Strategies to edit paralogous genes with CRISPR/Cas9

Full Text

Введение Система CRISPR/Cas9 - перспективный инструмент современной геномной инженерии, одним из направлений применения которого является исправление мутаций, вызывающих наследственные заболевания, как in vitro, так и in vivo [1-4]. В данной работе нами был использован вариант этой системы, который состоит из двух элементов, кодируемых одним плазмидным вектором: sgRNA и Cas9 [3]. Молекула sgRNA представляет собой РНК, содержащую последовательность спейсера, которая по принципу комплементарности связывается с про-тоспейсером (целевым сайтом в геноме). Комплекс e-mail: zakian@bionet.nsc.ru sgRNA и эндонуклеазы Cas9 связывается с целевым протоспейсером в геноме и направленно вносит дву-нитевой разрыв. Обязательным условием является присутствие с 3'-конца протоспейсера мотива, прилежащего к протоспейсеру (protospacer adjacent motif, PAM). Одной из проблем метода CRISPR/Cas9 является относительно высокая вероятность нецелевых эффектов, которые необходимо минимизировать при использовании CRISPR/Cas9 для терапии наследственных заболеваний человека [5]. Вдобавок, в некоторых случаях может потребоваться специфично внести модификации в одну копию гена, не Гены & Клетки Том XI, № 2, 2016 88 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ затронув других, например, при гетерозигонтой мутации [6]. Также существует проблема при внесении модификаций в гены, для которых в геноме присутствуют последовательности с высоким уровнем гомологии, например, в семействах генов. С такой проблемой столкнулся коллектив исследователей из Китая в работе по внесению модификаций в ген HBB человека, кодирующий субъединицу гемоглобина - ß-глобин (мутации в этом гене приводят к развитию ß-талассемии). Ген HBB входит в кластер ß-глобиновых генов и имеет высокую гомологию с геном HBD, который также входит в этот кластер. Благодаря тщательному выбору сайтов для действия CRiSPR/Cas9 в этой работе удалось избежать внесения нецелевых двунитевых разрывов в ген HBD и специфично модифицировать ген HBB [7]. В другой работе подобная проблема возникла при модификации гена CRR5 человека, нокаут которого предотвращает заражение клеток человека ВИЧ (CCR5 - коре-цептор ВИЧ). При этом существует риск нецелевого внесения двунитевых разрывов в близкий гомолог CCR5 - ген CCR2. В данном случае нецелевого эффекта удалось избежать благодаря выбору прото-спейсера CRiSPR/Cas9 на участке негомологичном между двумя генами [8]. Еще одна область применения системы CRiSPR/ Cas9, для которой характерны значительно повышенные требования к специфичности и точности вносимых модификаций - редактирование геномов соматических клеток in vivo для терапии заболеваний человека, имеющих генетическую основу, или для изучения функций и взаимодействий генов in vivo. В отличие от описанных выше работ в этом направлении нет возможности провести анализ и отбор клеток, в которых не было внесено нецелевых двунитевых разрывов, что обуславливает потребность в усовершенствовании методов внесения модификаций [4]. Эти примеры демонстрируют, что несмотря на значительные успехи в области редактирования геномов, одной из основных потребностей данного направления является усовершенствование методических подходов и разработка стратегий использования этих подходов для увеличения точности и специфичности действия CRiSPR/Cas9. В данной работе была использована лабораторная линия крыс Brattleboro для моделирования ситуации, когда необходимо направленно внести модификации: 1) в одну копию гена, не затронув другую копию ; 2) в целевой ген, не затронув близкие гомологи или паралоги. Геном крыс данной линии во втором экзоне гена гормона аргинин-вазопрессина содержит гомозиготную мутацию di/di (diabetes insipidus), которая приводит к развитию наследственного несахарного диабета [9]. В данном случае применение системы CRiSPR/Cas9 может быть затруднено высоким уровнем гомологии между генами аргинин-вазо-прессина и гормона окситоцина. Гены гормонов окситоцина и аргинин-вазопрессина образовались в результате дупликации исходного гена, при этом последовательности этих пептидных гормонов отличаются всего на два аминокислотных остатка [10]. Оба гена состоят из трех экзонов, причем последовательность ДНК, кодирующая сам гормон, находится в первом экзоне. Второй экзон этих генов кодирует центральную часть белка-переносчика нейрофизина ii, которая у двух генов практически полностью совпадает. Целью данной работы являет-сясоздание системы для исправления мутации в гене аргинин-вазопрессина крыс линии Brattleboro, которая бы не затрагивала ген гормона окситоцина. Материал и методы Конструирование векторов для экспрессии системы CRISPR/Cas9 Плазмидные векторы pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 (Addgene plasmid #42230) и pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n(D10A) (Addgene Plasmid #42335) были приобретены в депозитарии Addgene. Последовательности спейсеров были клонированы в соответствующие векторы как описано ранее [3]. CR-7_F 5'-CACCGCAGAAGCCTTGCGGAAGCG-3' CR-7_R 5'-AAACCGCTTCCGCAAGGCTTCTGC-3' CR-8_F 5'-CACCGCAGCGGCCTCGCTTCCGCA-3' CR-8_R 5'-AAACTGCGGAAGCGAGGCCGCTGC-3' CR-N_F 5'-CACCGCGATGGTGCGCACAAAGCC CR-N_R 5'-AAACGGCTTTGTGCGCACCATCGC-3' Пары олигонуклеотидов фосфорилировали с использованием T4 Polynucleotide Kinase (New England Biolabs, M0201S). Затем проводили отжиг пары олигонуклеотидов при понижении температуры с 95°С до 25°С со скоростью 0,3°С/с, после чего двухцепочечные олигонуклеотиды клонировали в соответствующий плазмидный вектор, гидролизованный с помощью эндонуклеазы рестрикции Bbsl (New England Biolabs, R0539S). В результате было получено пять плазмидных векторов: pX330_CR-7, pX330_ CR-8, pX330_CR-N, pX335_CR-7 и pX335_CR-8. Получение эмбриональных фибробластов крыс Эмбриональные фибробласты получали из кожи 19-дневных эмбрионов крыс. Кожу механически измельчали и помещали в 0,25% трипсин (Thermo Fisher Scientific, США) на 10 мин. при 37°С. Клетки осаждали при 1000 об./мин, супернатант убирали. После промывки в фосфатном буфере (PBS) опять осаждали, затем полученный осадок ресуспендиро-вали в культуральной среде и помещали в культуральную посуду. Культивирование эмбриональных фибробластов крыс Клетки культивировали при 37°С, 5% C02 в среде DMEM/F12 с добавлением 10% FBS, 1 мМ L-глутамина, 50 ед./мл пенициллина, 50 ед./мл стрептомицина (Life Technologies, США). Клетки пересевали, используя TrypLE Express (Thermo Fisher Scientific, США). Электропорация Электропорацию эмбриональных фибробластов крысы (106 клеток на образец) проводили с помощью набора Mouse/Rat Hepatocyte Nucleofector Kit (Lonza, VPL-1004) по протоколу производителя, используя программу Q-025. Для анализа активности CRiSPR/Cas9 использовали следующие комбинации плазмидных векторов: 1) 5 мкг pX330_CR-7; 2) 5 мкг pX330_CR-8; Гены & Клетки Том XI, № 2, 2016 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 89 3) 5 мкг pX330_CR-N; 4) 5 мкг pX335_CR-7 + 5 мкг pX335_CR-8. Для проведения экспериментов по гомологичной рекомбинации с донорными олигонуклеотидами использовали следующие комбинации: 1) 5 мкг pX330_CR-7 + 0,3 нмоль DonorF 2) 5 мкг pX330_CR-7 + 0,3 нмоль DonorR 3) 5 мкг pX335_CR-7 + 5 мкг pX335_CR-8 + 0,3 нмоль DonorF 4) 5 мкг pX335_CR-7 + 5 мкг pX335_CR-8 + 0,3 нмоль DonorR. Для контроля электропорации использовали 2 мкг плазмидного вектора pmaxGFP (Lonza). После электропорации каждый образец высевали отдельно в одну лунку 6-луночного планшета (Thermo Fisher Scientific, США) в культуральную среду. Через 2 сут. выделяли геномную ДНК для дальнейшего анализа. DonorF 5'TACCTGCCCTCGCCCTGCCAGTCTGGCCAGAAGCCT TGCGGAAGCGGAGGCCGCTGCGCTGCCGCGGGCATCTGC TGCAGCGATGGTGCGC3' DonorR 5'CGCACCATCGCTGCAGCAGATGCCCGCGGCAGCGC AGCGGCCTCCGCTTCCGCAAGGCTTCTGGCCAGACTGGC AGGGCGAGGGCAGGTA3' Определение эффективности трансфекции Эффективность трансфекции определяли через 2 сут. в контрольных образцах с помощью проточной цитофлуориметрии, используя BD FACS Canto II (BD Biosciences, США). Выделение геномной ДНК Геномную ДНК выделяли с помощью набора QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) согласно протоколу производителя. Анализ активности системы CRtSPR/Cas9 в целевых сайтах Анализ с помощью эндонуклеазы I фага T7 проводили, как описано ранее [11]. Содержащий про-тоспейсер участок геномной ДНК, выделенной из образцов после электропорации, амплифицировали с помощью ПЦР с использованием олигонуклеотид-ных праймеров: Avp6f GACCCCCTT CATACTACT C ACCCT Avp6r GTTAGATTTCCACTCTCGCCCTT Oxt4f CATCCCCTCACACTTGCC Oxt4r GCCCCCTCCTGCTCAC Продукт ПЦР денатурировали при 95°С, затем снижали темепературу до 25°С со скоростью 0,3°С/а Образовавшиеся гетеродуплексы подвергали гидролизу с помощью эндонуклеазы I фага T7 (T7 Endonuclease I, New England Biolabs, M0302S). Результаты анализа визуализировали с помощью электрофореза в 3% агарозном геле. Выявление потенциальных нецелевых сайтов действия CRISPR/Cas9 Потенциальные нецелевые сайты выявляли с помощью программного обеспечения CasOT (http:// eendb.zfgenetics.org/casot/) [12]. Для анализа использовали аннотированную последовательность генома крысы Rattus norvegicus Rnor_5.0.75 (Ensembl). Рестрикционный анализ Целевой участок геномной ДНК, выделенной из образцов после электропорации конструкций CRISPR/Cas9 и донорных олигонуклеотидов, амплифицировали с помощью ПЦР с использованием оли-гонуклеотидных праймеров (Avp6f и Avp6r). Продукт ПЦР подвергали гидролизу с помощью эндонуклеазы рестрикции BcgI (New England Biolabs, R0545S). Результаты анализа визуализировали с помощью электрофореза в 3% агарозном геле. Результаты Выбор протоспейсеров CRISPR/Cas9 Мутация, вызывающая у крыс линии Brattleboro гипоталамический несахарный диабет - делеция гуанина во втором экзоне гена аргинин-вазопрессина (Avp) - может быть исправлена путем замены мутантной последовательности генома на последовательность ДНК дикого типа с помощью гомологичной рекомбинации. В качестве донорной молекулы для гомологичной рекомбинации могут быть использованы одноцепочечные олигонуклеотиды. Ранее было показано, что для эффективного прохождения гомологичной рекомбинации с одноцепочечными олигонуклеотидами оптимальный размер донорной молекулы - 90 нуклеотидов [13]. При этом для увеличения эффективности гомологичной рекомбинации двунитевые разрывы, вносимые системой CRISPR/Cas9, должны возникать в пределах участка гомологии между донорной молекулой и целевым участком генома. Соответственно, для увеличения частоты гомологичной рекомбинации во втором экзоне гена Avp крыс линии Brattleboro на участке вблизи мутации (в пределах 100 нуклеотидов) были выявлены потенциальные протоспейсеры (содержащие с 3'-конца PAM - NGG) CRISPR/Cas9. Чтобы избежать возникновения нецелевых эффектов в гене гормона окситоцина (Oxt) были разработаны три стратегии выбора сайтов действия CRISPR/Cas9, использующие различия между двумя генами (Avp и Oxt): 1) использование самой мутации в качестве отличия между генами; 2) выбор протоспейсера на негомологичном участке - в интроне гена Avp; 3) Использование двух никаз Cas9 для внесения двунитевого разрыва, (рис. 1А, Б, В). В рамках первой стратегии было выбрано два протоспейсера для действия комплекса sgRNA + ну-клеаза Cas9: CR-7 и CR-8 (табл.1). В мутантной последовательности гена Avp крыс линии Brattleboro PAM AGG непосредственно прилежит с 3'-конца к протоспейсеру CR-7, а в последовательности дикого типа в гене Oxt между протоспейсером и PAM находится один нуклеотид (G), в результате чего спейсер сдвигается на один нуклеотид относительно протоспейсера. В случае протоспейсера CR-8 в гене Oxt первые 10 нуклеотидов с 3'-конца спейсера совпадают с последовательностью протоспейсера, а затем происходит сдвиг на один нуклеотид. По литературным данным наиболее «важными» для узнавания протоспейсера системой CRISPR/Cas9 являются 8-10 нуклеотидов на 3'-конце, при этом эта система с определенной частотой способна вносить нецелевые двунитевые разрывы в сайты, отличающиеся от целевого протоспейсера заменами на 5'-конце [5]. Исходя из этих соображений, мы предполагаем Гены & Клетки Том XI, № 2, 2016 90 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ теоретическую возможность внесения двунитево-го разрыва в последовательность гена Oxt CRISPR/ Cas9 га спейсером CR-8. В рамках второй стратегии был использован тот факт, что делеция у крыс Brattleboro произошла близко к стыку экзон-интрон (37 нуклеотидов). Выбран протоспейсер CR-N, большая часть которого и PAM находится в интроне гена Avp (табл.1). Так как только кодирующие части генов Avp и Oxt гомологичны, то в локусе гена Oxt протоспейсера CR-N нет. Для внесения двунитевых разрывов в сайты CR-7, CR-8 и CR-N были сконструированы плазмидные векторы, кодирующие соответствующую sgRNA и нуклеазу Cas9 - pX330_CR-7, pX330_CR-8, pX330_CR-N. Наконец, в третьей стратегии для снижения потенциальных нецелевых эффектов был реализован подход с использованием двух никаз - му-татных нуклеаз Cas9n(D10A), которые вносят разрыв только в одну цепь ДНК. Два одноцепочечных разрыва на расстоянии до 100 нуклеотидов друг от друга приводят к двухцепочечному разрыву. Использование двух никаз уменьшает риск случайных нецелевых эффектов [14]. Поэтому для снижения вероятности возникновения нецелевых эффектов, в том числе и в гене Oxt, были сконструированы парные векторы, кодирующие sgRNA и никазы Cas9n(D10A) - pX335_CR-7 и pX335_ CR-8 (табл.1). Экзон 1 Экзон 2 Экзон 3 _s sgRNA CR-8 Cas9 Экзон 2 Экзон 2 З' 5І MJMMM 5. sgRNA / f n CR-8 саілІЦ_> " "хе Б Экзон 2 Интрон 3' 5' - 5' 3'........................Л.........дмцд. В Экзон 2 етск-8л 5. Ген Avp a*- g .3' 15' ■=■ 9AGG зз*""'............""I...........наш 5' Г .3' -5' Cas9l sgRNA /II \ y^sgRNA ^ârR-7 Г1'"'..... J"*..................I ген Oxt sgRNA CR-N Cas9 д Tube Tube .001 S "il P3 Populat.. fEvents ДОагелІ «Total ■аііЄує 22.92» ff*» 1000 № ■ pi 11.163 48.7 487 fi и 584 52 2.5 Н И H Я / \ 8 \ & Cas?J $■ . Q- ai <b . Or A ЮООп.н. л5 ? «+/ f ТбОг^у. 500п.н. \ & -§>/ <§>' 4 4 9> ^ ^ Q? oi Ы % . U C? A / * ïf <f P2 ~95°Д Avp Oxt Рис. 1. Разработка стратегий для направленного внесения двунитевых разрывов в ген гормона аргинин-вазопрессина в эмбриональных фибробластах крыс линии Brattleboro: А-В - схема расположения сайтов для действия системы CRISPR/Cas9 (зеленым изображена кодирующая часть гена, серым - интронная часть гена; красным - single-guide РНК (sgRNA), узнающий соответствующий протоспейсер; желтым - последовательности мотивов, прилежащих к протоспейсеру (PAM)); Г - оценка эффективности электропорации; Д - результаты анализа с помощью эндонуклеазы I фага T7. Avp - ген гормона аргинин-вазопрессина, Oxt - ген гормона окситоцина. Стрелками обозначены продукты гидролиза, наличие которых свидетельствует о внесении в целевой ген двунитевых разрывов Таблица 1. Последовательности целевых сайтов в гене Avp крыс линии Brattleboro Название Последовательность протоспейсера PAM* CR-7 CCAGAAGCCTTGCGGAAGCG -AGG CR-8 GCAGCGGCCTCGCTTCCGCA -AGG CR-N GCGATGGTGCGCACAAAGCC -AGG * - мотив, прилежащий к протоспейсеру (PAM). Гены & Клетки Том XI, № 2, 2016 оригинальные исследования 91 Анализ способности системы CRISPR/Cas9 вносить двунитевые разрывы в целевом сайте Для определения способности элементов системы CRISPR/Cas9 вносить двунитевые разрывы в целевом сайте гена Avp проводили трансфекцию сконструированных плазмидных векторов в эмбриональные фибробласты крыс линии Brattleboro с помощью электропорации. Эффективность трансфекции составила ~95% (рис. 1Г). Через двое суток анализировали продукты ПЦР с помощью эндонуклеазы I фага T7. Мы обнаружили, что двунитевые разрывы происходят во всех целевых протоспейсерах, причем при использовании двух никаз также детектируются следы двунитевых разрывов (рис. 1Д). При этом следов двунитевых разрывов на участке второго экзона гена Oxt обнаружено не было, следовательно, все разработанные стратегии позволяют избежать нецелевого эффекта в паралогичном гене. Биоинформатический анализ нецелевых эффектов Для определения потенциальных сайтов нецелевого действия системы CRISPR/Cas9 в геноме (кроме гена Oxt) был проведен анализ с помощью программного обеспечения CasOT для каждого из Таблица 2. Топ-5 нецелевых сайтов CRISPR/Cas9 Спейсер CR-7 ctgagccg_CTTGCGGAAGCG aCAGgAGC_CTTGCGcAAGCG GgAccAGC_CTTGgGGAAGCG aCAGtgGC_CTTGtGGAAGCG GaAGAAat_CTTGCaGAAGCG Общее число потенциальных нецелевых сайтов CR-8 GCtGCacC_CT CGCTTCCGCA Gatcacaa_CTCGCTTCCGCA GgAGgaGC_CTgGCTTCCGCA GaAcCttC_CTCcCTTCCGCA cCgGCtaC_CTCtCTTCCGCA Общее число потенциальных нецелевых сайтов CR-N GtagTGGT_GCGCACAAAGCC GCcccGGa_GCGCACAAAGCC aCtggGag_GCGCACAAAGCC GacccGcc_GCGCACAAAGCC cacccccT_GCGCACAAAGCC Общее число потенциальных нецелевых сайтов выбранных спейсеров. Вероятность внесения двунитевых разрывов в нецелевом сайте, отличающегося от целевого однонуклеотидными заменами, зависит от количества и характера распределения этих замен [5]. Выявленные нецелевые сайты были ранжированы, после чего определяли: 1) общее число потенциальных нецелевых сайтов; 2) количество замен в сайте, для которого наиболее вероятно внесение нецелевого двунитевого разрыва (первый в рейтинге) (табл. 2). Программное обеспечение присваивает на основании числа и характера отличий от целевого сайта потенциальным нецелевым сайтам ранг, представляющий собой двузначное число, где первая цифра - число замен в пределах первых 8 нуклеотидов от 3' конца (наиболее важный для узнавания участок), вторая цифра - число замен на 5'-конце сайта. Соответственно, чем больше ранг, тем больше замен в нецелевом сайте и тем меньше вероятность внесения нецелевого двунитевого разрыва [12]. И наоборот, чем меньше ранг, тем меньше различия между целевым и нецелевым сайтом и тем больше вероятность нецелевого эффекта. На основании данного анализа для дальнейшего использования был выбран спейсер CR-7, поскольку наиболее вероятный нецелевой сайт связывания этого спейсера содержит наибольшее число за- -TGG 8 A08 -CGG 3 A12 -CGG 4 A13 -AGG 4 A13 -TGG 4 A13 3624 -GGG 3 A03 -CGG 7 A07 -GGG 4 A13 -TGG 5 A14 -GGG 5 A14 3934 -CGG 3 A03 -TGG 4 A04 -TGG 6 A06 -AGG 6 A06 -TGG 7 A07 6795 Последовательность нецелевого PAM** Число ранг* протоспейсера в геноме* замен * - строчными буквами обозначены замены относительно целевого сайта, знаком «_» отделена наиболее чувствительная к заменам область. ** - мотив, прилежащий к протоспейсеру (PAM). *** - описание в тексте статьи. Гены & клетки Том XI, № 2, 2016 92 оригинальные исследования мен (семь однонуклеотидных замен против трех нейшей работы была отобрана стратегия с исполь-для CR-8 и CR-N). Также на основании биоинфор- зованием двух никаз pX335_CR-7 + pX335_CR-8 матического анализа нецелевых сайтов для даль- (табл. 3). Таблица 3. Топ-5 нецелевых сайтов при использовании двух никаз для внесения двунитевого разрыва pX335_CR-7 pX335_CR-8 Расстояние Последовательность сайта в геноме* PAM** Ранг*** Последовательность сайта в геноме* PAM** Ранг*** между сайтами, п.н. tCctgctC_ AGG A16 GCtGCacC_ GGG A03 18 CcTGCGGAAGCG CTCGCTTCCGCA cCAGtctC AGG A14 aCAGtgGC_ AGG A13 18 CTCGCTTCCaCA CTTGtGGAAGCG aCgtacaC AGG A16 GgAaggaC_ AGG A15 18 CTCGtTTCCGCA CTTGCGGAAaCG tCcactGC AGG A15 GgcctccC_ AGG A16 18 CTTcCGGAAGCG CTCGCTTCCGgA taAcaGcC AGG A15 agcGcctC_ AGG A16 18 CTgGCTTCCGCA CTTGCGGAAGCc Общее число потенциальных нецелевых сайтов 7558 * - строчными буквами обозначены замены относительно целевого сайта, знаком «_» отделена наиболее чувствительная к заменам область. ** - мотив, прилежащий к протоспейсеру (PAM) *** - описание в тексте статьи. Выбор последовательностей донорных олигонуклеотидов для гомологичной рекомбинации Показано, что для эффективного прохождения гомологичной рекомбинации с одноцепочечными олигонуклеотидами оптимальным размером донор-ной молекулы является 90 нуклеотидов. При этом целевые замены происходят с наибольшей частотой, если однонуклеотидные замены, которые будут внесены в целевой сайт генома, располагаются в центре донорной молекулы [13]. Используя данные критерии, для проведения гомологичной рекомбинации для исправления мутации были выбраны донорные олигонуклеотиды длиной 90 нуклеотидов в прямой (DonorF) и обратной ориентации (DonorR), представляющие собой участок последовательности второго экзона гена Avp дикого типа (рис. 2А). Рестрикционный анализ В результате делеции гуанина во втором экзоне гена Avp крыс линии Brattleboro возникает сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции BcgI (рис. 2Б). В данной работе мы использовали этот факт, чтобы отличить мутантную последовательность от последовательности дикого типа. С помощью электропорации в эмбриональные фибробласты крыс линии Brattleboro доставляли плазмидные векторы pX330_CR-7 или pX335_CR-7+ pX335_CR-8 одновременно с донорными олигонуклеотидами. Через двое суток выделяли геномную ДНК и проводили рестрикционный анализ продуктов ПЦР после амплификации участка второго экзона гена Avp, используя эндонуклеазу рестрикции BcgI. В результате этого анализа мы обнаружили, что продукт ПЦР, полученный при использовании в качестве матрицы геномной ДНК опытных образцов, гидролизуется не полностью (рис. 2В). По-видимому, в опытных образцах пропадает сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции BcgI, что возможно является результатом прохождения гомологичной рекомбинации и замены мутантной последовательности второго экзона гена Avp на последовательность дикого типа. Обсуждение В данной работе мы использовали систему CRiSPR/Cas9 для внесения направленных изменений в ген гормона аргинин-вазопрессина крыс линии Brattleboro. Целевой участок гена отличается всего на один нуклеотид от соответствующего участка гена гормона окситоцина - делецией гуанина во втором экзоне гена гормона аргинин-вазопрессина, которая приводит к развитию гипоталамического несахарного диабета у крыс этой линии.Тем не менее с помощью тщательного выбора сайтов для действия CRiSPR/Cas9 нам удалось обеспечить узнавание целевого гена и избежать нецелевых эффектов в гене окситоцина. Для этого нами в качестве отличия между паралогичными генами была использована сама мутация. Более того с использованием двух никаз не только не происходит внесения нецелевых двуни-тевых разрывов в паралогичном гене, но и снижена вероятность нецелевых эффектов в других сайтах в геноме. Гены & клетки Том XI, № 2, 2016 оригинальные исследования 93 А В Рис. 2. Выбор донорных одоцепочечных олигонуклеотидов и результаты рестрикционного анализа: А - схема целевого участка гена аргинин-вазопрессина (Avp) (CR7, CR8 - протоспейсеры (красные линии), DonorF - донорный одноцепочечный олигонуклеотид в прямой ориентации, DonorR - донорный одноцепочечный олигонуклеотид в обратной ориентации); Б - сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции BcgI в гене Avp (желтым обозначены нуклеотиды, которые узнает BcgI, зеленым - участок, вырезаемый BcgI, звездочкой - делеция в гене Avp крыс Brattleboro, красным - соответствующие последовательности в гене Avp); В - результаты рестрикционного анализа. +/+--образец дикого типа; +/di - гетерозиготный образец. Стрелками обозначены не гидролизованные продукты в экспериментальных образцах. п.н. - пары нуклеотидов Разработанные нами стратегии выбора спейсеров CRISPR/Cas9 позволяют направленно вносить модификации в целевые мутантные копии генов, не затрагивая при этом копии дикого типа. Такой подход может быть использован при исправлении мутаций или, наоборот, внесении мутаций (для моделирования заболеваний in vitro) в геном гетерозигот по целевому гену, либо в случае, когда целевой ген входит в семейство генов с близкими последователь ностями. Также другой точкой приложения этих стратегий является направленный нокаут целевых генов, например, для изучений функций отдельных генов, входящих в кластеры генов. Благодарности

About the authors

A. A Nemudryi

Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics, the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences; Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences; State Research Institute of Circulation Pathology, Ministry of Healthcare of the Russian Federation

T. B Malankhanova

Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics, the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences; Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences; State Research Institute of Circulation Pathology, Ministry of Healthcare of the Russian Federation; National Research University Novosibirsk State University

A. A Malakhova

Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics, the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences; Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences; State Research Institute of Circulation Pathology, Ministry of Healthcare of the Russian Federation

S. P Medvedev

Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics, the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences; Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences; State Research Institute of Circulation Pathology, Ministry of Healthcare of the Russian Federation

S. M Zakian

Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics, the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences; Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences; State Research Institute of Circulation Pathology, Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: zakian@bionet.nsc.ru

References

Supplementary files