощи CRISPR design tool (http://crispr.mit.edu/). Последовательности олигонуклеотидов указаны в табл. 1. Синтезированные олигонуклеотиды клонировали в векторы по сайтам рестрикции BsmBI, наличие вставки проверяли путём секвенирования участка полученной плазмиды. В качестве контроля использовали соответствующие векторы, не несущие последовательности гид-РНК. Доставку векторов осуществляли при помощи кальций-фосфатной трансфекции или лентивирус-ной трансдукции. Продукцию лентивирусных частиц осуществляли согласно протоколу, разработанному в лаборатории Д. Троно (http://http://tcf.epfl.ch). Селекцию пуромицином в конечной концентрации 2 мкг/мл осуществляли в течение 5 сут. Клеточный сортинг Сортировку клеток проводили на проточном сортирующем цитофлуориметре BD FACS Aria 3 (BD, США) на базе ресурсного центра СПбГУ «Развитие молекулярных и клеточных технологий». Выделение РНК из клеток и проведение реакции обратной транскрипции РНК из клеток выделяли реагентом ExtractRNA (Евроген, Россия) и обрабатывали ДНКазой I (ThermoScientific, США). Реакцию обратной транскрипции проводили при помощи набора MMLV RT kit (Евроген, Россия) в соответствии с рекомендациями производителя. Полуколичественная ПЦР Полуколичественную ПЦР проводили с использованием Taq-полимеразы (Силекс, Россия) согласно рекомендациям производителя. В качестве рефе-ренсного гена использовали GAPDH. Количественная ПЦР в режиме реального времени Для проведения ПЦР в режиме реального времени использовали смесь qPCRmix-HS SYBR (Евроген, Россия) в сочетании с праймерами из базы данных Primer Depot (http://primerdepot.nci.nih.gov/). Для расчета относительной экспрессии (количества) гена использовали AACt метод, в качестве рефе-ренсного гена использовали последовательность, кодирующую 18S РНК. Последовательности праймеров приведены в табл.1. Электрофорез в полиакриламидном геле и вестерн блоттинг Электрофорез в полиакриламидном геле проводили в модификации Лэммли [18]. Далее белки переносили на мембрану и выявляли при помощи первичных антигенспецифичных антител и вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой (BioRad, США). Оценка активности сигнального пути Wnt Для оценки активности канонического сигнального пути Wnt использовали лентивирусный вектор на основе плазмиды 7TFC (Addgene 24307) [19] и набор Luciferase Assay System (Promega, США). Таблица. Последовательности олигонуклеотидов, использовавшихся в работе Назначение олигонуклеотида Последовательность (5’-3’) Гид-РНК 1 Г ид-РНК 1, комплементарный Гид-РНК 2 Гид-РНК 2, комплементарный Полуколичественная и количественная ПЦР, PKP2, прямой Полуколичественная и количественная ПЦР, PKP2, обратный Полуколичественная ПЦР, GAPDH, прямой Полуколичественная ПЦР, GAPDH, обратный Количественная ПЦР, AXIN2, прямой Количественная ПЦР, AXIN2, обратный Количественная ПЦР, SOX2, прямой Количественная ПЦР, SOX2, обратный Количественная ПЦР, 18S, прямой Количественная ПЦР, 18S, обратный CACCGCCAGACATACTACTCGCTCG AAACCGAGCGAGTAGTATGTCTGGC CACCGCAAGTCGGTCATACCGAAGA AAACTCTTCGGTATGACCGACTTGC GCTGCTTCCGTCCTTCTGTA GGAGTGGTAGGCTTTGGCA CAAGGT CAT CCAT GACAACTTT G GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG AGTGTGAGGTCCACGGAAAC CTGGTGCAAAGACATAGCCA AACCCCAAGATGCACAACTC GCTTAGCCTCGTCGATGAAC GTAACCCGTTGAACCCCATT CCATCCAATCGGTAGTAGCG Гены & Клетки Том XI, № 2, 2016 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 97 Результаты Для создания системы нокаута гена PKP2 на основе CRiSPR/Cas9 была использована стратегия вырезания первого экзона, а также про-моторной области гена. Такой подход позволяет эффективно заблокировать транскрипцию гена. Последовательность и расположение промотор-ной области гена PKP2 были получены из базы данных эукариотических промоторов (http://epd. vital-it.ch/). Подбор последовательностей гид-РНК осуществлялся при помощи программного обеспечения CRISPR design tool (http://crispr.mit.edu/), что позволило одновременно провести анализ внецелевой активности гид-РНК. Были подобраны две гид-РНК, комплементарно связывающиеся с участками геномной ДНК ниже по течению по отношению к промотору и выше по течению по отношению к 3' концу первого экзона (рис. 1). Значение скоринг-функции, указывающей на количество неспецифических мишеней гид-РНК, составило 98, неспецифические мишени в кодирующих областях генома отсутствовали. Для проверки системы была осуществлена трансфекция клеток линии HEK 293Т полученными векторами. Спустя пять суток экспрессия PKP2 в клетках, трансфицированных Cas9 и двумя гид-РНК, была снижена по сравнению с контролем (рис. 2). Чтобы усилить эффект генного нокдауна, трансфицированные клетки были отсортированы по сигналу GFP (рис. 3А). GFP-позитивные клетки демон стрировали заметное снижение экспрессии PKP2 на уровне мРНК по сравнению с контролем (рис. 3Б). Также наблюдалось заметное снижение уровня пла-кофиллина-2 в клетках (рис. 3В). Тем не менее, среди GFP-позитивных клеток наблюдалась остаточная экспрессия PKP2, свидетельствуя о том, что часть клеток продолжала экспрессировать PKP2. Для достижения полного нокаута PKP2 был осуществлён клональный рассев GFP-позитивных клеток. Пять из 11 клонов были отобраны для последующего анализа экспрессии PKP2 на уровне мРНК. В результате, был выявлен клон, не экспрессирующий PKP2 на уровне мРНК (рис. 3Г). Таким образом, было подтверждено эффективное действие двух использовавшихся гид-РНК. Для доставки Cas9 и гид-РНК в иПСК использовался лентивирусный вектор lentiCnSPrv2, несущий устойчивость к пуромицину, что позволило отобрать трансдуцированные иПСК по устойчивости к этому антибиотику. После селекции иПСК были дифференцированы в направлении кардиомиоцитов. Анализ экспрессии PKP2 на седьмые сутки диффе-ренцировки не выявил её существенного изменения в дифференцирующихся иПСК, трансдуцированных Cas9 и гид-РНК (рис 4А). Также в ходе дифференцировки иПСК, трансдуцированных Cas9 и гид-РНК, и контролем не было выявлено достоверных различий в активности люциферазного репортера (рис. 4Б) и повышении экспрессии генов AXIN2 и SOX2 (рис. 4В, Г), являющихся генами-мишенями сигнального пути wnt. X X Cas9 +Гид-РНК 1 Cas9 +Гид-РНК 2 Рис. 1. Схема расположения двуцепочечных разрывов в гене PKP2 Рис. 2. Экспрессия PKP2 спустя 5 сут. после трансфекции клеток линии HEK 293Т векторами, несущими Cas9 и гид-РНК к участкам PKP2 и в контроле Гены & Клетки Том XI, № 2, 2016 98 оригинальные исследования А Б Specimen 001-post sort samplel В плакофиллин-2 ß-актин 1 2 РКР2 Г РКР2 GAPDH Рис. 3. Усиление нокдауна PKP2 в клетках HEK 293T путём клеточного сортинга и отбора клонов: А - результат обогащения популяции GFP-позитивных клеток с помощью клеточного сортинга; Б - экспрессия PKP2 на уровне мРНК в GFP-позитивных клетках и в контроле; В - уровень плакофиллина-2 в GFP-позитивных клетках (дорожка 1) и в контроле (дорожка 2); Г - экспрессия PKP2 на уровне мРНК в контроле (дорожка 1) и отдельном клоне HEK 293T (дорожка 2), дорожка 3 - негативный контроль А РКР2 Б luc-активность В AXIN2 Г SOX2 Рис 4. Экспрессия PKP2 и активность сигнального пути Wnt на 7 сут. дифференцировки иПСК, трансдуцированных Cas9 и гид-РНК к участкам PKP2, и в контроле: А - экспрессия PKP2 на уровне мРНК; Б - активность люциферазного репортера; В - экспрессия AXIN2 на уровне мРНК; Г - экспрессия SOX2 на уровне мРНК Гены & клетки Том XI, № 2, 2016 оригинальные исследования 99 Обсуждение Системы нокаута генов на основе CRISPR/Cas9 успешно применяются на различных клеточных линиях и модельных животных [10, 20-23]. Подход, при котором имеет место нарушение транскрипции гена, имеет преимущество перед методами воздействия на РНК, поскольку позволяет более точно и в течение длительного периода времени моделировать эффект нарушения гена, вызванный мутацией. Применение полученной нами системы CRISPR/ Cas9, направленной на ген PKP2, в режиме нокдауна успешно снижало экспрессию PKP2 в клетках линии HEK 293Т, однако для достижения значительного снижения экспрессии PKP2 требовалось применение клеточного сортинга, а для достижения полного нокаута - клональный рассев предварительно отсортированных клеток с последующим скринингом. Применение системы на линиях иПСК не приводило к эффекту нокдауна PKP2, что могло являться следствием повреждения лишь одного аллеля PKP2 или низкой эффективности использовавшихся гид-РНК в этих клетках. Возможно, для повышения эффективности системы требуется тестирование большего количества гид-РНК и клональный рассев

About the authors

A. A Khudiakov

Federal V.A. Almazov North West Medical Research Centre

Saint-Petersburg, Russia

DA. A Kostina

Federal V.A. Almazov North West Medical Research Centre

Saint-Petersburg, Russia

A. A Kostareva

Federal V.A. Almazov North West Medical Research Centre

Saint-Petersburg, Russia

A. B Malashicheva

Federal V.A. Almazov North West Medical Research Centre; Staint-Petersburg State University

Email: amalashicheva@gmail.com
Saint-Petersburg, Russia

References

Supplementary files