Hepato-specific small-dispersioned matrix as the important component of implanted cell-engineering designs for an auxiliary liver

Full Text

Введение По современным представлениям долгосрочная коррекция тяжёлых нарушений структуры и функции печени в организме при печёночной недостаточности может быть обеспечена с помощью трансплантируемых в печень клеточно-инженерных конструкций, созданных на основе принципов тканевой инженерии [1]. e-mail: allanik64@yandex.ru Тканевая инженерия печени предназначена для создания in situ с помощью тканеспецифических (гепатоспецифических) матриксов условия для формирования de novo гепатоподобных структур (клеточно-матриксных ассоциатов), длительное функционирование и интеграция которых с печенью реципиента должны происходить за счёт гепатоспе-цифических регуляторных сигналов, поступающих Гены & Клетки Том XI, № 1, 2016 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 55 к ним из нативного матрикса и из сохранившейся ткани печени реципиента Длительное функционирование вновь образованных тканеподобных конструкций в печени должно, в свою очередь, создавать условия для восстановительной реконструкции всей повреждённой печени путём перепрограммирования в ней процессов регенерации с фиброзирующего типа на дефибро-зирующий. Однако трансплантируемых длительно функционирующих нативных гепатоспецифических клеточно-инженерных конструкций пока нет ни в нашей стране, ни за рубежом Основным элементом для создания таких клеточно-инженерных эквивалентов печёночной ткани должен стать нативный гепатоспецифический матрикс Понимание того, что только тканеспецифический матрикс может быть оптимальным субстратом для заселения его специализированными клетками, способными к пролиферации и межклеточному взаимодействию, подтверждают многочисленные публикации последних лет по разработке технологии децеллюляризации паренхиматозных органов: почек [2], сердца [3, 4], легких [5], печени [6-8]. Полагают, что децеллюляризированные матриксы сохраняют тканевую специфичность соответствующих органов за счёт внеклеточных нативных ма-триксных белков, которые интегративно содержат в своем составе остатки тканевых структур (гликопротеиды, структурные белки межклеточных контактов и пептидные последовательности для адгезии клеток) и позволяют оптимизировать условия для пролонгированной жизнедеятельности прикрепившихся клеток без дополнительной подготовки (модифицирования) их поверхности Установлено, что в структуре децеллюляризи-рованной печени (ДЦП) сохраняется до 19% VEGF, 13% IGF-1, 19% HGF и 20% bFGF по сравнению с их содержанием в нативной печени [9] Между тем, проблема рецеллюляризации (ревита-лизации) отмытого от клеток целого децеллюляризи-рованого органа, в частности, печени путём длительного (до 18 ч. ) перфузионного реинженеринга через сосудистое русло в настоящее время не решена из-за сложности процесса рецеллюляризации [10]. Клетки, используемые для рецеллюляризации, должны не только пройти сквозь толщу сосудистой стенки и расположиться на её наружной стороне, но и сохранить жизнеспособность, способность обеспечивать регуляцию межклеточных взаимодействий, а также участие в формировании адекватной биологической функции вновь реконструируемой ткани печени Таким образом, для создания имплантируемых клеточно-инженерных конструкций, обеспечивающих пролонгированную коррекцию восстановительных процессов в повреждённых органах (печени), необходима разработка доступного, дешевого и универсального способа получения нативных матриксов с тканеспецифическими свойствами, которые могли бы быть использованы для простого и быстрого заселения их соответствующими донорскими клетками Цель работы - показать, что мелкодисперсный матрикс из децеллюляризированной печени, полученный по разработанной нами технологии, био-совместим, сохраняет гепатотропную активность, и, следовательно, пригоден для изготовления клеточноинженерных конструкций вспомогательной печени Материал и методы Разработка технологии изготовления мелкодисперсного тканеспецифического матрикса печени проводилась на крысах-самцах породы «Вистар» (n = 40) массой 200±20 г. Все манипуляции с лабораторными животными выполнялись в соответствии с правилами «Европейской конвенции защиты позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях». Техника децеллюляризации печени Медикаментозную защиту микроциркуляторного русла печени и профилактику внутрисосудистой агрегации форменных элементов крови проводили перед эксплантацией (изъятием) печени за 40-100 мин. до начала перфузионной отмывки её от крови путём внутримышечного введения донору дезагрегантов: трентала (Aventis, Россия) в дозе 5-10 мг/кг массы донора и гепарина (Московский эндокринный завод, Россия) в дозе 500 МЕ Далее под эфирным (ингаляционным) наркозом канюлировали воротную вену и осуществляли in situ перфузионную отмывку донорской печени от крови физиологическим раствором, забуференным фосфатами (Invitrogen/ Gibco, Великобритания): 138 мМ NaCl, 2,67 мМ KCl, 1,47 мМ KH2PO4, 8,1 мМ Na2HPO4, pH 7,4 (PBS) и содержащим гепарин в дозе 50 МЕ/мл. Длительность отмывки печени от крови in situ составляла 5-7 мин. Перфузию выполняли по воротной вене с объёмной скоростью перфузии 25-27 мл/мин. 100-150 мл перфузионного раствора. Затем осуществляли эксплантацию (изъятие) донорской печени Децеллюляризацию изолированной и отмытой от крови печени проводили ex vivo перфузией растворами детергентов с постепенно повышающейся концентрацией в течение 48-72 ч. через воротную вену с объёмной скоростью перфузии 30-70 мл/мин в рециркуляторном режиме, используя последовательно 3 раствора: a) 150 мл РВS, содержащего 1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, США) и 0,1% додецилсульфата натрия (SDS, Sigma-Aldrich, США), применяли в течение 1,5 ч. , заменяли на свежий раствор того же состава (100 мл) и продолжали перфузию не менее 5 ч. ; b) 150 мл РВS, содержащего 2% Triton X-100 и 0,1% SDS, применяли в течение 12 ч. , заменяли на свежий раствор (100 мл) и продолжали перфузию в течение 4 ч ; c) 150 мл РВS, содержащего 3% Triton Х-100 и 0,1% SDS, применяли в течение 12 ч. , затем заменяли на свежий раствор (100 мл) и продолжали перфузию не менее 3 ч Децеллюляризированную печень отмывали от детергентов перфузией 150-200 мл PBS, с трёх-, четырехкратной заменой раствора на свежий через каждый час перфузии в рециркуляторном режиме не менее 12 ч На рис 1 представлен внешний вид печени до и после её децеллюляризации. Гены & Клетки Том XI, № 1, 2016 56 оригинальные исследования Рис. 1. Внешний вид печени до (А) и после (Б) децеллюляризации Технология изготовления мелкодисперсного матрикса из ДЦП Разработанная нами технология изготовления мелкодисперсного матрикса [11] включала первоначальное пропитывание децеллюляризированного органа раствором криопротектора Сосудистое русло децеллюляризированной печени (матрикс) перфузи-ровали криопротекторным раствором PBS с pH 7,4, содержащим 1% сывороточного альбумина (Sigma, США) и 10-15% глицерина (Sigma, США) или 10-15% диметилсульфоксида (DMSO, Sigma, США) Объём используемого криопротекторного раствора был равен двойному объёму сосудистого русла децеллюляризированного органа Для печени крысы объём раствора криопротектора составлял 10 мл, объёмная скорость перфузии - 150 мл/час. После насыщения органа криопротектором децеллюляризированную печень измельчали с помощью скальпеля и ножниц до образования частиц размером от 0,5 до 4 мм. Полученные фрагменты матрикса разделяли на порции массой 5-10 г и замораживали, погружая в жидкий азот (t = -196°С) на 10 мин. Замороженные фрагменты децеллюляризированного матрикса быстро механически измельчали в фарфоровой ступке до порошкообразной консистенции на льду Для удаления из полученной массы частиц размером более 600 мкм использовали сито с квадратными ячейками размером 200x200 мкм (40 mesh). Затем отделяли частицы размером менее 200 мкм, продавливая материал через сито с размером ячеек 130x130 мкм (60 mesh) Полученную мелкодисперсную фракцию размораживали ресуспендированием (погружением) в 30-70 мл раствора PBS при комнатной температуре в течение 3-5 мин Общая масса матрикса с размером частиц 200-600 мкм, выделенных из одной печени крысы, составляла ~ 0,8 г. Для сохранения нативных свойств мелкоди-сперстного матрикса проводили лиофилизацию: матрикс массой до 10 г замораживали в сублимационной камере в течение 8 ч при температуре -35°С, затем высушивали в вакууме под давлением 2-10 Па и температуре нагрева не выше 35°С в течение 2 сут Образцы матрикса стерилизовали у-облучением в дозе 15 кГр. Стерильный децел-люляризированный порошкообразный матрикс сохраняли до 6 мес при t = 4-6°С для дальнейшей рецеллюляризации клетками. На рис 2 представлен мелкодисперсный матрикс печени после лиофилизации в сублимационной камере, подготовленный к рецеллюляризации. Размер пор децеллюляризованного нативного матрикса печени крысы, изготовленного в виде сухого порошка, варьировал от 50 до 100 мкм. Суммарная пористость полученного матрикса не превышала 80% Указанные характеристики полученного нами мелкодисперстного децеллюляризированного нативного матрикса печени признаны наиболее адекватными для культивирования гепатоцитов в биоинже-нерных конструкциях [12]. Методы изучения свойств мелкодисперсных нативных матриксов из ДЦП Для доказательства сохранения гепатотропных свойств мелкодисперсных матриксов, полученных из децеллюляризированной печени, было проведено заселение матриксов четырьмя различными типами клеток: аллогенными клетками печени, клетками линии человеческой гепатомы - НepG2, аллогенными мультипотентными мезенхимальными стромальны-ми клетками костного мозга (ММСК КМ) и алло-генными клетками почечного эпителия Оценку ге-патотропных свойств матриксов осуществляли путём сравнения адгезии и жизнеспособности указанных типов клеток при культивировании их на порошкообразных (мелкодисперсных) матриксах, изготовленных из ДЦП. В качестве контролей использовали Цитодекс-3 (контроль универсального матрикса), представляющий собой мелкодисперсный полимер - серфадекс, покрытый коллагеном (Farmacia, Швеция), и культуральный пластик (Corning Costar, США) Рис. 2. Мелкодисперсный лиофилизированный матрикс, изготовленный из децеллюляризированной печени Гены & клетки Том XI, № 1, 2016 оригинальные исследования 57 Методы получения клеток и заселения ими матриксов Аллогенные клетки печени получали из отмытой от крови печени крыс неперфузионным методом, который включал механическое измельчение печени на холоде с последующей обработкой полученных фрагментов 0,05% раствором коллагеназы IV типа (Invitrogen/Gibco Великобритания) [13]. Суммарный выход клеток печени из целого органа составлял 2,5-4,0х108. Клеточная суспензия содержала гепатоциты и непаренхиматозные клетки печени, которые выявляли методом световой микроскопии Разделение паренхиматозных и непаренхиматозных клеток не выполняли После отмывки PBS суспензию выделенных клеток печени центрифугировали, ресуспензировали в питательной среде DMEM/F-12 (ПанЭко, Россия), содержащей 10% FCS (Invitrogen/Gibco, Великобритания), 50 мкг/мл гентамицина (Invitrogen/Gibco, Великобритания) и специфические добавки (перечень добавок приведен ниже), а затем использовали для культивирования на исследуемых матриксах. Жизнеспособность выделенных клеток печени по окрашиванию трипановым синим достигала 72-80%. Клетки почечного эпителия получали из почек эмбрионов крыс также неперфузионным методом путём механического измельчения почки на холоде с последующей обработкой полученных фрагментов 0,25% раствором трипсина (ПанЭко, Россия) [14]. ММСК из костного мозга крыс выделяли по общепринятой методике [15]. Клетки HepG2 были предоставлены Институтом канцерогенеза (Москва). Заселение клетками частиц матрикса из ДЦП и матрикса Цитодекс-3 (размеры частиц 250-350 мкм) проводили по отработанной нами методике [13]: 250 мкл влажного децеллюляризированного матрикса, содержащего 3,5-3,8х1012 частиц, смешивали с 1мл суспензии одного из четырех видов клеток (1х106 кл/мл), помещали в стерильные чашки Петри (d = 35мм, Greiner, Германия) и заливали питательной средой DMEM/F-12, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 50 мкг/мл гентамици-на и специфические добавки Общий объём суспензии составлял 3,0 мл При культивирования разных видов клеток использовали следующие добавки: - клетки печени: 20 мкг/мл EGF (Epidermal growth factor, Invitrogen/Gibco, Великобритания), 20 mM HEPES (Sigma, США), 40 мкг/мл HGF (Hepatocyte growth factor, ProSpec, Израиль), 0,08 МЕ/мл инсулин (Хумулин NPH, Швейцария), 10-9 M дексаметазон (Виал, Россия), 1 mM этаноламин (Sigma, США) - клетки HepG2: 20 мМ Hepes; - клетки почечного эпителия: 20 мкг/мл EGF, 20 mM HEPES, 0,08 МЕ/мл инсулин, 10-9 M декса-метазон, 1 mM этаноламин; - ММСК костного мозга: 20 нг/мл bFGF (Basic fibroblast growth factor, ProSpec, Израиль), 0,08 МЕ/мл инсулин, 10-9 M дексаметазон, 1 mM этаноламин. Клетки на матриксе из ДЦП и Цитодексе-3 (5 повторов для каждого типа клеток) выдерживали в СО2-инкубаторе при стандартных условиях в течение 5 сут без замены питательной среды, после чего изучали их адгезию и жизнеспособность Кроме того, перечисленные виды клеток без матриксов высевали на культуральный пластик и инкубировали в тех же условиях (контроль адгезии). Методы исследования Функциональную оценку гепатотропной активности мелкодисперсных матриксов проводили методом Mossman (МТТ-тест) [16]. МТТ-тест основан на колориметрическом определении активности митохондриального дыхания клеток, благодаря способности дегидрогеназ живых клеток восстанавливать неокрашенную форму 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5дифенилтетразолиум бромида (МТТ-реагент) с образованием кристаллов формазана фиолетового цвета, растворимых в ДМСО МТТ-тест проводили после 5 сут раздельной инкубации четырёх видов клеток в одинаковой концентрации на исследуемом и контрольном матриксах Для точной оценки количества клеток, прикрепившихся к гранулам матрикса, содержимое каждой чашки аккуратно ресуспензировали, центрифугировали при 1000 об/мин. в течение 5 мин. , к осадку добавляли 0,8 мл питательной среды и переносили в 24-луночный планшет, исключая, таким образом, из измерения клетки, прикрепившиеся к пластику чашек. В каждую лунку добавляли по 200 мкл МТТ-реагента и инкубировали в течение 4 ч. при 37°С, что приводило к образованию нерастворимых в воде фиолетовых кристаллов. Далее среду удаляли, вносили по 250 мкл ДМСО для растворения кристаллов, и полученный окрашенный раствор переносили в 96-лу-ночный планшет Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре (Picon incorporated company, Униплан, Россия) при длине волны 540 нм. Для гистологического исследования образцы матрикса из ДЦП фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине, дегидратировали и заключали в парафин по стандартной методике. Срезы из образцов фиксированных тканей окрашивали гематоксилином и эозином, для выявления соеди-нительно-тканного остова внеклеточного матрикса - по Маллори. Отдельно готовили срезы из образцов фиксированных тканей для фазово-контрастной микроскопии на микроскопе Сэг1 Zeiss Axiovert 25 (Jena, Германия) с камерой Axio Cam HRC (Carl Zeiss, Германия) Для сканирующей электронной микроскопии образцы матрикса из ДЦП фиксировали в 2,5% растворе глютаральдегида в 0,1 М какодилатном буфере (Merck, Германия) в течение 2 ч. После промывки образцы обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации, высушивали в течение ночи в термостате и напыляли золотом толщиной 20 нм в атмосфере аргона при ионном токе 6 мА и давлении 0,1 мм рт. ст. с использованием прибора Ion Coater IB-3 (Eiko Engineering Muto, Япония). Исследования проводили на сканирующем электронном микроскопе Camscan-S2 (Cambridge Instruments, Великобритания) Разрешение микроскопа 10 нм, рабочее напряжение 20 кВ. Изображения получали с помощью программного обеспечения Merco Capture (SMA). Статистический анализ Статистическую обработку количественных результатов МТТ-теста осуществляли методами вариационной статистики на компьютере с использованием специального статистического пакета Biostat. Достоверность различий между сравниваемыми группами оценивали по t-критерию Стьюдента; Гены & клетки Том XI, № 1, 2016 58 оригинальные исследования различия считали статистически значимыми при p<0,05 (статистический пакет, рекомендованный ВОЗ Epiinfo 5 0) Результаты и обсуждение Децеллюляризованные мелкодисперсные матриксы не должны содержать клеток, но должны сохранять тканеспецифические свойства В процессе проведённой нами децеллюляризации ткань печени утрачивала присущий ей тёмно-красный цвет (рис. 1А) и приобретала молочно-белую окраску (рис. 1Б), которая характерна для всех децеллюля-ризированных тканей [17]. Окраска гематоксилином и эозином срезов ин-тактной (рис. 3А) и децеллюляризированной ткани печени (рис 3Б), позволила путем сравнительного анализа установить сохранность пространственной микроструктуры этой ткани после децеллюляриза-ции и отсутствие в ней клеток Из рис 3Б видно также, что волокна внеклеточного матрикса местами содержат более окрашенные эозинофильные (белковые) включения, которые, вероятно, и должны предопределять наличие гепатотропных свойств изготовленного нативного матрикса Исследование срезов ткани ДЦП методом фазово-контрастной микроскопии показало, что внеклеточный матрикс, состоящий преимущественно из волокон коллагена, после децеллюляризации сохраняет свой структурный остов (рис 3Б) С помощью метода сканирующей электронной микроскопии удалось также обнаружить, что после децеллюляризации печени на волокнах внеклеточного матрикса присутствуют глыбчатые образования, которые, по-видимому, являются именно теми белковыми молекулами, которые, как мы полагаем, должны предопределять специфические свойства нативных мелкодисперсных матриксов (рис 4) Между тем, выявление целостности структурного остова децеллюляризированных тканей и скопление конгломератов белковых молекул на волокнистых структурах матрикса ещё не доказывало сохранности адгезивных свойств матриксов и самое главное сохранности их тканеспецифических свойств Культивирование клеток НepG2, клеток печени, почек и ММСК костного мозга на 3 различных типах матриксов - культуральном пластике, Цитодексе-3 (контроль матрикса) и мелкодисперсных фрагментах ДЦП - показало, что клетки различных фенотипов прикреплялись ко всем используемым матриксам после 5 сут. культивирования (рис. 5-7). Такой результат культивирования клеток на матриксах позволяет заключить, что мелкодисперсные матриксы из ДЦП после процедуры децеллюляризации не утрачивают свои адгезивные свойства Однако было отмечено, что из-за большей кривизны поверхности матрикса из ДЦП по сравнению с Цитодексом-3 клетки на них не распластываются и, таким образом, сохраняют свою полярность, необходимую для выполнения специализированных функций. Рис. 3. Микроструктура ткани печени крысы до (А) и после (Б и В) децеллюляризации Окраска: А, Б - гематоксилин и эозин; В - фазовый контраст. Ув. : А x100; Б, В x200 Гены & клетки Том XI, № 1, 2016 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 59 Рис. 5. Адгезия клеток линии HepG2 к различным типам матриксов: А - к культуральному пластику; Б - к гранулам Цитодекса-3; В - к фрагментам ДЦП; стрелками обозначены прикрепившиеся не распластанные клетки. А - микроскопия по Номарскому; Б - прямая просвечивающая микроскопия с окрашиванием трипановым синим; В - прямая просвечивающая микроскопия. Ув.х200 Рис. 6. Адгезия ММСК костного мозга к различным типам матриксов: А - к культуральному пластику, Б - к гранулам Цитодекса-3, В - к фрагментам ДЦП; стрелками обозначены прикрепившиеся не распластанные клетки. А, Б - микроскопия по Номарскому; В - прямая просвечивающая микроскопия. Ув.: А, Б х200; В х100 Рис. 7. Адгезия клеток печени крысы к различным типам матриксов: А - к культуральному пластику; Б - к гранулам Цитодекса-3; В - к фрагментам ДЦП; стрелками обозначены прикрепившиеся не распластанные клетки. А - фазово-контрастная микроскопия, Б - микроскопия по Номарскому, В - прямая просвечивающая микроскопия с окрашиванием трипановым синим. Ув.: А, Б х200; В х100 Для выявления сохранности гепатотропных свойств матрикса из ДЦП крысы была проведена количественная оценка результатов МТТ-теста на 5 сут. раздельного культивирования четырёх видов клеток: клеток линии НepG2 клеток печени, клеток почечного эпителия и ММСК КМ от аллогенных доноров, засеянных в одинаковой дозе (1х106 клеток) на матрикс из ДЦП и Цитодекс-3 (рис 8) Гены & Клетки Том XI, № 1, 2016 60 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 I I Без клеток HepG2 Почечный ММСК КМ Клетки Рис. 8. Результаты МТТ-теста после раздельного культивирования различных видов клеток (HepG2, почечный эпителий, ММСК костного мозга, клетки печени) на матриксе Цитодекс-3 (1) и на фрагментах мелкодисперсного матрикса из ДЦП (2) в течение 5 сут. ; * - различия статистически значимы при сравнении с результатами культивирования печеночных клеток на матриксе Цитодекс-3, р<0,05 На диаграмме видно, что частицы матрикса из ДЦП, так же, как и частицы Цитодекса-3, биосов-местимы и адгезивны для различных видов клеток. Однако матрикс из ДЦП в отличие от Цитодекса-3 проявлял также свою тканевую принадлежность, которая становилась очевидной при культивировании на них гепатоспецифических клеток (HepG2 и клеток аллогенной печени), жизнеспособность которых при адгезии на матриксе из ДЦП значительно выше, чем у ММСК костного мозга и клеток почечного эпителия. Мы полагаем, что полученные результаты нельзя объяснить только тем, что мелкодисперсный матрикс из ДЦП сохраняет основные типы молекул нативного внеклеточного матрикса, такие как фибриллообразующие белки - коллаген i и iii типов, эластин и гликопротеины - фибронектин, ламинин и др. [4], которые обеспечивают прочность и эла стичность тканей, но и тем, что мелкодисперсный матрикс из ДЦП сохраняет свою гепатоспецифиче-скую структуру, которая индуцирует динамическую взаимосвязь (тропизм) матрикса именно с клетками печени Кроме того, можно предположить, что имплантация в поврежденную печень матриксов из ДЦП с адгезированными на них клетками печени будет создавать условия для индукции синтеза и обновления привнесенными жизнеспособными ге-патоцитарными клетками гепатотропных матриксных белков [18], которые будут способствовать усилению клеточно-матриксного взаимодействия и интеграции имплантированных клеточно-матриксных ассоциатов тканью печени реципиента при трансплантации их в поврежденную печень. Заключение Результаты проведённого нами исследования свидетельствуют о том, что мелкодисперсный матрикс из ДЦП, изготовленный по разработанной нами технологии, сохраняет гепатотропность и выраженную адгезивность для клеток, особенно клеток гепатоцитарного фенотипа. Эти результаты позволяют предположить, что мелкодисперсный матрикс из ДЦП может служить в качестве предпочтительной основы для изготовления имплантируемых и длительно функционирующих клеточно-инженерных конструкций вспомогательной печени, которые могут быть использованы при коррекции и лечении печёночной недостаточности Благодарности Данная работа проводилась при финансовой поддержке Минздрава России в рамках государственных заданий по темам «Разработка и экспериментальное исследование тканеспецифических матриксов для биомедицинских клеточных продуктов» (№ гос. регистрации 115102010014) и «Создание и экспериментальное исследование тканеинженерной конструкции печени с использованием аппаратного комплекса «биостанция-биореактор» (№ гос. регистрации 115102010016).

About the authors

N. A Onischenko

Academican V.I. Shumakov Federal Research Center of Transplantology and Artificial Organs

Email: allanik64@yandex.ru

M. E Krasheninnikov

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University

M. Y Shagidulin

Academican V.I. Shumakov Federal Research Center of Transplantology and Artificial Organs; I.M. Sechenov First Moscow State Medical University

M. M Bodrova

M.V. Lomonosov Moscow State University

V. I Sevastjanov

Academican V.I. Shumakov Federal Research Center of Transplantology and Artificial Organs

S. V Gautier

Academican V.I. Shumakov Federal Research Center of Transplantology and Artificial Organs; I.M. Sechenov First Moscow State Medical University

References

Supplementary files