Long noncoding RNA expression pattern in the X inactivation center of rodents

Full Text

Введение У диплоидных организмов большинство генов экспрессируются с обеих аллелей. Однако существуют множество случаев моноаллельной экспрессии. Классический пример этого явления - компенсация дозы генов Х-хромосомы у млекопитающих. Двукратное различие в числе копий Х-сцепленных генов у самцов (XY) выравнивается за счет подавления транскрипции большинства генов на одной из двух Х-хромосом у самок (XX) в результате процесса, названного инактивацией Х хромосомы. Элементы, контролирующие основные стадии Х-инактивации (подсчет числа Х хромосом, выбор будущей неактивной хромосомы и инициация замол-кания генов) располагаются в определенном локусе Х-хромосомы, названном XIC (X inactivation center). Центр инактивации Х-хромосомы мыши обогащен генами некодирующих РНК. У грызунов в пределах ХЮ на протяжении 100-500 т. п. н. находится как минимум 7 областей некодирующих ядерных РНК, таких как: Xist, RepA, DXPas34, Xite, Tsix, Jpx/Enox, Ftx [1-3]. Некоторые из этих РНК являются необходимыми для Х-инактивации. Так, ген Xist (X inactive specific transcript) производит нетранслируемую, e-mail: antares@bionet.nsc.ru ядерную РНК, необходимую для инициации инактивации Х-хромосомы [4]. Регуляция Xist, по-видимому, зависит от многих генов. Так, было показано, что в данной регуляции участвуют длинные некодирующие РНК центра инактивации - Jpx и Ftx. Jpx активирует экспрессию Xist на неактивной Х-хромосоме. Делеция данного гена в клетках самцов не вызывает эффекта, а в клетках самок, напротив, приводит к серьезным нарушениям развития [5]. Некодирующая РНК Ftx также влияет на экспрессию Xist. Делеция Ftx вызывает изменение структуры хроматина и снижение уровня экспрессии Xist. Однако ключевым регулятором экспрессии Xist является его антисмысловой ген Tsix, обнаруженный у мыши [6], полевки, крысы [7] и человека [8]. Наиболее подробно этот ген и его регуляция изучены у мыши. Длина Tsix составляет примерно 40 т. п. н., выявлены две основные точки старта транскрипции мажорная и минорная. Исследования экспрессии показали, что у мыши основная точка старта транскрипции Tsix располагается на расстоянии 15 т. п. н. от 3'-конца гена Xist. Дополнительный минорный промотор обнаружен на расстоянии 28 т. п. н. Гены & Клетки Том XI, № 2, 2016 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 83 от 3'-границы [9]. Определены дистальные регуляторные элементы Tsix: кластер тандемных повторов DXPas34 и Xite (X intergenic transcription element), и предложены модели их взаимодействия [10]. Xite расположен выше Tsix и способствует его асимметричной экспрессии при выборе Х-хромосомы для инактивации. Он расположен в районе 20-32 т. п. н. от З'-границы гена Xist, содержит сайты гиперчувствительности к ДНКазе i и несколько точек старта транскрипции. В эксперименте нокаут Xite уменьшал устойчивость транскрипции соседствующего с ним Tsix, что снижало шансы выбора мутантной Х в качестве активной. Xite является энхансером транскрипции Tsix, увеличивая стабильность его экспрессии. Возможно, регуляторный эффект Xite реализуется через модификацию структуры хроматина [11]. У мыши для функционирования Tsix его анти-смысловая транскрипция должна перекрывать промотор гена Xist [12], что также справедливо для Tsix полевки и крысы. Однако у человека экспрессия TSIX терминируется задолго до промотора XIST и, вероятно, не может препятствовать его экспрессии. Ген TSIX человека обеднен CpG-островками, которые являются необходимыми для функционирования его ортолога у мыши [11, 13-15]. Более того, с помощью РНК FiSH- было показано, что в клетках человека TSIX и XIST коэкспрессируются с неактивной Х-хромосомы, что также говорит о неспособности данного антисэнс-транскрипта отрицательно регулировать XIST [16]. Экспрессия РНК TSIXне поддерживается на неактивной Х-хромосоме, но остаётся на активной. Другим важным отличием Tsix у человека является его низкий уровень экспрессии [14, 16, 17]. Предполагают, что регуляция гена Xist с помощью антисмысловой РНК Tsix является видоспецифичной для грызунов. Кроме мыши, ген Tsix детально изучен у полевок. Была получена полная геномная последовательность, определены границы гена и его экзон-ин-тронная структура для четырёх видов обыкновенных полёвок (M. arvalis, M. levis, M. transcaspicus и M. kirgisorum), обнаружены альтернативные варианты сплайсинга. Показано наличие блока миниса-теллитных повторов, аналогичного регуляторному району DXPas34 мыши. По сравнению с другими грызунами, у полевок произошла перестройка ло-куса XiC, в результате которой в нем не обнаружен Xite - подобный элемент и первый экзон Tsix [7]. В настоящей работе проведены анализ и сравнение профилей экспрессии в локусе центра инактивации у полевок, крысы и мыши с целью определить нюансы их регуляции у разных видов и выявить новых участников процесса инактивации Х-хромосомы. Материал и методы Референсные последовательности локуса центра инактивации Х-хромосомы мыши и крысы были экстрагированы из соответствующих сборок геномов MM10 и RN6. Для полевок использовали последовательность из GeneBank ACC AJ310130.1. Последовательности для анализа транскриптомов мыши были загружены из базы данных NCBi SRA (http: // www.ncbi.nlm.nih.gov/sra). Использовали данные о секвенированых транс-криптомах мыши со следующими регистрационными номерами: SRX1598951 и SRX502126 - дифференцированные клетки фибробластов самки и самца мыши, ERX594376 - преимплантацион-ный эпибласт, ERX594384 - постимплантацион-ный эпибласт, SRX316302 - ЭСК JM8.F6 самки, SRX316300 - эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) самца Bruce4, SRX316298 - индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) самца. У полевок были секвенированы транскриптомы фибробластов - A1, SA004, Sa005, SAD4, трофо-бластных стволовых (ТС) клеток - RTS1, CKR134 и клеток экстраэмбриональной энтодермы (XEN) - L7.10, M6S3. Данные секвенирования транскриптомов по крысе были получены нами ранее [18] (http://trace. ddbj.nig.ac.jp/DRASearch/study?acc = SRP019984) для клеточных линий RNFF1, RNFM1 - эмбриональные фибробласты самки и самца соответственно, RES27, dB50 - ЭСК самки и самца, NF13, NF21, QV8 - ИПСК самок, SU3 - ИПСК самца. Транскриптомы картировали на соответствующие референсные последовательности с использованием программы bowtie2 [19]. Результирующие файлы в формате SAM визуализировали и анализировали с использованием программного обеспечения Geneious 9.0.2 (http: //www.geneious.com) [20]. Результаты Мы использовали данные по секвенированию транскриптомов нескольких клеточных линий мыши, полученных из базы данных SRA: эмбриональных стволовых клеток bruce4, индуцированных плюри-потентных стволовых клеток, фибробластов MEF10, а также эпибласта до и после имплантации. Экспрессия в локусе центра инактивации у мыши изучена уже достаточно детально. Наш анализ согласуется с результатами других исследований. Ген Xist транскрибируется в плюрипотентных клетках обоих полов и не транскрибируется в дифференцированных клетках самцов. Ген Tsix экспрессируется в плюрипотентных клетках, но его транскрипты не обнаруживаются в дифференцированных клетках (рис. 1). Анализ клеток эпибласта у мыши выявил интересную особенность. До имплантации экспрессируется только очень короткая форма гена Xist в районе А-повтора (рис. 1). Сразу после имплантации в этих же клетках картина резко меняется. Экспрессируется не описанная ранее форма гена Tsix, которая перекрывает несколько экзонов Xist и продолжается транскрипция короткой формы Xist (рис. 1). Также на этой стадии начинают экспрессироваться два других гена центра инактивации Ftx и Jpx (данные не показаны). На более поздних стадиях снова появляется обычная форма Xist, а Tsix прекращает работу (рис. 1). В фибробластах самцов мыши экспрессия в центре инактивации не вывялятся. На основании анализа транскриптома нескольких клеточных линий самок полевок с разной степенью дифференцировки (фибробластов, а также стволовых клеток экстраэмбриональной эндодермы и трофобласта) были построены профили экспрессии генов центра инактивации для этого вида (рис. 2). Последовательность XiC была получена и проанализирована у обыкновенных полевок рода Microtus в предыдущих исследованиях [7, 21, 22]. Во всех 8 исследованных линиях клеток наблюдается экспрессия гена Xist (рис. 2). Интересно отметить, что по данным транскриптомного анализа в составе РНК Гены & Клетки Том XI, № 2, 2016 84 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ гена Xist полевок выявляется 7 экзонов, тогда как по данным предыдущих исследований предполагалось наличие 8 экзонов. Дело в том, что результаты анализа транскрипома полевки показывают, что экзон 7, интрон 7 и экзон 8 гена Xist у данного вида экспрессируются как один большой экзон. Остальные экзон-интронные границы Xist полевок совпадают с определенными ранее методом ОТ-ПЦР. В четырех линиях клеток у полевок, кроме того, выявляется РНК Tsix, который экспрессируется на более низком уровне чем Xist. Это видно в районах, где гены Xist и Tsix полевок не перекрываются, то есть в экзонах 1 и 4 гена Tsix. Экспрессия Tsix выявлена в экстраэм-бриональной эндодерме и фибробластах M. arvalis, а также в фибробластах гибридной линии SA004. (рис. 2), но не обнаружена в стволовых клетках тро-фобласта. В клеточных линиях полевок наряду со сплайсированными формами Tsix выявляется фоновая экспрессия через весь локус данного гена, которая соответствует неслайсированным вариантам его транскрипта. Ранее наличие неплайсированных транскриптов данного гена у полевок было обнаружено с помощью нозерн блот-гибридизации, подобные неслайсированные варианты Tsix также имеются у мыши и крысы. Во всех линиях полевок дополнительно выявляется экспрессия между генами Enox (Jpx) и Xist. Она соответствует установленной ранее антсмысловой транскрипции, в районе промотора гена Enox [7]. Подобная транскрипция в этом районе выявляется только у полевок. Другой интересный факт - выборочная экспрессия гена Slc16A2, который у полевок также входит в центр инактивации. Как видно из рисунка, в трех линиях из восьми его экспрессии нет(рис. 2). Е д Г В Б А Рис. 1. Структура локуса центра инактивации Х-хромосомы и профиль экспрессии в клеточных линиях мыши: А - профиль ЭСК самца Bruce4; Б - профиль ЭСК JM8.F6 самки; В - профиль ИПСК самца; Г - профиль клеток преимплантационныого эпибласта; Д - профиль клеток постимплантационного эпибласта; Е - профиль дифференцированных фиброластов самки. Зелеными линиями условно обозначены гены; красными - известные транскрипты; оранжевым - мобильные элементы. Уровень экспрессии показан голубым цветом, его значение определялось как десятичный логарифм числа ридов, картированных на референсную последовательность З Ж [э) , Е Д_<°> г (d) , шіЙІ. -t- .* J ліМ В Б А Рис. 2. Структура локуса центра инактивации Х-хромосомы и профиль экспрессии в клеточных линиях полевки: А-Г - профили для линий фибробластов - A1, SA004, Sa005, SAD4 соответственно; Д, Е - профили клеток экстраэмбриональной эндодермы - L7.10, M6S3; Ж, З - стволовые клетки трофобласта RTS1 и CKR134. Зелеными линиями условно обозначены гены; красными - известные транскрипты; оранжевым - мобильные элементы. Уровень экспрессии показан голубым цветом, его значение определялось как десятичный логарифм числа ридов, картированных на референсную последовательность Гены & Клетки Том XI, № 2, 2016 оригинальные исследования 85 Аналогично были исследованы профили экспрессии нескольких клеточных линий у крысы. По сравнению с мышью и полевкой у нее выявляется большое количество разных транскриптов как внутри, так и в окружении гена Xist. Это видно, например, по анализу EST (рис. 3). Интересный факт - уровень экспрессии гена Xist намного меньше, чем Tsix, что характерно как для дифференцированных, так и для плюрипотентных клеток. Транскрипт гена Tsix при этом содержит три больших экзона. Первый и последний экзоны Txis, картированные по результатам анализа транскриптома крысы, совпадают с определенными ранее методом ОТ-ПЦР [7]. Выявленный впервые в данной работе второй экзон Tsix практически полностью перекрывает седьмой экзон Xist. Таким образом, в сплайсированной РНК Tsix крысы имеются дополнительные экзоны, которых нет у мыши и полевки. Обсуждение Предположительно, антисмысловая пара генов Xist/Tsix является главным регулятором процесса инактивации Х хромосомы. Особенно четко это показано для мыши. В недифференцированных клетках Tsix экспрессируется с обеих Х хромосом. Во время этой стадии, Xist РНК экспрессируется на очень низком «базальном» уровне. На момент начала дифференцировки клеток Tsix продолжает экспрессироваться только на будущей активной Х хромосоме, подавляя на ней экспрессию Xist. На неактивной Х хромосоме снижение уровня Tsix влечет за собой активацию Xist [11]. Это мы и наблюдаем при анализе профиля экспрессии в ЭСК (рис. 1). Однако крыса и мышь отличаются принципиально по соотно шению уровня экспрессии этих двух генов. У мыши экспрессия Tsix намного ниже Xist, у крысы - наоборот, намного выше. Кроме того, у крысы Tsix имеет 3 протяженных экзона, один из которых перекрывает 7 экзон Xist. Такая структура гена характерна только для крысы (рис. 2). У полевок также имеется специфика в организации транскрипта Tsix. Однако все три вида объединяет практически идентичные последний экзон и начало основного старта транскрипции Tsix. В случае импринтированной инактивации в экс-траэмбриональных тканях Xist и Tsix, экспрессируются с отцовской и материнской Х хромосомы соответственно [9, 23]. Сходную картину мы наблюдаем и в клеточных линиях экстраэмбриональной эндодермы полевок, которые отражают импритированную инактивацию. Импринтиг экспрессии генов Xist и Tsix в преимплантационном развитии является необходимым для нормальной жизнеспособности эмбрионов [4, 9, 23, 24]. При передаче от отца мутантной Х, импринтированная инактивация не может произойти, что приводит к гибели эмбрионов женского пола вскоре после имплантации, т.к. в экстраэмбриональ-ных тканях представлены две активные Х хромосомы [24]. Тем не менее, в секвенированных транскрипто-мах стволовых клеток трофоэктодермы транскрипты Tsix не выявляются. Это может свидетельствовать о том, что в данном типе клеток Tsix экспрессируется на низком уровне, или же говорить о том, что его транскрипт слабо полиаденилирован и не отбирается при секвенировании во фракции поли-Ш РНК. На будущей неактивной Х хромосоме экспрессия Tsix прекращается, что позволяет стабилизировать Xist и запустить процесс инактивации. Продолжение экспрессии Tsix блокирует активность Xist, что необходимо для поддержания активного состояния З Ж Е д Г В Б А Рис. 3. Структура локуса центра инактивации Х-хромосомы и профиль экспрессии в клеточных линиях крысы: А - SU3 - ИПСК самцов; Б-Г - NF13, NF21, QV8 ИПСК самок; Д, Е - RES27, dB50 ЭСК самки и самца; Ж, З - RNFF1, RNFM1 эмбриональные фибробласты самки и самца. Зелеными линиями условно обозначены гены, красными - известные транскрипты, оранжевым - мобильные элементы. Уровень экспрессии показан голубым цветом, его значение определялось как десятичный логарифм числа ридов, картированных на референсную последовательность Гены & клетки Том XI, № 2, 2016 86 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Х-хромосомы [6]. Далее, после инактивации, работа гена Tsix у мыши прекращается. У крысы, также как и у мыши, экспрессия Tsix у самок не наблюдается, но остается у самцов. У полевок Tsix экспрессируется на активной Х-хромосоме как у самцов, так и у самок. У всех исследованных видов грызунов и на всех стадиях, где экспрессируется Xist, преобладает длинная изоформа гена, содержащая 7 экзонов. В состав последнего входят установленные ранее 7 экзон, 7 интрон и 8 экзон данного гена. По всей видимости, именно такая изоформа необходима для инактивации. Исключение составляют клетки эпибласта у мыши, где экспрессируется супер-короткая форма Xist, обнаруженная также ранее в других исследованиях [25]. Ген Tsix у полевок, в отличии от мыши, у которой он активен только на ранних стадиях онтогенеза до инактивации X-хрмосомы и потом замолкает, может экспрессироваться и на более поздних стадиях онтогенеза в клетках экстраэмбриональной эндодермы и даже в фибробластах. Кроме Xist и Tsix во всех линиях клеток полевок нами обнаружен видоспецифический транскрипт в районе гена Enox. Он присутствует только у полевок, и не имеет значимых

About the authors

E. A Elisaphenko

Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics, the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences; Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences; State Research Institute of Circulation Pathology, Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: antares@bionet.nsc.ru
Novosibirsk, Russia

A. I Shevchenko

Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics, the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences; Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences; State Research Institute of Circulation Pathology, Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: antares@bionet.nsc.ru
Novosibirsk, Russia

S. M Zakian

Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics, the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences; Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences; State Research Institute of Circulation Pathology, Ministry of Healthcare of the Russian Federation; National Research University Novosibirsk State University

Email: antares@bionet.nsc.ru
Novosibirsk, Russia

References

Supplementary files