Homing and survivability of genetically modified mononuclear umbilical cord blood cells after transplantation into transgenic G93A mice with amyotrophic lateral sclerosis

Full Text

Введение Проблема лечения нейродегенеративных заболеваний остаётся одной из актуальных в фундаментальной и практической медицине [1]. Эти состояния сопровождаются гибелью нейронов, дегенерацией аксонов и нарушением функции иннервируемой ткани-мишени Больные получают симптоматическое лечение, которое существенно не повышает качество жизни и не увеличивает ее продолжительность Результаты преодоления последствий нейродегенерации и стимулирование нейрорегенерации в ходе лечения неврологических больных крайне неудовлетворительны и требуют разработки и внедрения новых терапевтических протоколов. Повышение эффективности сдерживания дегенерации, нейропротекции, поддержания роста нервных волокон и восстановления нервных связей связывают с применением современных клеточных и молекулярно-генетических подходов Для трансплантаций в нервную ткань, в том числе и как носителей терапевтических генов, применяют стволовые и прогениторные клетки многих видов [2, 3]. Список генов, кодирующих синтез потенциальных стимуляторов нейрорегенерации, достаточно велик Из них нам представляются наиболее перспективными сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), глиальный нейротрофический фактор (GDNF) и нейрональная молекула клеточной адгезии (NCAM) [4, 5]. Ранее, для достижения продолжительной ко-экспрессии различных трансгенов для терапии бокового амиотрофического склероза, мононону-клеарные клетки пуповинной крови (МКПК) были трансдуцированы аденовирусами, кодирующими гены человека VEGF, GDNF и NCAM. Существенное улучшение показателей поведенческих тестов у животных (сила хватки и открытое поле), а также увеличение продолжительности жизни было зарегистрировано у животных, подвергнутых ксенотрансплантации клеток, трансдуцированных двумя аденовирусами NCAM-VEGF или NCAM-GDNF. Активная экспрессия трансгенов в спинном мозге была показана спустя 10 нед после операции Трансплантированные клетки были обнаружены в спинном мозге трансгенных животных, спустя 5 мес. после ксенотрансплантации [8]. В настоящем исследовании иммунофлуоресцент-ным методом изучена зависимость сдерживания развития заболевания и увеличение продолжительности жизни мышей с моделью бокового амиотрофического склероза от количества прижившихся после трансплантации монононуклеарных клеток крови пуповины, трансдуцированных аденовирусами, кодирующими гены VEGF, GDNF и NCAM в различных комбинациях. Гены & Клетки Том X, № 4, 2015 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 87 Материал и методы МКПК человека трансдуцировали аденовирусами Ad-VEGF, Ad-GDNF, Ad-NCAM, Ad-EGFP в различных комбинациях, со значением множественности инфицирования (MOI) 10 (табл. ). Получение рекомбинант-ныхаденовирусовописано в предыдущих работах [6, 7]. 2х106 генетически модифицированных клеток трансплантировали G93A мышам с моделью бокового амиотрофического склероза на 28 нед жизни путем инъекции в ретроорбитальный синус в 100 мкл стерильного физиологического раствора [8] По мере прогрессирования заболевания и наступления терминальной стадии, за 1-2 дня до предполагаемой смерти, мышей выводили из эксперимента Животных наркотизировали и через большой круг кровообращения транскардиально перфузировали сначала холодным фосфатно-солевым буфером (рН = 7,4), затем холодным 4% раствором параформальдегида (рН = 7,4). Спинной мозг извлекали из позвоночного столба, постфиксировали в растворе параформальдегида в течение 4 ч на ротационном столике В целях криопротекции фиксированную ткань насыщали 30% раствором сахарозы на фосфатно-солевом буфере (рН = 7,4). Для приготовления криостатных срезов поясничный отдел спинного мозга помещали в заливочную среду TBS (Triangle Biomedical Science, Durham, NC, США) и замораживали в криостате Microm HM 560 (Carl Zeiss, Германия). Свободно плавающие поперечные срезы толщиной 20 мкм подвергали иммунофлуоресцент-ному окрашиванию с помощью моноклональных антител (АТ) против ядерного антигена человека (HNA, 1:150, Millipore, США). Для визуализации первич ных АТ использовали АТ, конъюгированные с Alexa 488 (1:150, Invitrogen, США). Для визуализации ядер срезы инкубировали в растворе 4',6-диамино-2-фенилиндола (DAPI, 10 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере, Sigma, США) 10 мин при комнатной температуре. Окрашенные срезы помещали в среду, поддерживающую флуоресценцию, и изучали с помощью конфокального микроскопа LSM 780 Meta (Carl Zeiss, Германия). HNA+ клетки подсчитывали на 100 поперечных срезах спинного мозга каждой мыши в нескольких повторениях. Полученные результаты представлены в виде среднего значения и стандартной ошибки, статистическая достоверность различий оценивалась при помощи t-критерия Стьюдента, при этом отличия считались достоверными при P<0,05. Результаты После трансплантации МКПК в спинном мозге трансгенных мышей во всех экспериментальных группах обнаружены HNA+ клетки, экспрессирующие ядерный антиген человека Достоверных различий в количестве выживших клеток на сроках до 8 нед. после трансплантации не выявлено. При этом на более поздних сроках в веществе спинного мозга мышей, для лечения которых был использован один терапевтический ген, встречаются лишь единичные трансплантированные клетки, а на том же сроке после трансплантации, в спинном мозге мышей, получивших клетки, содержащие комбинацию терапевтического гена с нейрональной молекулой адгезии, были обнаружены многочисленные скопления трансплантированных клеток (рис. 1). Таблица. Группы животных Группа Генетическая модификация МКПК* Нативные мононуклеарные клетки крови пуповины человека МКПК-Ad- EGFP МКПК, трансдуцированные аденовирусом Ad-EGFP МКПК-Ad- VEGF МКПК, трансдуцированные аденовирусом Ad-VEGF МКПК-Ad- GDNF МКПК трансдуцированные аденовирусом Ad-GDNF МКПК-Ad- VEGF-NCAM МКПК, трансдуцированные аденовирусами Ad-VEGF и Ad-NCAM МКПК-Ad- GDNF-NCAM МКПК, трансдуцированные аденовирусами Ad-GDNF и Ad-NCAM МКПК-Ad- GDNF- VEGF МКПК, трансдуцированные аденовирусами Ad- GDNF и Ad-VEGF * МКПК - моноуклеарные клетки пуповинной крови. А Merge- I « Б Рис. 1. Мононуклеарные клетки крови пуповины человека в спинном мозге G93A мыши через 9 нед. после трансплантации: А - HNA+ клетки, трансдуцированные Ad-GDNF; Б - HNA+ клетки, трансдуцированые Ad-GDNF и Ad-NCAM. Синий - ядра клеток, окрашены DAPI; зелёный - ядра клеток окрашены с помощью антител к ядерному антигену человека (HNA); merge - совмещение двух изображений. Масштабный отрезок - 20 цм Гены & Клетки Том X, № 4, 2015 88 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ На гистограмме представлено соотношение количества выявленных в паренхиме спинного мозга клеток, экспрессирующих ядерный антиген человека в период с 5 по 17 неделю после трансплантации (рис. 2). Одной из целей эксперимента являлось установить макимальную продолжительность выживания мышей на фоне лечения с помощью генетически модифицированных клеток. По этой причине животных выводили из эксперимента по мере вступления в терминальную стадию заболевания и в этой связи некоторые экспериментальные группы представлены одним животным. кроме того, учитывая, что сроки вывода из эксперимента разнятся у всех мышей, то для получения более наглядной демонстрации различий групп, было решено объединить две недели эксперимента в одну точку на шкале абсцисс. Вместе с тем нами получены данные в пользу того, что нейрональная молекула клеточной адгезии - NCAM поддерживает жизнеспособность трансплантированных клеток В экспериментальной серии МКПК-Ad-GDNF-NCAM количество клеток было больше, чем в серии МКПК-Ad-GDNF на сроке 9-10 нед., а на сроке 17 нед. HNA+ клетки были обнаружены только в серии МКПК-Ad-GDNF-NCAM. При этом единичные HNA+ клетки были выявлены и на более поздних сроках в сериях МКПК-Ad-GDNF-NCAM и МКПК-Ad-VEGF-NCAM [8]. Обсуждение Ранее нами была выдвинута гипотеза, что эффективность доставки терапевтического гена в нервную ткань в клеточных носителях можно увеличить путём введения в клетки гена, экспрессирующего нейрональную молекулу адгезии L1 [9]. Другими словами, одновременная сверхэкспрессия терапевтического гена, например, гена нейропротекторного фактора и нейрональной молекулы адгезии в мононуклеарных клетках крови пуповины усилит их адресную миграцию, выживаемость и, как следствие, продолжительность действия нейротрофического фактора на клетки мишени. Существенное улучшение показателей поведенческих тестов (сила хватки и открытое поле), а также увеличение продолжительности жизни было зарегистрировано у животных, подвергнутых ксенотрансплантации клеток, транс-дуцированных двумя аденовирусами NCAM-VEGF или NCAM-GDNF. Активная экспрессия трансгенов в спинном мозге была показана спустя 10 нед после операции. Трансплантированные клетки были обнаружены в спинном мозге трансгенных животных, спустя 5 мес. после ксенотрансплантации [8]. Сопоставление этих данных с результатами настоящего исследования подтверждают нашу гипотезу Максимальное количество трансплантированных клеток и на самых отдалённых сроках после трансплантации было установлено для группы мышей, которым вводили клетки, трансдуцированные терапевтическим геном и геном нейрональной молекулы адгезии При этом эта группа мышей имела и самую высокую продолжительность жизни Следовательно, сверхэкспрессия нейрональной молекулы адгезии моно-нуклеарными клетками крови пуповины человека повышала миграционный потенциал и жизнеспособность трансплантированных клеток и, как следствие, продлевала жизнь мышей с моделью бокового амиотрофического склероза Таким образом, целесообразность введения гена NCAM в мононуклеар-ные клетки крови пуповины человека для терапии нейродегенеративных заболеваний обусловлена: (1) повышением жизнеспособности трансплантированных клеток в ЦНС реципиента, (2) адресной доставкой специфических ростовых и трофических факторов в область нейродегенерации и (3) пролонгированием действия терапевтических молекул на клетки-мишени Рис. 2. Количество HNA+ клеток в 100 поперечных срезах спинного мозга G93A мышей после трансплантации мононуклеарных клеток крови пуповины человека на разных сроках эксперимента. Свободная от значений колонка в серии GDNF-NCAM на сроке 6 нед. обусловлена отсутствием гибели животных этой серии на этом сроке. Свободная от значений колонка в серии VEGF на сроке 9 нед. свидетельствует о гибели всех животных этой серии до данного срока. На сроке 17 нед. HNA+ клетки выявлены только в сериях GDNF-NCAM. n - количество животных, в скобках указано количество повторностей исследования Количество недель со дня трансплантации Гены & Клетки Том X, № 4, 2015 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 89 Благодарности Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (Проект № 15-15-20036). Анализы выполнены в лаборатории лазерной конфокальной микроскопии Междисциплинарного центра аналитической микроскопии на приборе LSM 780 компании CARL ZEISS. Работа выполнена в рамках программы повышения конкурентоспособности Казанского федерального университета и субсидии, выделенной Казанскому федеральному университе ту для выполнения государственного задания в сфере научной деятельности. Работа частично выполнена на оборудовании Междисциплинарного центра коллективного пользования Казанского федерального университета при финансовой поддержке государства в лице Министерства образования и науки России (ID RFMEFI59414X0003) и Научно-образовательного центра фармацевтики Казанского (Приволжского) федерального университета. ЛИТЕРАТУРА:

About the authors

Z. Z Safiullov

Kazan State Medical University

E. E Garanina

Kazan (Volga region) Federal University

A. A Izmailov

Kazan State Medical University

R. R Garifulin

Kazan State Medical University

V. Y Fedotova

Kazan (Volga region) Federal University

I. I Salafutdinov

Kazan (Volga region) Federal University

A. A Rizvanov

Kazan (Volga region) Federal University

R. R Islamov

Kazan State Medical University

References

Supplementary files