Morphofunctional reaction of T-lymphoblasts of Jurkat line on the titanium oxides coating

Full Text

Введение Оценка иммунотоксичности биоматериалов и медицинских изделий является одним из важнейших шагов в определении их биологической совместимости. Она включает определение структурно-функциe-mail: khlusov63@mail. ru ональных изменений одного или более компонентов иммунной системы, например, маркеров клеточных мембран и цитокинового профиля Т-лимфоцитов [1]. Быстро пролиферирующая Jurkat линия лей-козных Т-лимфобластоподобных клеток человека Гены & Клетки Том X, № 1, 2015 84 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ (далее Jurkat Т-клетки) часто используется для моделирования in vitro реакций Т-лимфоцитов крови в норме [2], при остром Т-лимфобластном лейкозе и лимфомах [3]. Различные исследователи применяют Jurkat Т-клетки для изучения иммунных и цито-токсических реакций на биоматериалы [4], ионы [5] и наночастицы [6], способные выделяться при биодеградации эндопротезов и запускать IV тип иммунопатологических реакций Ранее мы установили возможность прямого влияния поверхности тонких кальцийфосфатных покрытий, нанесенных на титан методом высокочастотного магнетронного распыления, на созревание и диф-ференцировку Jurkat Т-клеток in vitro [7]. Титан - биосовместимый металл, широко применяющийся в различных направлениях биомедицины, обладающий биоинертными свойствами [8], обусловленными, преимущественно, формированием поверхностной пленки оксидов титана [9]. В последнее время появляются работы, свидетельствующие о физико-химических характеристиках титановой поверхности, выходящих за рамки концепции биоинертности [10]. В 1964 году A. üurtis и M. Varde предположили важнейшую роль топографии естественных и искусственных матриксов в детерминации клеточного поведения, включая подвижность и морфофункциональные свойства клеток [11]. Однако до сих пор не выяснены физические процессы, лежащие в основе многочисленных данных in vitro и in vivo, подтверждающих их гипотезу. В связи с этим, целью исследования явилось изучение реакции Т-клеток линии Jurkat на краткосрочный контакт in vitro с модельными подложками, несущими шероховатое покрытие из оксидов титана Материал и методы В эксперименте in vitro применяли образцы размером 12x12x1 мм3, несущие двустороннее покрытие из оксидов титана. Покрытие формировали на подложке из коммерчески доступного чистого титана (99,58 Ti; 0,12 O; 0,18 Fe; 0,07 0; 0,04 N; 0,01 H весовых %) методом микродугового оксидирования в анодном режиме в водном растворе 20% ортофос-форной кислоты [12]. Шероховатость покрытия определяли с помощью профилометра-296 (Россия) согласно ГОСТ 2789-73 по индексу Ra, который рассчитывается как среднее арифметическое 10 измерений отклонений профиля поверхности в пределах базовой длины измерения 1,5 мм. Толщина покрытий, измеренная на 5 об-разцах-свидетелях до и после нанесения покрытия (ГОСТ 9. 302-88 ЕСЗКС) с помощью микрометра МК-25 (Россия), составила в среднем 9 мкм. Исследования морфологии и элементного состава поверхности образцов осуществляли с использованием сканирующего электронного микроскопа (СЭМ) Quanta 200 ESEM FEG со встроенным EDX-анализатором (EDS analysis system Genesis 4000, S-UTW-Si(Li)detector). Согласно EDX-спектрам, покрытия состоят из титана (44 ат%) и кислорода (56 ат%). Рентгенофазовый анализ (РФА) покрытий (рентгеновский дифрактометр Shimadzu XRD-7000, Япония) показал оксиды титана TiO2(anatase) TiO, TiO2(rutil). Преобладающей фазой являлся диоксид титана (TiO2), что было использовано для обозначения поверхности образцов как TiO2 покрытие. Оптическую микроскопию покрытий в отраженном свете проводили на металлографическом микроскопе Olympus GX-71 с цифровой камерой Olympus DP 70 (Япония) Для исследования электрических параметров покрытий использовался малогабаритный прибор с цифровым индикатором и автономным питанием от аккумуляторов, разработанный Э. А. Гостищевым в НИИ интроскопии Национального исследовательского Томского политехнического университета. В основу прибора заложен усовершенствованный метод М. Егучи (2011) (метод подъёмного электрода), позволяющий проводить измерения на расстоянии 0,5 мм над поверхностью [13]. Величина потенциала поля на поверхности образцов выражалась как среднее измерений с 5 точек поверхности с площадью 20 мм2 Наночастицы диоксида титана Использовали нанопорошок диоксида титана TiO2, приготовленный в Институте сильноточной электроники СО РАН (г Томск) методом электрического взрыва проводников. Трансмиссионная электронная микроскопия (JEM-200ÜX, Япония) показала моно-центрическую гистограмму распределения частиц кубической формы, имеющих средний диаметр 14 нм при среднеквадратичном отклонении 8 нм Нанодисперсии готовили непосредственно перед смешиванием с клетками при помощи ультразвуковой обработки (Elmasonic S10, Германия) взвеси наночастиц в изотоническом растворе хлорида натрия в течение 5 мин. Добавляли в клеточную взвесь в конечной концентрации 10 предельно допустимых концентраций (ПДК, 1 мг/л) или 100 ПДК (10 мг/л) по титану, перемешивали путем пипетирования Культура клеток Для оценки in vitro молекулярных аспектов биосовместимости TiO2 покрытия или TiO2 наночастиц использовали иммортализированную клеточную линию Jurkat 5332 лейкозных Т-лимфобластоподобных клеток человека (Российская коллекция клеточных культур позвоночных Института цитологии РАН, Санкт-Петербург), стандартизированную до 1x106 жизнеспособных мононуклеаров на 1 мл питательной среды Подсчёт концентрации и жизнеспособности клеток до культивирования проводили с помощью автоматического счётчика клеток countess™ Automated cell counter (Invitrogen, США) с использованием 0,4% раствора трипанового синего (Invitrogen, США). Доля жизнеспособных клеток составила 98% Клетки линии Jurkat ресуспендировали в полной питательной среде, состоящей из 90% RPMI-1640 (Sigma, США), 10% инактивированной (56°С в течение 30 мин ) сыворотки крови эмбрионов коров (Sigma, США) и 0,3 мг/мл L-глутамина (Sigma, США). В лунки 24-луночного планшета (Orange Scientific, Бельгия; площадь лунки 1,86 см2) помещали по 1 подложке с TiO2 покрытием или взвесь TiO2 наночастиц, культивировали в течение 24 ч при температуре 37°С и 5% СО2 Контролем служила клеточная взвесь без объемных или наноразмерных образцов После инкубации клеточную взвесь центрифугировали при 500 g в течение 15 мин Клеточный осадок использовали для оценки апоптоза, некроза, активных форм кислорода, презентации мембранных Гены & Клетки Том X, № 1, 2015 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 85 антигенов, а надосадочную жидкость (супернатанты) - для определения концентрации цитокинов. Определение активных форм кислорода и клеточной смерти Внутриклеточную концентрацию активных форм кислорода (АФК) и долю погибших клеток (рис. 1) определяли на проточном цитофлуориметре FACSCanto™ II (BD, США). Продукцию АФК (гейт P2) в клетках оценивали с помощью красителя с заблокированной флуоресценцией - дихлорфлуоресцеина диацетата (Sigma Aldrich, США). Процентное соотношение живых и погибших (апоптотических и некротических) клеток и общее количество клеток в пробе определяли методом проточной цитофлуориметрии на приборе Guava EasyCytePlus (Millipore, США) с использованием реагента и программы Guava Via Count (Millipore, США). Для этого исследуемые клетки в объеме 12,5 мкл переносили в иммунологический планшет, добавляли 112,5 мкл реагента Guava ViaCount (Millipore, США), тщательно ресуспендировали, инкубировали 5 мин в темном месте Анализ образцов проводили на проточном цитофлуориметре Guava EasyCytePlus (Millipore, США) с использованием программы Guava Via Count (Millipore, США) Оценка цитокинового профиля культуры клеток Для определения концентрации интерлейкинов (IL-1b, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10) и фактора некроза опухоли (TNFa) в супернатантах использовался твердофазный иммуноферментный «сэндвичевый» метод (ИФА). Процедуру выполнения ИФА осуществляли согласно инструкциям, предлагаемым производителем тест-систем цитокинов («Вектор Бест», Россия) на автоматическом иммуноферментном анализаторе Lasurit (Dynex Technologies, США). Концентрацию цитокинов выражали в пг/мл. Выявление иммунофенотипа клеток Регистрацию антигенного профиля клеток проводили методом, основанным на взаимодействии специфических моноклональных антител (МКАТ) с кластерными детерминантами на клеточных мембранах в соответствии с инструкцией производителя МКАТ. После культивирования клетки отмывали фосфатным буфером (рН = 7,2) и окрашивали в объеме 10 мкл стандартными МКАТ, меченными флуоресце-инизотиоцианатом (FITC), аллофикоцианином (АРС), фикоэритрином (PE) или перидининовым белком хлорофилла (PerCP, peridinin chlorophyll protein) (Abcam, Великобритания; e-Bioscience, США) и фиксирующимися к маркерам клеточной диффе-ренцировки (CD3, CD4, CD8, CD16, CD25, CD45RO, CD45RA, CD56, CD71, CD95). После 30 мин. инкубации с МКАТ клетки подвергали анализу на проточном цитофлуориметре MACS Quant (Miltenyi Biotec, Германия). Оценивали параметры оранжевой/зеленой/красной флуоресценции в гейте изучаемых клеток, определяли количество клеток, презентирующих изучаемые антигенные детерминанты. Результаты цитометриче-ского анализа были проанализированы с помощью программы «KALUZA Analysis Software» (Beckman Coulter, США) Статистический анализ Результаты обрабатывали с применением программы «STATISTICA for Windows 6. 0» (StatSoft, США). Рассчитывали параметры распределений: медиану (Ме), 25% квартиль (Q1) и 75% квартиль (Q3). Для оценки статистической значимости различий применяли непараметрический критерий Манна-Уитни (U-тест). Различия считали статистически значимыми при р<0,05. Связь между исследуемыми показателями устанавливали методами регрессионного и корреляционного (по Спирмену) анализов 10е4 ЮеЗ, s о 10e2-J 10е1- 10е41 10е^ і ......................W-'-................................................. û. і 10е2і -S:.... j -Q : 5 : ІОеІт ігоШк т 1 1 1(11111 1 1 1 N1111 1 1 1 HUB 1 1 1 1 III 1ОеО-І -1 1 1 ПІНІ-1 1 1 MINI 1 1 1 1 llti£-1 II 1 III 10е0 10е1 10е2 10еЗ Viability (РМ1) 10е4 ЮеО 10е1 10е2 10еЗ 10* FSC EasyFit Results Manual Results Count %of Total Count % of Total Viable 843 83,63% 755 75,50% Dead 165 16,37% 245 24,50% Viable Total Viable Total Cells mL 1.23Є06 1,46e06 1,10e06 1,45e06 Cells in Org Sample O.OOeOO O.OOeOO O.OOeOO O.OOeOO Debris Index 1,37% 2,15% Рис. 1. Количество жизнеспособных и погибших клеток in vitro. Стандартный протокол оценки клеточной смерти с использованием реагента GuavaViacount Гены & Клетки Том X, № 1, 2015 86 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Результаты исследования Согласно полученным результатам, в двумерной (2D) культуре на пластике Jurkat линия Т-лимфобластоподобных клеток человека экспрессировала широкий спектр мембранных маркеров (табл. 1). 95 % клеточной культуры являлись CD45RA+ наивными (не активированными антигеном) иммортализированными T-клетками. Основная доля клеток (27-98%) в 24-часовой культуре имела иммунофенотип CD3+/CD4+/CD71+/CD45RA+. Другие маркеры клеточной дифференцировки, созревания и смерти (CD8, CD16, CD56, CD25, CD95) обнаруживались в интервале 0-2,5 % иммуноком-петентных клеток (табл. 1). Изучение цитокинового профиля Jurkat клеток показало секрецию IL-2, IL-4, IL-8, IL-10 и TNFa, но не IL-1b и IL-6 (табл. 2). При этом определяемые в супернатантах уровни IL-2 в пределах 3,3-8,1 пг/мл (табл 2) не сопровождались экспрессией рецептора (CD25 антигена) к данному цитокину (табл. 1). По-видимому, IL-2 зависимый путь (сам цитокин и рецептор к нему на мембране клеток) не являлся определяющим механизмом аутокринной активации пролиферации T-клеток и выживаемости опухолевого клона in vitro. Тем не менее, имела место IL-2 независимая активация, обусловленная мембранной экспрессией молекул пролиферации CD71 (рецептора к трансферрину) и апоптоза CD95 (табл. 1). Общее количество кариоцитов (ОКК) через 24 ч. культивирования повышалось несущественно с исходных 1 х106/ мл до 1,12 (1,1-1,4)х106/мл при медиане жизнеспособности Т-клеток 82,9 %. Согласно табл. 1, часть неприлипающих Jurkat Т-клеток в 24-часовой культуре погибала путем апоптоза (медиана 5,2%) и некроза (медиана 8,2 %). Добавление в клеточную культуру образцов титана с TiO2 покрытием изменяло морфофункциональное состояние лейкозных Т-лимфобластоидных клеток человека (табл. 1, 2). Контакт с чужеродной поверхностью не вызывал увеличение экспрессии низкомолекулярной изоформы CD45-молекулы (CD45RO), характерной для стимулированных Т-клеток. Однако проточная цитофлуориметрия показала статистически значимое уменьшение (табл. 1) доли неадге-зировавшихся клеток, экспрессирующих антигены дифференцировки и созревания Т-клеток: CD3 - на 0,5%, CD8 - на 1,85% и CD4 - на 2,1% в сравнении с контролем Краткосрочный контакт Jurkat клеток с TiO2 покрытием не сопровождался изменением секреции IL-2 - основного лимфокина, продуцируемого данной клеточной линией. Тем не менее, выход IL-4, также способного усиливать рост Т-клеток и генерацию цитотоксических Т-лимфоцитов [14], снижался до нулевого значения (табл 2) Таблица 1. Молекулярные маркеры мембран и показатели клеточной смерти линии Jurkat клеток после 24-часового культивирования с образцами, несущими TiO2 покрытие на титановой подложке, Me (Q1-Q3) Число погибших клеток, % Количество клеток, экспрессирующих мембранные маркеры, % n 0 н с 0 с < Некроз CD3 CD4 CD8 CD71 CD45RO CD45RA CD16 CD56 CD25 CD95 Клеточная культура на пластиковой поверхности культурального планшета (контроль), n = 3-15 5,2 8,2 98 27,5 2,16 94,0 0,55 94,9 2,46 2,5 0 1,0 (5,2-8,9) (8,1-14,2) (97,9-98,85) (26,54-28,43) (1,9-3,0) (93,5-95,0) (0,49-0,60) (94,0-95,22) (2,34-2,83) (2,3-2,97) (0-0,16) (0,9-1,2) Клеточная культура в присутствие образцов с TiO2 покрытием, n = 3-15 5,9 15,3 97,5 25,4 0,31 94,0 0,50 94,0 2,33 2,36 0 0,56 (5,6-6,9) (8,2-19,3) (97-98)* (24,76-26,70)* (0,2-0,43)* (93,49-95) (0,41-0,50) (93,15-94,3) (2,17-2,34) (2,22-2,80) (0-0,12) (0,3-0,6)* р<0,03 р<0,002 р<0,000003 р<0,002 Таблица 2. Концентрация цитокинов в супернатантах Jurkat Т-клеток после 24-часового культивирования с модельными имплантатами, несущими TiO2 покрытие на титановой подложке, Me (Q1-Q3) Концентрация цитокинов, пг/мл IL-1b IL-2 IL-4 IL-6 IL-8 IL-10 TNFa Пластиковая поверхность культурального планшета (контроль), n = 12 0 (0-0,23) 5,67 (5,46-5,98) 1,10 (0,74-1,24) 0 11,12 (9,18-12,59) 6,10 (5,40-6,96) 14,95 (13,97-15,51) TiO2 покрытие, n = 12 0 (0-0,10) 6,10 (3,30-8,10) 0 (0-0,79)* р<0,007 0 12,78 (11,71-13,22) 7,80 (4,87-9,86) 13,48 (8,0-14,15)* р<0,01 Гены & Клетки Том X, № 1, 2015 оригинальные исследования 87 Функциональная инактивация Jurkat Т-клеток после контакта с TiO2 покрытием не сопровождалась усилением процессов апоптоза или некроза в выбранной нами клеточной системе in vitro (табл. 1). Внутриклеточный уровень АФК, активно участвующих в процессах клеточной активации и смерти, оставался на уровне 0,087 (0,078-0,094) у. е. , который статистически значимо не отличался от контрольного значения (клетки без образцов), составившего 0,099 (0,088-0,112) у. е. В то же время, установлена обратная корреляция рельефа TiO2 поверхности и числа жизнеспособных Jurkat клеток в 24-часовой культуре (rs = -0,95; n = 9; p<0,0001), преимущественно, за счет увеличения процессов некроза (табл. 3). Регрессионный анализ показал прямолинейное убывание доли живых Т-клеток в культуре с увеличением индекса шероховатости Ra (рис. 2), характеризующим увеличение рельефа поверхности образцов При контакте с TiO2 поверхностями, имеющими шероховатость в диапазоне Ra 2,28-3,7 им, жизнеспособность Jurkat Т-клеток статистически значимо (Ри <0,05) и прогрессивно снижалась по сравнению с контролем роста клеток на пластике, составившем 82,9 (80,6-86,7)%. Снижение выживаемости Jurkat Т-клеток не было связано с компонентами суперсемейства TNF (CD95(Fas/APO-1) и TNF-a). Секреция TNF-a и экспрессия cD95 достоверно уменьшались до 90% (Ри <0,01) и 56% (Ри <0,002), соответственно, по отношению к показателям контрольной культуры клеток, не контактировавших с образцами (табл 1, 2) Своеобразная гипергия Jurkat Т-клеток на контакт с TiO2 покрытием может быть обусловлена факторами биологического влияния искусственного материала, как прямого, так и опосредованного через продукты (в том числе наночастицы) его деструкции и биодеградации. Тем более что часть Jurkat Т-клеток плотно адгезировала к TiO2 поверхности (рис. 3), изменение ее шероховатости оказывало заметное влияние на морфофункциональные показатели культуры лейкозных Т-лимфобластов (табл. 3). Результаты показали (табл. 4), что в культуре Jurkat Т-клеток нанодисперсия диоксида титана в диапазоне 10-100 ПДК (по титану), также как и само TiO2 покрытие, не оказывала заметного влияния на внутриклеточную концентрацию АФК и апоп-тотическую гибель Т-лимфобластов. С другой стороны, Jurkat Т-клетки реагировали на наноразмерный раздражитель увеличением в межклеточной жидкости концентраций TNF-a (на 22% независимо от дозы нанодисперсии) и, в меньшей степени, IL-2 (на 18% при 100 ПДК). Следует отметить инверсивное действие TiO2 нанодисперсии в сравнении с эффектом объемного изделия (табл. 2, 5). Напротив, супрессирующий (на 11-18% по отношению к контролю) эффект TiO2 наночастиц на секрецию IL-4 (табл. 5) во многом соответствовал таковому для TiO2 покрытия (табл 2) Рис. 2. Регрессионная зависимость выживаемости Jurkat Т-клеток после 24-ч. культивирования с титановыми образцами, покрытыми оксидами титана. По оси абсцисс - средние значения индекса шероховатости покрытия Ra, им; по оси ординат - медиана жизнеспособности клеток Рис. 3. Клетка линии Jurkat на шероховатой поверхности оксидов титана. Оптическая микроскопия в отраженном свете, темное поле. Ув. х1000 Таблица 3. Коэффициенты ранговой корреляции по Спирмену между индексом шероховатости (Ra] поверхности из оксидов титана и морфофункциональными показателями in vitro культуры Jurkat Т-клеток Индекс % живых клеток % апоптоза % некроза CD8 CD56 IL-2 IL-4 IL-10 TNFa Ra -0,95 -0,69 0,95 0,71 -0,95 -0,95 -0,69 -0,92 0,68 n = 9 n = 9 n = 9 n = 14 n = 9 n = 12 n = 12 n = 12 n = 12 р<0,0001 р<0,042 р<0,0001 р<0,004 р<0,0001 р<0,000003 р<0,013 р<0,00003 р<0,015 гены & клетки Том X, № 1, 2015 88 оригинальные исследования Таблица 4. Доля апоптозных Jurkat Т-клеток и уровень внутриклеточных активных форм кислорода после 24-часового культивирования с наноразмерными частицами диоксида титана, Me (Q1-Q3] № группы Исследуемая группа Результаты измерений Апоптоз,% Активные формы кислорода, у.е. 1 Контрольная культура клеток 5,87 0,130 на пластике, n = 6 (5,32-6,99) (0,123-0,150) Образцы наноразмерных частиц, n = 3 2 TiO2, 100 ПДК 4,82 0,131 (4,24-8,5) (0,129-0,194) 3 TiO2, 10 ПДК 4,76 0,139 (3,65-6,39) (0,130-0,162) ПДК - предельно допустимая концентрация. Таблица 5. Уровень цитокинов в культуральной среде (пг/мл] при культивировании опухолевой линии Jurkat Т-лимфоцитов в присутствии наноразмерной дисперсии, Me (Q1-Q3] № группы Исследуемая группа Результаты измерений TNFa IL-2 IL-4 Контроль секреции для наночастиц, n = 6 1 Контрольная культура клеток 27,41 4,02 4,14 на пластике, n = 6 (26,62-28,17) (3,97-4,04) (4,06-4,24) Образцы наноразмерных частиц, n = 3 2 TiO2, 100 ПДК 33,52* (32,77-35,0) р<0,05 4,73* (4,61-5,0) р<0,05 3,67* (3,60-3,67) р<0,045 3 TiO2, 10 ПДК 33,51* (33,17-35,49) р<0,05 3,61 (3,56-4,55) 3,40* (3,27-3,60) р<0,045 * - в таблицах 1, 2, 5 указаны различия согласно U-критерию Манна - Уитни при сравнении с контролем секреции. Полученные данные не позволяют однозначно связать супрессирующий эффект TiO2 поверхности на Jurkat Т-клетки через наноразмерные продукты их биодеструкции, поскольку: 1) TiO2 наночастицы обладали неоднозначным влиянием на клеточную секреторную активность; 2) использованных концентраций наночастиц (1-10 мг/л) можно добиться только за счет активного биомеханического воздействия на металлокерамическое TiO2 покрытие, недостижимого при краткосрочном культивировании; 3) TiO2 наночастицы не генерировали внутриклеточные окислительные процессы (табл 4) Результаты измерения электростатических свойств TiO2 покрытия на титановой подложке показали отрицательный знак его заряда и среднюю амплитуду потенциала V = -147±35 мВ (число измерений 61). С увеличением индекса шероховатости Ra амплитуда отрицательного потенциала поверхности образцов линейно возрастала (r = 0,6; p<0,000001, n = 60). Обсуждение Использованные в нашем эксперименте Jurkat Т-клетки при 24-часовом культивировании на пластиковой поверхности ^D-культура) имели пре обладающий иммунофенотип CD3+/CD4+/CD71+/ CD45RA+ (табл. 1), что, в основном, функционально соответствует наивным/покоящимся Т-хелперам/ин-дукторам [15, 16] с экспрессией рецептора ктранс-феррину (CD71), митогену Т-лимфоцитов [17]. Только у 0,55% T-клеток в 24-часовой культуре присутствует cD45RO изоформа трансмембранного антигена, экспрессирующаяся in vitro активированными Т-лимфоцитами и (или) Т-клетками памяти [16, 18]. Jurkat Т-клетки секретировали в межклеточную жидкость (табл. 2) широкий спектр иммуномодулирующих цитокинов и хемокинов (IL-2, IL-4, IL-8, IL-10 и TNFa), но не IL-1b и IL-6, с провоспалитель-ной (IL-2, IL-8, TNF-a) и противовоспалительной активностью (IL-4, IL-10) [19]. При этом IL-2, IL-4 [14] и IL-8 [20] повышают пролиферацию и выживаемость опухолевых клеток посредством аутокринных/ паракринных сигнальных путей В свою очередь, IL-1 рассматривается как ауто-кринный костимулятор роста Т-клеток [14], в том числе линии Jurkat [21], и эндогенный ингибитор их CD95(Fаs)-опосредованного апоптоза [22]. IL-6 также обладает антиапоптотическим эффектом в отношении Т-клеток [16]. Fas (CD95 + ) - Гены & клетки Том X, № 1, 2015 оригинальные исследования 89 трансмембранный рецептор - определялся только у 1% клеточной популяции (табл . 1). В условиях нехватки костимулирующих аутокринных факторов (IL-1, IL-6, табл . 2) обнаруженный дисбаланс секреции IL-2 (табл . 2) при полном отсутствии экспрессии его рецептора (cD25 антигена) (табл. 1) мог лежать в основе медленного роста Jurkat популяции in vitro. Дополнительно IL-10 (табл . 2) способен индуцировать анергию Т-клеток [23], подавлять их пролиферацию и активацию, ингибировать экспрессию IL-2, как описано [19]. Долгое время титан считался биоинертным материалом [9, 10] за счет образования тонкой (толщина менее 1 мкм) пленки диоксида титана на своей поверхности посредством «самопассивации» Микродуговое оксидирование титановых подложек позволило увеличить толщину оксидного покрытия в среднем до 9 мкм, что предполагает повышение полезных свойств изделий, включая антикоррозионную стойкость и диэлектрические свойства их поверхности Металлокерамическая, биоинертная по своей сути, TiO2 пленка не вызывала усиления процессов апоптоза и некроза в культуре Jurkat Т-клеток (табл . 1). Более того, контакт клеточной культуры с потенциальным раздражителем сопровождался подавлением путей клеточной смерти, реализуемых через звенья суперсемейства «TNF-a - cD95(Fas/APO-1)» (табл . 1,2) . С другой стороны, имели место уменьшение экспрессии маркеров дифференцировки и созревания Т-лимфоцитов (cD3, cd4, cD8), подавление IL-4-зависимых механизмов выживаемости Т-клеток (табл 2) При индексе шероховатости TiO2 покрытия Ra>2,2 мкм функциональная инактивация Jurkat Т-клеток сопровождалась прогрессивным снижением числа жизнеспособных клеток в культуре (рис 2). При этом результаты (табл . 4, 5) клеточного воздействия взвесей наночастиц TiO2 в диапазоне 10-100 ПДК (по титану) не позволяют рассматривать их как однозначного посредника негативного клеточно-молекулярного эффекта рельефа TiO2 покрытия на процессы клеточной смерти Часть авторов считают, что наночастицы оксидов титана [6], в отличие от ионов и оксидов других металлов, не обладают цитотоксичностью в отношении Jurkat Т-клеток [2, 5]. При этом наночастицы способны адсорбироваться на поверхности Jurkat Т-клеток [24] В таком случае, взаимодействие Jurkat Т-клеток с рельефом TiO2 покрытия, но не с продуктами его разрушения, скорее всего, лежит в основе снижения их жизнеспособности и функциональной активности Установлены тесные связи индекса шероховатости поверхности (Ra) с морфофункциональными показателями Jurkat Т-клеток (рис . 2, табл . 3). При этом обратная и прямая его корреляции соответственно с долей апоптозных и некротизированных клеток (табл 3) позволяют предположить, что именно клеточная мембрана является основной мишенью влияния физических свойств TiO2 покрытия . Неактивированные Jurkat клетки способны посредством электростатического взаимодействия отрицательно заряженных гликопротеинов на своей мембране (дзета-потенциала) прикрепляться к TiO2 поверхности, предпочитая участки с нулевым зарядом [25]. Микродуговое TiO2 покрытие имеет отрицательный заряд и поверхностный электростатический потенциал, который линейно возрастает с увеличением шероховатости поверхности Часть Т-лимфобластоподобных клеток адгезируется к TiO2 покрытию (рис . 3) и может подвергаться прямому контактному влиянию носителей поверхностного заряда Подъемный электрод измерителя потенциала фиксирует электрическое поле на расстоянии 500 мкм (50 диаметров клеток) от измеряемой поверхности [13]. Образцы титана закрывали 77% поверхности лунки в культуральном планшете, в связи с чем электрический заряд TiO2 покрытия мог оказывать влияние на большую часть популяции Jurkat Т-клеток в течение 24 ч Ранее показан благоприятный эффект отрицательного заряда микродуговых кальцийфосфатных покрытий на титане (при сопоставимой шероховатости поверхности) на дифференцировку и созревание здоровых стромальных клеток человека [26]. Изменение величины и знака трансмембранного потенциала, связанного с дзета-потенциалом [27], во многом определяет судьбу клеток [28]. Полученные результаты позволяют предположить, что шероховатость диэлектрического TiO2 покрытия индуцирует электростатический потенциал, который, в отличие от здоровых клеток, оказывает тормозящий эффект на морфофункциональную активность иммортализированной Jurkat линии лей-козных Т-лимфобластоподобных клеток человека через механизмы, не связанные с генерацией активных форм кислорода . Функциональная супрессия иммунокомпетентных клеток может объяснить хорошую выживаемость титановых имплантатов в организме человека и, с другой стороны, иметь значение в случае выбора материала при эндопротезировании и остеосинтезе у больных, страдающих гемобластозами Благодарности Авторы выражают признательность старшему научному сотруднику Е.В. Легостаевой (Институт физики прочности и материаловедения СО РАН, г. Томск) за тестирование физических свойств подложек с покрытием из оксидов титана.

About the authors

I. A Khlusov

Siberian State Medical University; Tomsk Polytechnic University

Email: khlusov63@mail.ru

L. S Litvinova

I. Kant Baltic Federal University

V. V Shupletsova

I. Kant Baltic Federal University

N. A Sokhonevich

I. Kant Baltic Federal University

O. G Khaziakhmatova

I. Kant Baltic Federal University

M. Yu Khlusova

Siberian State Medical University

Yu. P Sharkeev

Institute of Strength Physics and Materials Science of SB RAS

V. F Pichugin

Tomsk Polytechnic University

References

Supplementary files