Osteogenic potential of multipotent mesenchymal stromal cells from human exfoliated deciduous teeth before and after cryopreservation

Full Text

Потребность клинической медицины в технологиях, обеспечивающих эффективное восстановление органов и тканей, утраченных в результате травм, резекции опухолей, аномалий развития и других патологических состояний, приводит к необходимости вести поиск новых подходов к использованию регенератор- ного потенциала стволовых клеток. Наиболее доступными и безопасными для применения в клинической практике являются мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК), получаемые из разных тканей взрослого человека. С возрастом пролиферативная активность и способность к дифференцировке ММСК заметно снижаются, поэтому выделение этих клеток из тканей людей в молодом возрасте и их банкирование позволит сохранить биологический потенциал ранних популяций [1, 2]. Одним из наиболее доступных источников ММСК у детей являются ткани пульпы молочных зубов, выпавших естественным путем [3]. Получение биологического материала из таких зубов относится к неинвазивным методам, поэтому не имеет этических ограничений и может применяться для создания персонального банка стволовых клеток пациента с целью применения, при необходимости, спустя десятки лет. Важным аспектом при разработке технологий забора и хранения клеток и тканей пульпы является сохранение их биологических свойств после криоконсервации. Для длительного хранения ММСК пульпы выпавшего молочного зуба (в зарубежной номенклатуре - SHED-клеток (от англ. stem cells from humanexfoliated deciduous teeth)) используют разные подходы к криоконсервации: замораживание целого зуба, извлеченной из зуба интактной пульпы и культур SHED-клеток, полученных из тканей пульпы [4-7]. Поскольку пульпа молочных зубов постепенно деградирует по мере резорбции корня зуба, и, следовательно,не каждый образец пульпы содержит жизнеспособные клетки, наиболее эффективно порционно криоконсервировать культуры SHED-клеток. Результаты недавно проведённого исследования показали, что криоконсервация не влияет на пролиферативный потенциала SHED-клеток [8]. Однако для эффективного применения SHED-клеток с целью стимулирования регенерации костной ткани необходимы данные о влиянии криоконсервации на их способность дифференцироваться в остеогенном направлении. Целью настоящего исследования являлась оценка остеогенного потенциала SHED-клеток до и после криоконсервации при использовании различных индукторов костной дифференцировки. материал и методы Получение культур SHED-клеток Культуру SHED-клеток человека выделяли из пульпы, экстрагированной из выпавших молочных зубов детей 7-9 лет (n = 4) после получения от родителей информированного согласия на использование биоматериала в научных исследованиях. Выпавший здоровый зуб без признаков воспаления помещали в стерильный флакон с транспортной средой: F-12 (ПанЭко, Россия), содержащей 500 мкг/л амикацина (Синтез, Россия), 10 Ед/мл гепарина натрия (Braun, Германия), и доставляли в лабораторию в термоконтейнере при 2-8°С. Зуб обрабатывали 0,05% раствором хлоргексидина биглюконата (Росбио, Россия). При помощи стерильных пульпоэкстракторов (КМИЗ, Россия) из зуба извлекали пульпу и промывали раствором Хэнкса с добавлением 0,5 г/л цефазолина (Синтез, Россия) (рис. 1А). Ткани пульпы измельчали ножницами и инкубировали в растворе коллаге-назы I типа (2 мг/мл; ПанЭко, Россия) 40 мин. при 37°С. Клеточную суспензию помещали в чашки Петри(1Чипс, Дания) и культивировали в ростовой среде ДМЕМ (ПанЭко, Россия), содержащей 10% ФТС (Gibco, США), 2 mM L-глутамина (ПанЭко, Россия), 100 мг/л амика-цина, при стандартных культуральных условиях (37°С, 5% СО2) до образования 70% монослоя. Смену ростовой среды производили каждые 3 сут. Рис. 1. Получение культуры SHED-клеток человека: А - экстракция тканей пульпы молочного зуба; Б - культура SHED-клеток человека 3 пассажа, фазовый контраст. Ув. Б х200 Иммунофенотипический анализ SHED-клеток SHED-клетки на 3-4 пассажах в состоянии 70-80% конфлуентного монослоя снимали с культурального пластика раствором Версе-на с добавлением 0,25% трипсина (ПанЭко, Россия), фиксировали 4% параформальдегидом (Merck, Германия), промывали фосфатно-солевым буфером и инкубировали с моноклональными антителами к поверхностным маркерам, конъюгированными с флуорохро-мами FITC, TRITC, APC:CD29 (bd 559883), CD34 (bd 555824), CD44 (bd 555478),CD45 (bd 555483), CD49b (bd 555498), CD73 (bd 550257), CD90 (bd555595) и HLA-DR (bd 559866)(BD Biosciences, США). Исследование выполняли на проточном цитофлуориметре-сортере BD FACSAria (BectonDickinson, США). Криоконсервация SHED-клеток SHED-клетки культивировали до достижения 70-80% конфлуентного монослоя и снимали с поверхности чашек Петри с помощью раствора Версена с добавлением 0,25% трипсина. Полученную клеточную суспензию центрифугировали при 1100 об/мин. 10 мин. Клеточный осадок ресуспензировали в ФТС с 10% криопротектора ДМСО (ПанЭко, Россия), разливали в криопробирки и замораживали до -80°С в режиме 1°С/мин.Затем образцы переносили в сосуды Дьюара с жидким азотом и хранили при -196°С. Остеогенная дифференцировка SHED-клеток SHED-клетки на 3-4 пассажах в состоянии 70-80% конфлуентного монослоя инкубировали 14 сут. в остеогенной среде: DMEM (Пан Эко, Россия) с 10% ЭТС, 0,1 мг/мл амикаци-на, 50 мг/л L-аскорбиновой кислоты (Sigma, Германия), 10 мМ/л p-глицерофосфата натрия (Sigma, Германия) и 100 нМ дексаме-тазона (KRKA, Словения) или 10 нМ 1а,25-дигидроксикальциферола (витамин D3) (Roshe, Швейцария). Среду заменяли каждые 3 сут. Для выявления очагов минерализации SHED-клетки фиксировали 70% этанолом (Ферейн, Россия) и обрабатывали 40 мМ водным раствором ализаринового красного S (pH = 4,1, ПанЭко, Россия). ПЦР-анализ в режиме реального времени Для оценки экспрессии генов применяли ПЦР-анализ в режиме реального времени с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green (Евроген, Россия). Общую РНК выделяли из клеток с помощью набора RNeasy Minikit (Qiagen, Германия) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя. Синтез кДНК на матрице РНК проводили согласно протоколу фирмы-производителя Fermentas (Европейский союз) с использованием обратной транскриптазы М-М^Уи олиго-бТ-праймеров. В ПЦР-реакции использовали специфические праймеры к генам маркеров остеогенной дифференцировки: остеокальцина, щелочной фосфатазы, RunX2 и BMP-2. Уровень мРНК анализируемых генов выравнивали по отношению к данным амплификации референсного гена GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа). Статистический анализ Статистическую обработку полученных данных выполняли с использованием специализированного программного обеспечения IBMSPSSv.23 (США). Графики и диаграммы были построены в программе Microsoft Excel 2016 (США). Для выявления межгрупповых различий применяли тест Холма-Шидака. результаты Для исследования остеогенного потенциала использовали SHED-клетки 3-4 пассажей (рис. 1Б). Для подтверждения иммунофенотипа полученных культур применяли проточную цитофлу-ориметрию. По результатам оценки среднестатистических данных нескольких культур было установлено, что в них до и после криоконсервации не наблюдается экспрессии гемопоэтических маркеров CD34, CD45 и HLA-DR, а маркеры CD29, CD44, CD49b, CD73, CD90 экспрессируются на высоком уровне, что соответствует профилю поверхностных антигенов ММСК [9]. С помощью ПЦР-анализа в режиме реального времени была исследована экспрессия остеогенных маркеров - остеокальцина, щелочной фосфатазы, BMP-2 и транскрипционного фактора RunX2 в SHED-клетках до (свежие) и после криоконсервации и хранения в течение 6-12 мес. (замороженные) (рис. 2). По результатам ПЦР-анализа было выявлено увеличение экспрессии всех исследуемых генов в течение 1 4 сут. дифференцировки в присутствии индуктора витамина D3 в культурах SHED-клеток как до, так и после криоконсервации. При этом экспрессия генов щелочной фосфатазы, BMP-2 и RunX2 на 14 сут. в культурах после криоконсервации была достоверно выше по сравнению с клетками до замораживания. Добавление в остеогенную среду витамина D3 приводило к более высокому уровню экспрессии генов остеокальцина и BMP2 по сравнению с использованием дексаметазона на 7 и 14 сут. дифференцировки как до, так и после криоконсервации. Статистически значимых различий в экспрессии гена щелочной фосфатазы при действии разных индукторов не было выявлено. Для гена транскрипционного фактора RunX2 был показан более высокий уровень экспрессии в присутствии витамина D3 по сравнению с дексаметазоном на 14 сут. дифференцировки до и после замораживания. На 7 сутки после замораживания, напротив, экспрессия RunX2 была выше при использовании дексаметазона. При окрашивании ализариновым красным очаги минерализации выявлялись после 14 сут. дифференцировки SHED-клеток в среде, содержащей витамин D3 как до, так и после криоконсервации (рис. 3А, Б), а использование дексаметазона не приводило к отложению кальцификатов на данном сроке(рис. 3В, Г). BMP-2 Runx2 >s 2 Остеокальцин >s 2 z j Ф H s о о z H о Рис. 2. ПЦР -анализ транскрипции генов щелочной фосфатазы, остеокальцина, BMP-2 и RunX2 при индукции остеогенной дифференцировки культур SHED-клеток до и после криоконсервации в присутствии разных индукторов (декс - дексаметазон, D3 - витамин D3). *, ** - различия между группами до и после криоконсервации в присутствии дексаметазона на 7 и 14 сут., соответственно, статистически значимы (р<0,05); #, ## - различия между группами до и после криоконсервации в присутствии витамина D3 на 7 и 14 сут., соответственно,статистически значимы (р < 0,05); •-■ - различия между группами при использовании разных индукторов на одинаковом сроке культивирования статистически значимы (р<0,05) Г • ; Э ■ ’ '' ,■■ ' ■ ■ ■ ' j1 yg» Б- ^(А’ч'Ум'к^' ”.i Ay/! 'А !>-у»'к!Л i ■ "г шШШ J.W.. 'V\ 'Ж -у a.W7 Мянй Рис. 3. SHED-клетки, культивированные в остеогенной среде в течение 14 сут.: А, В - клетки до криоконсервации; Б, Г - клетки после криоконсервации. A, Б - индукция дифференцировки витамином D3, B, Г - дексаметазоном. Красным окрашены очаги минерализации. Окраска: ализариновый красный. Ув. х100 Обсуждение ММСК, полученные из пульпы выпавших молочных зубов, являются перспективным материалом для применения в регенеративной медицине при разработке тканеинженерных конструкций костной и мягких тканей [10, 11]. Во-первых, метод их получения является неинвазивным. Во-вторых, SHED-клетки характеризуются высоким пролиферативным потенциалом и способностью дифференцироваться в клетки различных видов, включая остеоблас-ты/одонтобласты, адипоциты, нейральные клетки и др. [3]. В работах по изучению свойств SHED-клеток при криоконсервации целого зуба было установлено, что их выживаемость, пролиферативный и дифференцировочный потенциалы зависят от длительности периода консервации. При этом удовлетворительные результаты могут быть получены только при хранении в течение всего несколько месяцев [4-6]. Замораживание непосредственно пульпы позволяет сохранить свойства содержащихся в ней клеток в течение более 2 лет, и выделенные по истечении этого срока SHED-клетки сохраняют все свойства ММСК и регенеративную способность in vivo [7]. Замораживание культур SHED-клеток, полученных из пульпы выпавшего зуба, позволяет охарактеризовать клеточный материал, исключить контаминацию и порционно банкировать клетки для дальнейшего использования. При таком подходе к хранению клетки полностью сохраняют свою пролиферативную активность [8]. Результаты нашей работы подтверждают, что криоконсервация также не снижает остеогенный потенциал культур SHED-клеток:инкубация в остеогенной среде клеток до и после замораживания приводила к повышению уровня экспрессии маркеров остеогенной дифференцировки - щелочной фосфатазы, остеокальцина, BMP-2 и RunX2- и минерализации внеклеточного матрикса. При этом после криоконсервации экспрессия генов щелочной фосфатазы, BMP-2 и RunX2 на 14 сут. в культурах была даже выше, чем до замораживания. Выбор оптимального индуктора дифференцировки - ключевой момент в реализации остеогенного потенциала клеточной культуры, определяющий терапевтическую эффективность ее клинического применения. Ранее было показано, что дексаметазон - синтетический глюкокортикоид, часто используемый в работах для индукции остеогенной дифференцировки, оказывает индуцирующее влияние на остеопрогениторные клетки костного мозга [12]. Однако действие этого препарата на ММСК из других источников - жировой ткани, пульпы коренных зубов,значительно менее эффективно по сравнению с использованием витамина D3 [13-15]. Популяции клеток из пульпы молочных и коренных зубов различаются по своим характеристикам, поэтому для каждого источника требуется отдельное исследование [16]. Нами было показано, что в культурах SHED-клеток экспрессия генов остеокальцина и BMP-2 на 7 и 14 сут.достовер-но превышала экспрессию этих генов в среде с дексаметазоном. Такой же результат был получен и для гена RunX2 на максимальном срокедифференцировки (14 сут.). Кроме того, только в среде, содержащей витамин D3, наблюдалось формирование минеральных отложений. Эти данные подтверждают, что витамин D3 является более эффективным индуктором остеогенной дифференцировки SHED-клеток по сравнению с дексаметазоном. По результатам исследования можно сделать следующие выводы. Витамин D3 является более эффективным индуктором остеогенной дифференцировки SHED-клеток, чем дексаметазон. Культуры SHED-клеток сохраняют свой остеогенный потенциал после длительной криоконсервации, что может служить предпосылкой для банкирования клеток, полученных из пульпы выпавших молочных зубов детей, с целью дальнейшего использования для аутогенных или аллогенных трансплантаций.

About the authors

T. B Bukharova

Research Centre for Medical Genetics.

Moscow, Russia.

G. E Leonov

Research Centre for Medical Genetics.

Moscow, Russia.

E. V Galitsyna

Research Centre for Medical Genetics.

Moscow, Russia.

A. V Vasilyev

Peoples' Friendship University of Russia; Research Centre for Medical Genetics; Central Research Institute of Dental and Maxillofacial Surgery.

Moscow, Russia.

I. V Vakhrushev

Institute of Biomedical Chemistry.

Moscow, Russia.

E. B Vikhrova

Research Centre for Medical Genetics.

Moscow, Russia.

O. V Makhnach

Research Centre for Medical Genetics.

Moscow, Russia.

D. V Goldstein

Research Centre for Medical Genetics.

Moscow, Russia.

References

Supplementary files