Effect of decellularization with sDs and Triton X-100 detergent solutions on the strength capacities of small caliber arteries

Full Text

Введение Бесклеточные матриксы нативных тканей вызывают все большее внимание при создании объемных носителей клеточного материала для заместительной и реконструктивной имплантации [1-7]. Интерес к использованию таких матриксов определяется тем, что они, обладая гипоиммунногенностью и низкой тромбогенностью, имеют сетчатую структуру, обеспечивая оптимальные условия для адгезии аутогенных клеток [8-11]. Одним из перспективных подходов для получения сосудистых протезов малого диаметра может стать использование децеллю-ляризованных матриксов кровеносных сосудов [12, 13]. Создание аналогичных конструкций на основе использования отдельных компонентов экстрацел-люлярного матрикса и синтетических материалов в настоящее время сопряжено с риском возникновения аневризм в связи с низкой механической прочностью [14, 15] Однако для получения матриксов биологических тканей необходимо осуществить удаление клеточного компонента с возможно более полным сохранением химической и объемной структуры соединительнотканных волокон. Вполне вероятно, что для разных тканей процедура децеллюляризации имеет свои особенности Ранее нами была предложена методика химической децеллюляризации тканей растворами детергентов - додецилсульфата натрия (SDS), Тритона X-100 и растворами ДНКазы и РНКазы. [16]. Данная технология позволяет удалять клеточные составляющие из стенки любого артери- ального сосуда с минимальным повреждением его соединительнотканного каркаса и сохранением его сетчатой структуры. При этом, суммарное время обработки сосуда составляет не более 4 ч , а разработанный протокол пригоден для децеллюляризации сосудов как животных, так и человека [17]. Целью настоящей работы является оценка изменения механической прочности артерий человека, подвергшихся децеллюляризации растворами детергентов SDS и Тритона Х-100. Материал и методы Исследование проводилось на дистальных фрагментах внутренних грудных артерий, взятых у пациентов, страдающих ишемической болезнью сердца, во время стандартной операции маммарокоронарно-го шунтирования после подписания ими добровольного информированного согласия (n = 20). Средний возраст пациентов составил 57±3 лет. Фрагменты сосудов помещали в охлажденный физиологический раствор, дальнейшую их подготовку и исследование проводили в лаборатории Временной промежуток между забором сосуда и началом исследования не превышал 2 ч Подготовку сосуда и удаление окружающих тканей выполняли в чашке Петри с дистиллированной водой при комнатной температуре, после чего сосуд переносили в перфузионную камеру и фиксировали на канюле. Сосуды отмывали от крови, прокачивая через них перистальтическим насосом дистиллированную Гены & Клетки Том X, № 2, 2015 62 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ воду в течение 10-15 мин. со скоростью 20 мл/мин. Затем в течение 1 ч. сосуд обрабатывали 1% водным раствором SDS (Sigma-Aldrich, США), прокачивая раствор перистальтическим насосом со скоростью 20 мл/мин Далее сосуд в течение 1 ч перфузиро-вали 1% водным раствором Тритона X-100 (Sigma-Aldrich, США). После этого в течение 10-15 мин сосуд отмывали от детергентов дистиллированной водой, а затем еще 10-15 мин. физиологическим раствором. [18, 19]. Качество проводимой процедуры оценивали с помощью морфологического контроля Для этой цели каждые полчаса обработки от сосуда отрезали сегмент длиной 3-4 мм, который фиксировали в 10% нейтральном формалине с последующей проводкой через спирты и приготовлением парафиновых блоков. Гистологические препараты окрашивали гематоксилином и эозином, по Браше, орсеином, и по Ван Гизону. Количество клеток считали в 10 полях зрения при увеличении х1000 (микроскоп Axio imager M2, Германия) и выражали в процентах, принимая за 100% их содержание в интактном сосуде. Для выявления коллагенов i и iii типов в стенке исследуемых сосудов проводили иммуногистохи-мическое исследование с антителами к коллагенам i и iii типов (Sigma-Aldrich, США) [18]. Количество коллагеновых волокон подсчитывали в поле зрения (ув. х1000) в интактном сосуде и в децеллюляри-зированном сосуде Уменьшение количества коллагеновых волокон в децеллюляризированном сосуде выражали в процентах, принимая за 100% их содержание в интактном сосуде Оценку механической прочности исследуемых сосудов проводили на базе Томского регионального центра коллективного пользования Томского государственного университета При выполнении измерений использовали стандартную испытательную машину instron 3343 (США). Интактные и децеллюляризо-ванные сосуды рассекали на кольца шириной 2 мм, которые распускали на полоски длиной 8 мм, и закрепляли вертикально в зажимы измерительной машины Фиксировали нагрузку при разрыве и надрыве образца (Н), а также удлинение образца при разрыве и при надрыве (мм), (датчик нагрузки 50 Н, зажимная длина образца составила 4-5 мм, ширина 2 мм, толщина 0,5 мм, скорость передвижения траверсы 5 мм/мин ) Изменение механической прочности де-целлюляризованных сосудов выражали в процентах, принимая за 100% прочность интактных сосудов. Полученные данные анализировали при помощи программы SPSS Statistics 17 0 Фактические данные представлены в виде Me (Q1-Q3). Для определения характера распределения полученных данных использовали критерий нормальности Шапиро - Вилка Сформированные выборки не подчинялись закону нормального распределения, поэтому для проверки статистических гипотез были использованы непараметрические критерии Для проверки однородности парных или зависимых выборок был использован Т-критерий Вилкоксона (Wilcoxon mached pairs test) Различия считали достоверными при уровне значимости р<0,05. Результаты и обсуждение Типичная морфологическая картина интактного и децеллюляризованного сосудов представлена на рис 1 л Vî3* j " \ \ ;. Ч.f ■* i ifXi* Рис. 1. Стенка внутренней грудной артерии: А - интактное состояние; Б - после воздействия детергентов SDS и Triton X-100; 1 - коллагеновые волокна; 2 - гладкомышечные клетки; 3 - лакуны; 4 - остатки хроматина; 5 - ядра клеток; 6 - внутренняя эластическая мембрана. Окр.: гематоксилин, эозин. Ув. х1000 Видно, что в результате децеллюляризации из сосуда удалось полностью удалить клеточные элементы. При этом сохраняется сложная пространственная структура сосудистой стенки (рис. 1 Б). Результаты, отражающие изменение структуры сосудов в процессе их децеллюляризации, приведены в таблице Представленные данные показывают, что под воздействием детергентов на каждом этапе отмечается достоверное уменьшение содержания клеток по сравнению с предыдущим этапом, а к моменту окончания децеллюляризации клеточные компоненты стенки полностью исчезают Гены & Клетки Том X, № 2, 2015 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 63 Таблица. Динамика уменьшения количества клеток в процессе децеллюляризации фрагмента внутренней грудной артерии, Ме (Q25-Q75) Воздействие на сосуд Показатель Исходное состояние SDS 30 мин. SDS 1ч. SDS 1 ч. + Tритон X-100 30 мин. SDS 1 ч. + Tритон X-100 1ч. Количество клеточных компонентов 355 289 125 54 0 стенки сосуда (на 10 полей зрения) (351-360) (240-299)* (121-133)* (50-55)* * * - статистически значимое различие, по отношению к предыдущему воздействию (р<0,05). Однако имеются данные, что при контакте с детергентами происходят значимые изменения и в соединительной ткани матрикса [19]. Для проверки этого обстоятельства, применительно к нашим объектам, было проведено иммуногистохимическое исследование сосудов на коллагены i и iii типов. При иммуногистохимическом исследовании фрагментов интактных сосудов было установлено, что тонкие коллагеновые волокна (i тип) определяются в медии и интиме, а толстые коллагеновые волокна (iii тип) только в адвентиции (рис. 2 А). В ходе обработки сосудов детергентами в течение двух часов наблюдалось уменьшение содержания коллагеновых волокон i типа (рис. 2 Б). По сравнению с количеством коллагеновых волокон i типа в интактном сосуде, это уменьшение составляет 20%. По нашим данным, более значимое уменьшение содержания коллагеновых волокон наблюдается в медии, чем в интиме В адвентициальной оболочке, после воздействия детергентов в течение двух часов, наблюдается снижение количества коллагеновых волокон iii типа по сравнению с интактным сосудом на 14%. Эти результаты свидетельствуют о том, что использованный нами способ децеллюляризации не привел к фатальному изменению коллагеновой основы сосудистой стенки Следовательно, децел-люляризованный сосуд в значительной степени сохраняет свою механическую прочность Это нашло подтверждение при исследовании механической прочности децеллюляризованных сосудов На рис. 3 представлены механограммы, отражающие результаты испытания механической прочности исследуемых сосудистых образцов Во всех случаях разрушение образцов протекало в два этапа - полному разрыву предшествовал надрыв образца. Интактные образцы внутренней грудной артерии начинали разрушаться при усилии 0,304 Н ± 0,1 (удлинение на 1,18 мм), а децеллюляризованные образцы - при усилии 0,140 Н ± 0,1 (удлинение на 2,66 мм). Полный разрыв интактных образцов происходил при усилии 0,500 Н ± 0,2 (удлинение на 1,75 мм), а децеллюляризованных - при усилии 0,295 Н ± 0,1 (удлинение на 3,07 мм) Критерием оценки прочности сосудов являлась величина нагрузки, при которой образцы начинали разрушаться Снижение сопротивляемости нагрузкам, по нашему мнению, может быть обусловлено отсутствием клеточного компонента и изменением пространственной структуры волокон, формирующих экстрацеллюлярный матрикс Рис. 2 Стенка маммарной артерии: А - интактное состояние; Б - после воздействия детергентов SDS и Triton X-100; 1 - тонкие коллагеновые волокна в intima и media; 2 - толстые коллагеновые волокна в адвентиции; 3 - внутренняя эластическая мембрана. Иммуногистохимическая реакция с антителами к коллагенам I и III типов. Ув. х1000 Гены & Клетки Том X, № 2, 2015 64 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ А Б Рис. 3. Изменение механической прочности маммарных артерий в интактном состоянии 2А) и после воздействия детергентов SDS и Triton X-100 2Б). По оси ординат - нагрузка 2Н), по оси абсцисс - удлинение образца 2мм); 1 - надрыв образца; 2 - полный разрыв образца. Все образцы выделены разными цветами Таким образом, изменения в структуре маммарной артерии, происходящие в результате децеллю-ляризации, приводят к снижению механической прочности сосуда на 54% по сравнению с интактным сосудом. Полученные сведения могут быть использованы для создания нового поколения сосудистых протезов малого диаметра Благодарности Выражаем свою благодарность за помощь в проведении испытаний Томскому региональному центру коллективного пользования ТГУ, Томск, ckp.tsu.ru.

About the authors

Sh. D Akhmedov

Research Institute for Cardiology

V. A Lugovsky

Research Institute for Cardiology

Email: vladimirlugovskij@yandex.ru

S. L Andreev

Research Institute for Cardiology

M. S Rebenkova

Research Institute for Cardiology

Y. V Rogovskaya

Research Institute for Cardiology

I. M Skurihin

Research Institute for Cardiology

Yu. Yu Vecherskiy

Research Institute for Cardiology

S. A Afanasyev

Research Institute for Cardiology

References

Supplementary files