The effects of co-culture duration of cord blood cells with adipose tissue-derived stromal cells on hematopoietic precursors> amplification

Full Text

Введение Пуповинная кровь (ПК) в настоящее время рассматривается как полноценный источник гемопоэти-ческих стволовых и прогениторных клеток (ГСПК). e-mail: andreeva_er@mail.ru Важным преимуществом ПК, по сравнению с костным мозгом и мобилизованной периферической кровью, является возможность неинвазивного получения образцов в достаточно большом количестве и Гены & Клетки Том XI, № 1, 2016 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 49 использования клеток с меньшим соответствием по антигенам гистосовместимости с реципиентом (3-4 вместо 6 для костного мозга), что обеспечивает достаточную безопасность для реципиента в связи с более редкими случаями возникновения реакции «трансплантат против хозяина» [1-3]. ГСПК ПК успешно используются в детской онкогематологии и других областях медицины [4, 5] Однако применение этих клеток для лечения взрослых пациентов ограничено недостаточным количеством ГСПК в одном образце ПК [6] Решение данной проблемы путем объединения нескольких образцов ПК сопряжено с дополнительными рисками (антигенная несовместимость, контаминация патогенами и др ) Альтернативным вариантом, который привлекает все большее внимание исследователей, является использование ex vivo протоколов для увеличения количества ГСПК [7-9]. В связи с этим, подбор оптимальных условий получения ГСПК из ПК ex vivo является приоритетным направлением в этой области исследований Судьба ГСПК ПК при культивировании зависит от ряда факторов, модификация которых может обеспечить их эффективную амплификацию К таким модуляторам относятся «коктейли» экзогенных ге-мопоэтических цитокинов, подслой из стромальных клеток и предварительно выделенные с помощью иммуномагнитной сепарации примитивные CD34+ или CD133+ гемопоэтические предшественники [1, 4, 7, 9]. В настоящее время для ex vivo экспансии ГСПК ПК чаще всего используется обогащенная популяция CD34+-клеток [7, 10, 11], которые далее культивируются в монокультуре или в присутствии подслоя стромальных клеток. Обязательным компонентом среды культивирования являются экзогенные цитокины, индуцирующие гемопоэз [3]. Однако использование для экспансии только CD34+-клеток может искусственно обеднить спектр ГСПК, так как известно, что экспрессия этого антигена транзитор-на [12]. Ранее нами был предложен функциональный подход к обогащению популяции ГСПК ПК за счет их адгезии к мультипотентным мезенхимальным стромальным клеткам (МСК) из жировой ткани и последующей экспансии прикрепившихся малодифференцированных клеток [13]. Цель настоящей работы - оптимизация предложенного протокола Для этого была проанализирована динамика адгезии клеток ПК к подслою стромальных клеток, охарактеризован фенотип и функциональная активность полученной после амплификации суспензионной популяции ГСПК ПК. Материал и методы Выделение мононуклеарной фракции ПК Образцы ПК получали от обследованных здоровых рожениц после подписания добровольного информированного согласия в отделениях Научного центра акушерства, гинекологии и перинатоло-гии им акад В И Кулакова После седиментации эритроцитов и удаления избытка плазмы фракцию ядросодержащих клеток ресуспендировали в аутогенной плазме с добавлением 10% диметилсуль-фоксида (Sigma, США) и 1% Декстрана-40 (Sigma, США), расфасовывали в криопробирки и подвергали программному замораживанию (CryoMed 7451, Thermo Fisher Scientific, США) до конечной температуры -90°С в соответствии со Стандартными опе рационными процедурами Банка стволовых клеток [14]. В день эксперимента клетки размораживали на водяной бане при +37°С и отмывали от криопротектора в среде культивирования a-MEM (Gibco, США). После оценки жизнеспособности по окраске трипановым синим, концентрацию клеток доводили до 1,5-2,5х106 кл/мл и использовали в течение 30 мин Анализ фенотипа размороженных монону-клеарных клеток (МНК) ПК проводили по методике, описанной ниже Выделение и культивирование МСК Образцы жировой ткани после липосакции были получены в рамках Договора о научном сотрудничестве с многопрофильной клиникой «Союз» Все пациенты подписывали добровольное информированное согласие перед выполнением процедуры МСК выделяли из стромально-васкулярной фракции жировой ткани по стандартной методике [15] в модификации, описанной нами ранее [16], и культивировали постоянно при 5% О2 в мультигазовом инкубаторе (Sanyo, Япония) в среде a-MEM (Gibco, США) с добавлением 10% инактивированной фетальной бычьей сыворотки (Hyclone, США), 100 ЕД/мл пенициллина и 100 ЕД/мл стрептомицина (Панэко, Россия) По достижении 70-80% конфлу-ентности монослоя клетки пересевали. Для экспериментов использовали МСК 2-4 пассажей Совместное культивирование МСК и МНК ПК Перед началом экспериментов МСК обрабатывали митомицином в течение 24 ч , затем рассева-ли с плотностью 70-80% монослоя в чашки Петри диаметром 60 мм (Corning, США) и культивировали 24 ч. до начала эксперимента, схема которого представлена на рис 1 Эксперимент состоял из двух этапов. На первом этапе получали и охарактеризовывали популяцию ГСПК, адгезированных из исходной фракции МНК ПК В чашки Петри с МСК, обработанными мито-мицином, добавляли суспензию ядросодержащих клеток ПК (2х106 кл/мл) и помещали в СО2 инкубатор (20% О2). Через определенные интервалы времени (1, 3, 24, 72 ч. ) все неприкрепившиеся клетки удаляли Часть образцов использовали для характеристики прикрепившихся клеток Количество и жизнеспособность адгезированных ГСПК определяли после одновременного окрашивания флуорес-цеин-диацетатом (FDA, Sigma, США) и йодидом про-пидия (Pi, invitrogen, США) в конечной концентрации 0,05 мкг/мл и 300 мкг/мл соответственно. Жизнеспособность клеток анализировали на флуоресцентном микроскопе Nikon Eclipse TiU (Nikon, Япония): живые и мертвые клетки различали по наличию зеленой (FDA, X = 470/515 нм) и красной 1 возб./исп. ' “ (Pi, Хвоз6 /исп = 535/590 нм) флуоресценций. В каждой культуре анализировали не менее 5 случайно выбранных полей зрения, площадью 0,14 мм2 каждое Для получения количественных данных по жизнеспособности и числу адгезированных ГСПК дальнейшую обработку изображений выполняли в программе NiS-elements (Nikon, Япония). Феноти-пирование проводили после трипсинизации (0,05% трипсин-ЭДТА, Gibco, США) адгезированных ГСПК по методике, описанной ниже Гены & Клетки Том XI, № 1, 2016 50 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Рис. 1. Анализ временной динамики адгезии ядросодержащих клеток ПК и последующей амплификации ГСПК ПК на подслое из МСК жировой ткани На втором этапе эксперимента оценивали амплификацию и функциональную активность ГСПК. В оставшиеся образцы добавляли свежую среду и продолжали инкубировать в течение 72 ч. , в результате чего над монослоем МСК с прикрепившимися к нему на первом этапе ГСПК появлялись флотирующие клетки. Эта популяция могла формироваться как за счет пролиферации прикрепившихся ГСПК и их последующего открепления, так и за счет открепления исходных ГСПК. В суспензии вновь образовавшихся ГСПК анализировали общее число ГСПК, содержание КОЕ и CD34+-клеток. Иммунофенотипирование ГСПК Иммунофенотипирование ГПСК проводили в образцах исходных МНК ПК, ГСПК, адгезирован-ных через 72 ч. на первом этапе эксперимента и в популяции клеток, полученных при дальнейшем культивировании прикрепленных клеток на втором этапе эксперимента, с помощью проточной цитометрии (Accuri C6, Becton Dickinson, США). Наиболее N Ко <0 I» < ' I СО 00 О о «= Q6-UL 0,6% ■ Q6-UR 15,7% ■ / ' 96fi: 41 ' ■' ■ ■ ■' І • ■ -V ^ ■ L ". " Q6-LL Л 22,9% ' ■fäs ^ * ■ЇЗУ: < ■ ' Q6-LR 60,7% широко используемым маркером для недифференцированных гемопоэтических клеток является антиген CD34 [17], кроме того, эти клетки умеренно экспрессируют общий лейкоцитарный маркер CD45 (CD45dim). На основе этих двух маркеров разработан протокол фенотипирования ГСПК методом проточной цитометрии iSHAGE (international Society of Hematotherapy and Graft engineering) для оценки количества CD34+-клеток в клинике [18]. Мы применили этот подход для идентификации ГСПК. В работе использовали меченные флуорохромами антитела к СD45 и СD34 (Bd Pharmingen, США) в концентрации, рекомендованной изготовителем На рис. 2 приведена репрезентативная плотдиаграмма распределения клеток, несущих CD45-PerCP/CD34-APC антигены. Выявление колониеобразующих единиц {КОЕ] Наличие КОЕ оценивали по способности клеток образовывать колонии в полужидкой среде, содержащей коктейль цитокинов и факторов роста ГСПК (MethoCult H4034, Stemcell Technologies, Канада). Суспензию клеток вносили в среду из расчета 50х103 на чашку Петри диаметром 35 мм и культивировали в соответствии с инструкцией производителя. Количество и состав колоний оценивали через 14 сут Общее количество КОЕ определяли по формуле: N^p х общее количество ГСПК/(50х103). 7,2 Рис. 2. Репрезентативная плот-диаграмма распределения клеток, несущих CD45-PerCP/CD34-APC антигены во вновь образованной суспензионной популяции ГСПК ПК через 72 ч. после удаления не прикрепившихся ядросодержащих клеток ПК из со-культуры с МСК ГСПК, несущие оба антигена, - в верхнем правом квадранте CD45-FL-1-A Гены & Клетки Том XI, № 1, 2016 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 51 Статистический анализ Учитывая непараметрическое распределение количественных признаков, статистический анализ проводили с использованием U-критерия Манна-Уитни в «Microsoft Excel 2000» и «Statistica 7 0» Различия считали статистически значимыми при р<0. 05. Результаты Фенотип и динамики прикрепления недифференцированных гемопоэтических предшественников Криоконсервированные МНК ПК были разморожены и проанализированы на проточном ци-тофлуориметре для определения доли С034+-недифференцированных гемопоэтических клеток Доля клеток, несущих С034 маркер, составила 1,3±0,4%. Определение жизнеспособности и подсчет количества живых прикрепившихся клеток ПК проводили на первом этапе эксперимента сразу после удаления суспензии ядросодержащих клеток через 1, 3, 24 и 72 ч. со-культивирования (рис. 3). Из рис. 3 видно, что основная часть ГСПК уже через 3 ч прикреплялась к стромальному подслою Увеличение времени со-культивирования клеток ПК и МСК не приводило к существенному увеличению числа адгезировавшихся клеток Проведенный нами ранее морфологический анализ [13] показал, что большая часть клеток ПК, прикрепившихся к стро-мальному подслою, представляет собой гемопо-этические предшественники разной степени ком-митированности, т е те клетки, которые принято обозначать как ГСПК. Через 72 ч. экспозиции был определен фенотип адгезированных ГСПК. Доля Сй34+-клеток составила в среднем 63±19%, т. е. примерно 9,4x103 на 106 внесенных МНК ПК. Исходя из того, что исходная доля Сй34+-клеток была 1,3%, т. е. 13x103/106, эффективность адгезии CD34+ клеток равнялась 72% Амплификация и функциональная активность ГСПК после разных сроков адгезии (второй этап экспериментаJ После удаления суспензии ядросодержащих клеток ПК через определенные интервалы и со-культивирования оставшихся прикрепленных ГСПК с МСК в течение 72 ч , над стромальным слоем образовывалась новая суспензия неприкрепленных ГСПК, которые были собраны, подсчитаны, определена их жизнеспособность, проанализирован фенотип и проведен функциональный тест на содержание колониеобразующих единиц (КОЕ). Количество вновь образованных ГСПК и число Сй34+-клеток среди них линейно возрастало при увеличении времени адгезии (рис 4А) Во всех временных точках жизнеспособность ГСПК была высокой (>95%). Число КОЕ также изменялось прямо пропорционально времени адгезии (рис. 4б), при этом соотношение разных типов гемопоэтических колоний оставалось неизменным с существенным преобладанием БОЕ-Э Таким образом, после кратковременного (1-3 ч. ) и длительного (24-72 ч. ) со-культивирования ядросодержащих клеток ПК с МСК из жировой ткани можно получить фракцию адгезированных ГСПК, которая при последующей экспансии в течение дополнительных 72 ч. образует адгезированную и суспензионную популяцию гемопоэтических предшественников Количество ГСПК, доля среди них Сй34+-клеток и количество КОЕ во вновь образованной популяции ГСПК достигали максимальных значений после предварительной адгезии МНК ПК к МСК в течение 72 ч Опираясь на полученные результаты, было рассчитано примерное количество примитивных и ком-митированных предшественников в одной дозе ПК, составляющей около 100 млн клеток. Сравнительные данные по числу различных предшественников в исходной популяции МНК ПК и амплифицирован-ных ГСПК приведены в таблице. По сравнению с исходными МНК ПК в результате экспансии в нашей модельной системе происходило увеличение количества примитивных Сй34+-предшественников среди ГСПК в среднем в 4 раза, а количество КОЕ - примерно в 6 раз, что свидетельствует об эффективности предложенной схемы амплификации ГСПК ПК с использованием стромального подслоя из МСК жировой ткани Таблица. Сравнительная характеристика пкМНК и ГСПК Параметр CD34+ КОЕ/103 Исходные МНК ПК 0,13x108 140 (108 клеток) ГСПК из 108 МНК ПК 0,48x108 8 26 Кратность увеличения 3,7 7 Рис 3. Динамика прикрепления и жизнеспособность ГСПК ПК в различных временных точках эксперимента Данные представлены как среднее ± ошибка среднего. * - различия статистически значимы при сравнении со значением в точке 1 ч Гены & Клетки Том XI, № 1, 2016 52 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Рис. 4. Амплификация ГСПК в со-культуре с МСК: А - общее количество ГСПК ПК (кружки) и число CD34 + -клеток (треугольники) во вновь образованной суспензии; Б - характеристика КОЕ среди вновь образованной популяции ГСПК; БОЕ-Э - эритроидные, КОЕ-ГМ - гранулоцитарно-моноцитарные; КОЕ-Г - гранулоцитарные, КОЕ-М - моноцитарные; * - различия статистически значимы при сравнении со значениями в точках 1-24 ч. Обсуждение Ex vivo экспансия ГСПК для обеспечения необходимого количества прогениторных клеток позволяет скомпенсировать их недостаток в исходных образцах ПК. Успех амплификации ГСПК ПК может зависеть от ряда параметров: предварительной селекции, экзогенных цитокинов, источника стро-мального подслоя, времени совместной экспозиции гемопоэтических клеток с клетками стромы и др В настоящей работе был использован предложенный нами ранее метод со-культивирования ГСПК ПК на подслое из МСК жировой ткани человека без добавления экзогенных цитокинов [12]. Оказалось, что при со-культивировании МНК ПК с МСК происходит быстрое прикрепление основной части способных к адгезии клеток-предшественниц, число которых при дальнейшем культивировании изменяется незначительно. Определение времени экспозиции суспензии исходных популяций (костный мозг, ПК, иммобилизованная периферическая кровь), содержащих незначительное количество гемопоэтических предшественников, со стромальным подслоем является важной составляющей процедуры амплификации. Уменьшение времени экспансии может быть важно с точки зрения клинической практики, но при этом необходимо получить максимально функциональную клеточную популяцию. Ранее в экспериментах с выделенными CD34+-популяциями W. Wagner с соавт. (2007) обнаружили, что уже через 1 ч. к МСК из костного мозга и жировой ткани прикреплялось около 80% CD34+-клеток ПК и далее в течение 15 ч. большая часть этих клеток оставалась прикреп ленной [19]. Максимум адгезии через 2 ч. взаимодействия был выявлен при со-культивировании нефракционированных гемопоэтических клеток со стромой из костного мозга, после чего число ГСПК даже несколько снижалось [20]. Наши результаты показывают, что селекция ГСПК из исходной популяции МНК ПК за счет адгезии к стромальным клеткам происходит по такому же сценарию: ГСПК быстро прикрепляются в течение 3 ч. и далее их число практически не меняется. Таким образом, динамика адгезии малодифференцированных предшественников не зависит от того, была ли проведена их предварительная селекция. Вопрос: что эффективнее использовать для экспансии, нефракционированную ПК или популяцию CD34+-клеток? - пока не решен окончательно [9] тем не менее, уже убедительно показано, что при внесении на стромальный подслой как нефрак-ционированной суспензии клеток костного мозга и (или) ПК, так и CD34+-субпопуляции, прикрепляющаяся фракция гемопоэтических клеток обогащена недифференцированными предшественниками так, A. E. Frimberger с соавт. (2001) сравнили эффективность приживления исходных ГСПК костного мозга мышей и ГСПК из суспензии костномозговых клеток, адгезировавшихся к Декстеровскому подслою. Оказалось, что прикрепленные ГСПК эффективнее обеспечивали поддержание кроветворения у летально облученных мышей (70% случаев) по сравнению с исходными клетками костного мозга По мнению авторов, полученные данные указывают на то, что во фракции адгезированных ГСПК находятся две из Гены & Клетки Том XI, № 1, 2016 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 53 трех клеток, способных к приживлению [21]. В дальнейшем, в экспериментах с выделенными CD34+-клетками из костного мозга, ПК и периферической крови было продемонстрировано, что к стромально-му подслою из костномозговых МСК адгезируют преимущественно недифференцированные клетки с фенотипом CD34+/CD38- [18, 22, 23]. Пролиферация этих прикрепленных ГСПК обеспечивала появление новой суспензионной культуры, обогащенной гемо-поэтическими предшественниками разной степени коммитированности. Анализ фенотипа адгезированных ГСПК после 72 ч. со-культивирования с МСК, выполненный в настоящей работе, показал, что более 60% этих клеток были CD34+. Кроме того, после всех временных интервалов со-культивирования (1-72 ч. ) прикрепленные клетки продуцировали суспензионную популяцию, упомянутую выше При этом число ГСПК, вновь образуемых прикрепившимися клетками, а также количество CD34+-клеток и КОЕ в этой суспензии наиболее значимо увеличивалось после 72 ч. предварительной адгезии. Таким образом, анализ динамики прикрепления малодифференцированных гемопоэтических предшественников к стромальному подслою и их последующей амплификации показал, что, несмотря на быстрое прикрепление, оптимальное время адгезии ГСПК из популяции ядросодержащих клеток ПК для последующей успешной амплификации должно составлять не менее 72 ч

About the authors

E. R Andreeva

Institute of Biomedical Problems, Russian Academy of Sciences

Email: andreeva_er@mail.ru

I. V Andrianova

Institute of Biomedical Problems, Russian Academy of Sciences; Institute of Experimental Cardiology, Cardiology Research Center

A. N Gornostaeva

Institute of Biomedical Problems, Russian Academy of Sciences

P. I Bobyleva

Institute of Biomedical Problems, Russian Academy of Sciences

E. E Balashova

Institute of Experimental Cardiology, Cardiology Research Center; Cord Blood Bank “CryoCenter,"

L. B Buravkova

Institute of Biomedical Problems, Russian Academy of Sciences

References

Supplementary files