The role of EF-hand Са2+/Mg2+-binding tescalcin protein in cell proliferation and differentiation

Full Text

Введение Кальций - один из важнейших металлов в живом организме. В качестве универсального вторичного посредника он играет важнейшую роль в сигнальной системе клетки и, таким образом, вовлечен в регуляцию жизненно важных процессов: мышечное сокращение, пролиферацию и дифференцировку клеток, клеточный цикл, апоптоз и прочие физиологические процессы В основе работы кальция в качестве вторичного посредника, или мессенджера, лежит динамика изменений концентрации свободного Са2 + с субмикромолярных значений (~10-7 моль) до миллимолярных (~10-5 моль) в возбужденной клетке под влиянием внеклеточного импульса [1]. Изучение EF-hand Са2+-связывающих белков связано с их исключительной ролью в детекции флуктуаций внутриклеточной концентрации свободных ионов кальция Создаются и совершенствуются программы поиска и предсказания еще не открытых белков с EF-hand мотивами, которые могут стать мишенью исследований и лекарственного воздействия [2]. Одним из интересных EF-hand Са2+-связывающих белков является тескалцин, который участвует в процессах пролиферации и дифференцировки клеток Также было предложено использовать тескал-цин в качестве маркера диагностики и эффективной онкомишени (англ. oncotarget) в случае рака толстой кишки [3] мых различных биологических процессах. Наиболее часто среди всех Са2+-связывающих мотивов встречается EF-hand [4], впервые описанный в 1973 году на примере Ca2+-связывающего белка парвальбуми-на [5]. EF-hand состоит из 29 аминокислотных остатков (а. о), представляющих собой Са2+-связывающую петлю, фланкированную двумя спиралями - E и F [6]. Каноничная Са2+-связывающая петля занимает 12 а о и предоставляет 6 лигандов для связывания Са2+, которые обычно обозначают как X, Y, Z, -X, -Y, -Z , где X первый лиганд, а -Z последний Аминокислотные остатки, участвующие в связывании ионов кальция и создании Са2+-связывающей петли, высоко консервативны [7]. Структура «белок-Са2+» дополнительно стабилизируется множеством водородных связей прочих а о , напрямую не участвующих в качестве лигандов [8] Разнообразие EF-hand мотивов Помимо EF-hand мотива с каноничным типом Са2+-связывающей петли, встречаются другие типы EF-петли, которые можно разделить на четыре группы, три из которых сохраняют пентагональную бипи-рамидальную конфигурацию связи с Са2+ [9]. Первая группа с неканоничным строением EF-hand петли представлена белками, Са2+-связывающая петля которых имеет каноничную длину в 12 а о , однако либо короче и компактнее обычных (в случае если последним лигандом в позиции 12 является аспартат), либо имеет увеличенное количество карбонильных групп полипептидной цепи (например, у белка Arabidopsis thaliana, схожего с кальцинейри-ном B) [10]. Гены & Клетки Том X, № 1, 2015 ОБЗОРЫ 29 Вторая группа неканоничных EF-hand петель представлена так называемыми псевдо-EF-hand «ф-hand» петлями, у которых есть 14 а. о. вместо обычных 12 (позиции лигандов 1, 4, 6, 9). Псевдо-EF-hand-петля связывает кальций в основном за счет лигандов по-липептидной цепи, а не боковых цепей и предоставляет для связывания Са2+ необычные лиганды +X, + Y, +Z [7]. К третьей группе относят EF-hand последовательности, которые короче канонической (11 а. о. ). Эти петли связывают Са2 + благодаря альтернативной конформации, возможной за счет участия в качестве лигандов атомов кислорода основной полипеп-тидной цепи и образованию дополнительной водородной связи через молекулу воды [11]. Существует еще один способ связывания Са2 + неканоническими EF-hand петлями Этот способ заключается в смене координационной геометрии комплекса «белок-Са2 + »: вместо пентагональной бипирамидальной образуется октаэдрическая конформация Обычно в этом случае в связывании кальция участвует только N-конец EF-петли [12]. N- и C-концы EF-hand Са2+-связывающей петли различны. N-конец петли более вариабелен среди белков подсемейств, в то время как C-конец всегда высокоструктурирован и связан с Са2+-связывающей петлей парного мотива [13]. функционирование EF-hand мотивов Белки с одиночным EF-hand мотивом встречаются очень редко: такой одиночный мотив был обнаружен среди белков A. thaliana, а также в белке тескалци-не, которому посвящен этот обзор Структурной единицей одиночных EF-hand мотивов остается мотив, а не домен из пары Это было доказано в ходе эксперимента по созданию химерного белка: отдельный EF-hand мотив был перенесен в структуру белка-хозяина, в норме не содержащего EF-hand мотива. После переноса Са2+-связывающая способность мотива сохранилась [7, 10]. Подавляющее большинство EF-hand мотивов объединено в пары, и только в парах они взаимодействуют наиболее эффективно, связывая ионы кальция. Пара представляет собой продолжительную полипептидную цепь, связанную короткой линкерной последовательностью, формируя пучок из 4 амфи-патических спиралей, скрывающих в центральной части гидрофобное ядро [14]. Сообща пара мотивов связывает два иона кальция, располагающихся на расстоянии 11 Ä друг от друга [15]. Самым маленьким белком, содержащим всего одну пару EF-hand мотивов, является кальбиндин D9K [16]. Подавляющее большинство белков содержит 2 пары EF-hand (кальмодулин), 4 пары, 6 пар и т. д. Существуют белки с нечетным числом EF-hand мотивов: три-EF-hand (парвальбумин, онкомодулин), пента-EF-hand белки (кальпаин, гранкальцин). Все они имеют одну неспаренную EF-hand Интересно, что этот одиночный мотив участвует в образовании димеров: неспаренные EF-hand мотивы каждой частицы образуют пару Склонность к образованию пары у EF-hand мотива настолько высока, что в искусственно созданной смеси субъединиц димеризация спонтанна, причем гетеродимеры образуются чаще гомодимеров [16]. Для тескалцина также описана способность к диме-ризации [1]. Пара EF-hand мотивов связана между собой функционально и структурно. Две Са2+-связывающих петли соединяются коротким антипараллельным ß-листом, а два EF-hand мотива связываются обширным гидрофобным соединением между спиралями [13]. Спаривание EF-hand мотивов увеличивает сродство каждой EF-hand к кальцию и помогает кооперации двух мотивов в связывании Са2 +. Кооперативный эффект является положительным, если связывание первого Са2 + белком увеличивает сродство ко второму иону Са2 +. Для большинства EF-hand белков характерен положительный кооперативный эффект. Это особенно важно для Са2+-сенсоров, EF-hand белков, связывающих растущие концентрации кальция в клетке. Положительный кооперативный эффект Са2+-связывающего домена способствует быстрой смене состояний: белок остается неактивным до тех пор, пока концентрация Са2+ в цитоплазме не достигнет порогового значения [17]. Интересно, что псевдо-EF-hand мотивы всегда составляют пару только с каноничным EF-hand мотивом, в то время как каноничные могут объединяться как с псевдо-, так и с себе подобными структурами [7] Кальций-связывающая способность EF-hand белков Семейство EF-hand белков на основании Са2+-связывающей способности подразделяется на две группы: белки с низкой Са2+-связывающей способностью, так называемые Са2+-буферы (структурные; например, парвальбумин), которые связывают кальций со сродством менее 100 нМ и не подвергаются каким-либо серьезным конформационным изменениям, в то время как Са2+-сенсоры, EF-hand белки с высокой Са2+-связывающей способностью (регуляторные; например, кальмодулин), обладают способностью связывать растущие концентрации кальция в пределах 10-5-10-6 М и претерпевают Са2+-индуцированные конформационные изменения, что позволяет им взаимодействовать с целевыми белками и передавать сигнал дальше по цепи [1]. Ca2+-сенсоры вовлечены в большое количество процессов, где выполняют различные функции: регуляция ионных каналов, моделирование ферментативной активности, сокращение мышц Ca2+-буферы модулируют Ca^-сигнал во времени и пространстве, связывают свободный кальций, чтобы провести его через клетку или удалить потенциально опасный катион из цитоплазмы, поддерживают гомеостаз этого иона К тому же основное сродство к Ca2+ выше у буферов, чем у сенсоров [18]. Функционирование белка в качестве буфера или сенсора зависит от характеристик его EF-hand Ca2+-связывающих доменов, а те, в свою очередь, от типа и особенностей составляющих их EF-hand мотивов [19]. Стоит отметить, что тескалцин является, скорее всего, сенсором. Также на связывание Са2+ влияют следующие факторы: собственная связывающая способность EF-hand мотива, кооперативный эффект пары EF-hand мотивов, избирательность к Mg2+ и другим двухвалентным ионам, взаимодействие с целевым белком [9]. Рентгеноструктурный анализ белка в свободном состоянии и в соединении с Са2+ показывает, что после связывания Са2+ конформация белка меняется: EF-hand домен обнажает обширную гидрофоб Гены & Клетки Том X, № 1, 2015 30 ОБЗОРЫ ную поверхность; через которую и идет соединение Специфичность к целевому белку этой гидрофобной площадки достигается набором аминокислотных остатков на ее поверхности Такие процессы как кон-формационные изменения в ответ на связывание ионов, взаимодействие с целевым белком и сродство к Са2+ энергетически взаимосвязаны. Энергетический баланс соединения играет важнейшую роль и определяет механизм взаимодействия [20]. Некоторые EF-hand домены могут также связывать и другие двухвалентные катионы помимо кальция, такие как Mg2+ и Zn2+. Это определяется их свойством избирательности к связыванию ионов Условно разделяют смешанные Са2+-связывающие петли и Са2+-специфичные. Смешанные петли связывают Mg2+ в физиологических условиях субми-кромолярных концентраций Ион магния похож на ион кальция, но гораздо меньше его размером. Поэтому Mg2+ обычно связывается шестью лигандами в конфигурации октаэдра, и последний бидентатный лиганд глутамата или аспартата, ключевой для связывания Са2 + , не принимает участия в связывании Mg2+. Для смешанных петель концентрации Mg2+ оказывают влияние на связывание Са2 +. Например, в кальмодулине физиологические концентрации Mg2+ ослабляют связывание кальция EF-hand доменом N-конца в отсутствии целевого белка [21]. В соответствии с результатами измерений аффино-сти рекомбинантного тескалцина с Са2+ было выдвинуто предположение, что тескалцин имеет сродство к ионам магния и находится в клетке в Mg^-связанной форме [1]. Белки подсемейства S100 связывают, в отличие от других EF-hand белков, ионы Zn2+ и Cu2+. Кроме того, они могут составлять олигомеры более высокого порядка, связанные дисульфидными мостиками [22]. Ген тескалцина и структура белка, гомологи Тескалцин, также известный как гомологичный кальцинейрину В белок 3 (англ. Сalcineuгin B homologous protein 3, CHP3), в организме человека кодируется геном TESC и представляет собой белок с молекулярной массой 24 кДа Он принадлежит к семейству EF-hand Ca2+- и Mg2+-связывающих белков, подсемейству кальцинейрина B ген TESC содержит 8 экзонов и локализуется на 12 хромосоме человека Впервые тескалцин был открыт в эмбриональном яичке мыши на 11,5 день после оплодотворения Открытая рамка считывания гена TESC мыши включает 642 пар нуклеотидов (п н ), кодирующих белок из 214 а. о. [18]. Возможны, по меньшей мере, три изоформы тескалцина, моделируемые с помощью альтернативного сплайсинга матричной РНК (мРНК) этого гена [23]. Кроме EF-hand Ca2+-связывающего домена структура тескалцина мыши также содержит N-концевой миристоиловый мотив и несколько сайтов фосфорилирования [18]. Наличие сайтов миристоилирования показано с использованием рекомбинантного тескалцина, несущего на конце гексагистидиновую метку. Экспрессия этого рекомбинанта в клетках Escherichia coli вместе с дрожжевой N-миристиолтрансферазой 1 приводила к специфичному присоединению [3И]миристино-вой кислоты [1]. N-миристоилирование тескалцина может запускать Ca2+-индуцированный меристоило-вый переключатель, что облегчает взаимодействие с эффекторами или мембранными компартментами Ca2+-индуцированный меристоиловый переключатель описан также в других Ca2+-связывающих белках, например у рековерина [24]. Значительная степень гомологии тескалцина была обнаружена к трем Са2+-связывающим белкам: гомологичный кальцинейрину белок 1 (CHP1), гомологичный кальцинейрину белок 2 (CHP2) и кальцинейрин B (CnB) Все три вышеперечисленных белка ацилированы N-миристиоловым остатком и предполагается, что благодаря этому они могут выполнять функции, связываясь с мембраной [1, 25]. Кроме того, тескалцин человека имеет 96,7% идентичности с тескалцином мыши [25] и, по-видимому, является прямым ортологом Было показано, что тескалцин высококонсервативен среди многих позвоночных организмов [23]. Тескалцин отличается от CHP1 и CHP2, поскольку в его последовательности отсутствует сигнал ядерной локализации. Он имеет только один функциональный EF-hand мотив, в то время как CHP1 имеет два мотива Все три белка отличаются по своему расположению в организме, в отличие от CHP1, CHP2 был обнаружен и в опухолевых тканях Последовательность CHP1 высоко консервативна, этот белок широко экспрессируется в тканях Он участвует в транспорте везикул во время экзоцитоза, а также их слиянии с мембраной CHP2 был впервые найден в тканях пациентов с раком печени Сверхэкспрессия CHP2 изменяет опухолеродную способность клеток HEK293 in vivo. Клетки, экспрессирующие CHP2, были более агрессивны, осуществляя инвазию в печень, селезенку и почки, что не наблюдалось в контроле CHP2 и CHP3 обнаружены только у позвоночных, в отличие от CHP1 [26] Связывание металлов, конформация На первый взгляд тескалцин имеет только один EF-hand домен, но при более детальном рассмотрении было выявлено, что его структура содержит дополнительные три спираль-петля-спираль участки, имеющие умеренную гомологию к EF-hand домену Предполагается, что они стабилизируют структуру основного Са2+-связывающего участка. EF-hand домен находится ближе к С-концу белка (110- 145 а. о. ) и имеет вторичную структуру вида спираль-петля-спираль длиной в 29 а о , координирующую всего один катион Са2 + шестью консервативными аминокислотными остатками «петли» (1, 3, 5, 6, 8 и 12) в пентагональной бипирамидальной конфигурации. «Спирали» представлены а-спиралями по 9 а. о. каждая [1, 25]. С. Gutierrez-Ford с соавт. (2003) доказали наличие в структуре тескалцина Са2+-связывающего EF-hand домена, заменив ключевой аминокислотный остаток аспарагиновой кислоты в позиции X предполагаемого EF-hand домена на аланин (D123A). Тескалцин дикого типа показал Са2+-индуцированный сдвиг флуоресценции триптофана, а мутант D123A не дал таких результатов Эти исследования показали, что за Са2+-связывающую способность тескал-цина ответственен именно EF-hand домен Кроме того, экспрессия мутанта D123A в клетках яичника китайского хомячка CHO-K1, трансфицированных им, была на значительно более низком уровне, чем экспрессия тескалцина дикого типа. Авторы исследования предположили, что связывание кальция стабилизирует структуру тескалцина, что мутантному Гены & Клетки Том X, № 1, 2015 ОБЗОРЫ 31 белку по причине отсутствия функции недоступно [1]. Впоследствии те же авторы показали, что мутация D123A ингибирует взаимодействие тескалцина с его партнером - субъединицей 4 сигналосомы COP9 (CSN) [27]. Конформационные изменения в структуре тескал-цина дикого типа также подтверждены результатами спектроскопии циркулярного дихроизма Анализ результатов показал, что мутация D123A существенно не изменяет вторичную структуру тескалцина, и подтвердил отсутствие функции связывания кальция у мутантного белка: изменения спектра по причине связывания иона кальция тескалцином дикого типа отсутствовали в аналогичных спектрах мутанта D123A [1]. Сродство тескалцина к ионам кальция находится в микромолярном диапазоне EC50 Таким образом, тескалцин, скорее всего, cенсор кальция. Также была показана афинность тескалцина к ионам магния Авторы предположили, что в покоящейся клетке тескалцин находится в Mg^-связанной форме, что может представлять собой неактивную конфигурацию По-видимому, во время резкого повышения концентрации ионов кальция в клетке ионы магния в Mgг+-связывающем сайте могут заменяться ионами кальция [1]. В экспериментах с рекомбинантным белком было показано, что тескалцин человека может существовать как в мономерной, так и в гомодимерной форме, причем связь субъединиц в димере осуществляется за счет дисульфидного мостика. Обе формы показали свою стабильность, и мономеры могут спонтанно димеризоваться. В отличие от других EF-hand Са2+-связывающих белков, электрофоретическая подвижность тескалцина не изменяется в присутствии Са2+. Кроме того, способность тескалцина связывать кальций не изменяется в присутствии дитиотреола [1]. Субклеточная и тканевая локализация тескалцина Тескалцин является преимущественно растворимым белком цитозольной фракции Было показано, что трансфицированный тескалцин в наибольшей степени сосредоточен вокруг ядра, в перинуклеар-ном пространстве и в непосредственной близости от эндоплазматического ретикулума. Особенно богаты тескалцином мембранные области ламеллоподий, складок и выростов мембраны (англ. Membrane ruffles) в присутствии сыворотки и активного Rac-1 (англ. Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1) белка На субклеточную локализацию тескалцина в траснфицитрованных клетках не оказали влияния мутации EF-hand или N-меристиолового мотива [1]. Интересно, что в клетках линии K562 со сверхэкспрессией тескалцина, основной пул рекомбинантного тескалцина находился в ядре Это позволяет предположить, что тескалцин может быть вовлечен в такие ядерные процессы как транскрипция и реконструкция хроматина [28] Тканевая локализация тескалцина довольно разнообразна Было показано, что в эмбрионе мыши наибольшая концентрация тескалцина наблюдается в яичке, тогда как в организме взрослых животных - в тканях сердца, желудка и мозга. Тескалцин экспрессируется исключительно в эмбриональных половых органах самца и никогда - самки [18]. Тескалцин человека имеет сходную преимущественную локализацию: наибольшая концентрация тескалцина в организме взрослого человека наблюдается в тканях сердца, меньшая - в слюнных железах, наименьшая - в половых железах, хотя тескалцин был также обнаружен в поджелудочной железе, костном мозге и надпочечных железах, а также в некоторых опухолевых культурах клеток (HeLa, HL-60) и плаценте [25, 27, 29] Взаимодействие тескалцина с ^У^-антипортом 1 типа (NHE1) NHE1 представляет собой интегральный белок, состоящий из двух доменов: цитоплазматического C-домена, в виде а-спирали взаимодействующего с сигнальными молекулами, и мембранного N-домена, создающего ионообменный канал Взаимодействие с тескалцином было отрыто с использованием двугибридной дрожжевой системы, где С-концевой домен NHE1 использовался в качестве «наживки». Тескалцин, как и гомологичные ему CHP1 и CHP2, взаимодействует с тем же юкстамембранным доменом цитоплазматического C-конца NHE1 [25, 30]. Взаимодействуя с NHE1, тескалцин влияет на важнейшие физиологические функции: стабилизацию pH внутри клетки, активацию NHE1 в ответ на злокачественное перерождение клетки, обеспечение необходимого количества H+ в тканях сердца [31]. Тескалцин оказывает положительное действие на NHE1, увеличивая его активность, интенсивность перемещения ионов, полупериод его существования в клеточной мембране, тем самым обеспечивая регуляцию таких процессов, как клеточная пролиферация, дифференцировка и опухолевая трансформация [32] Однако некоторые исследования подчеркивают эффект ингибирования активности NHE1 тескалци-ном в неактивной клетке [30]. Также было показано, что NHE1 вовлечен в адаптацию к внутриклеточному ацидозу в случае ишемии. Тескалцин в связи с NHE1 оказывает такое же действие, что делает его возможной мишенью для предотвращения таких неблагоприятных последствий, как некроз и аритмия [25]. Совсем недавно появились результаты исследования участия тескалцина в развитии головного мозга человека Было выяснено, что тескалцин взаимодействует с геном RELN (rs2299403; ри-лин) и, хотя молекулярные основы взаимодействия еще не известны, было показано, что в периоды раннего развития мозга наблюдается значительный уровень экспрессии генов тескалцина и рили-на. Рилин - протеаза, экспрессирующаяся в тканях мозга, ответственная за направление нейронной миграции и сигнализации в период развития; впоследствии было обнаружено, что рилин играет роль в развитии таких психических заболеваний как шизофрения, биполярное расстройство на ранних стадиях возникновения, а также оказывает влияние на высшие когнитивные процессы [33]. Хотя до сих пор неясно, как тескалцин влияет на структуру серого вещества гиппокампа взрослых людей, была высказана мысль, что тескалцин играет важную роль в клеточной дифференцировке и пролиферации для создания объема гиппокампа и развития мозга В период развития тескалцин экспрессируется во всех частях мозга, но особенно большой уровень продукции наблюдается в развивающихся конечном мозге, среднем мозге и желудочках мозга [33]. Авторы исследования использовали технику мультимодальной визуализации Одним из Гены & Клетки Том X, № 1, 2015 32 ОБЗОРЫ исследуемых параметров стал объем гиппокампа. Уменьшение объема гиппокампа оказалось одним из самых явных визуализированных маркеров глубокой депрессии и посттравматического стресса по сравнению со всеми остальными нервно-психическими расстройствами. Поскольку тескалцин напрямую взаимодействует с NHE1, который вовлечен в клеточную пролиферацию, дифференци-ровку, миграцию, а также влияет на объем клетки и организацию цитоскелета, авторы предположили, что влияние тескалцина на NHE1 и есть тот самый путь, через который тескалцин осуществляет воздействие на изменение объема гиппокампа [33] В настоящее время нет достаточно данных, чтобы объяснить молекулярный механизм воздействия тескацина на дифференцировку. Это может быть связано и с его эффектом на траснкрипционные факторы, и взаимодействием с NHE1 Участие тескалцина в процессах дифференцировки и пролиферации клеток В ходе исследований тескалцина в клеточных линиях HL60 и К562 было замечено изменение его уровня в процессе дифференцировки В последствии было показано, что тескалцин является необходимым фактором дифференцировки первичных мегакариоцитов и клеток линии К562 Сверхэкспрессия тескалцина в опухолевой культуре клеток K562 приводит к спонтанной диффе-ренцировке по мегакариотическому пути, индуцируя такие события, как полиплоидизацию, синтез характерных антигенов на поверхности клетки и пролиферацию В то же время нокдаун тескалцина путем РНК-интерференции значительно замедляет дифференцировку [28]. Более поздние исследования на мышах с нокаутом тескалцина не показали аналогичных изменений в системе кроветворения, и вообще не нашли фенотипических изменений Авторы предположили, что гомологи тескалцина CHP1 и CHP2 могут компенсировать нокаут тескал-цина [34] Существует другое объяснение, почему физиологический эффект нокаута не проявился в фенотипе мышей: в генотипе мышей нокдаун был неполный и приводил к транскрипции мРНК, содержащей комбинацию экзонов 1, 2, 7 и 8, так что в клетках образовывался белок, содержащий уникальный C-конец тескалцина [27]. Для понимания роли тескалцина в дифференцировке клеток необходимы дополнительные исследования, включающие более детальный анализ фенотипа нокаутных мышей Например, необходимо сравнить динамику восстановления популяции мегакариоцитов после потери крови, или в эмбриональном развитии Не исключено, что она будет замедлена Действительно, нокдаун тескалцина в клетках не приводил к полной остановке дифференцировки, а только к существенному замедлению процесса Тескалцин контролирует экспрессию факторов транскрипции семейства Ets через PMA-индуцированный сигнальный ERK-путь (англ. Extracellular signal-regulated kinase). Например, в эритролейкемических линиях клеток К562 и HEL, испытывающих недостаток тескалцина, блокирован синтез таких факторов транскрипции как Fli-1, Ets-1, и Ets-2 Эти транскрипционные факторы участвуют не только в гемопоэзе, но и в развитии нервной и сердечнососудистой систем [27-28]. Следова тельно, в процессе мегакариотической диффе-ренцировки тескалцин необходим для координированного взаимодействия активации ERK-каскада и экспрессии Ets генов. Кроме того, тескалцин вовлечен в процесс дифференцировки и созревания полиморфно-ядерных гранулоцитов под контролем сигнального ERK-пути. Интересно, что регуляция экспрессии тескалцина может происходить как на транскрипционном, так и на пост-транскрипционном уровне; клеточная дифференцировка может протекать и с увеличением, и с уменьшением активного тескалцина в клетке, что в некоторой степени связано с типом вещества-индуктора сигнального ERK-пути [29]. Тескалцин является одним из факторов, позволяющих из одного типа клеток-предшественников в процессе дифференцировки получить различные специализированные типы клеток Это определяет интерес к его возможному использованию в клеточной терапии Взаимодействие тескалцина с субъединицей 4 сигналосомы COP9 Действительно, совсем недавно был обнаружен еще один белок, с которым взаимодействует тескал-цин - это субъединица 4 сигналосомы COP9 (CSN). COP9 сигналосома - эволюционно консервативный мультибелковый комплекс, состоящий из 8 субъединиц, обозначаемых CSN1-8 (с номерами от одного до восьми), и имеющий чрезвычайную гомологию по отношению к регуляторной частице 26S протеасомы CSN первоначально была определена как репрессор фотоморфогенеза у арабидопсиса В настоящее время показано участие CSN во многих клеточных процессах и этапах развития различных эукариотических организмов [35]. Большая часть субъединиц комплекса содержат уникальный PCI (Proteasome-Cop9-eIF3) домен. Исследования COP9 комплекса у разных организмов охарактеризовали сигналосому в качестве модулятора широкого спектра жизненно необходимых процессов: эмбриогенез, клеточный цикл, репарация ДНК, сигнальный путь MAPK (митоген-активируе-мая протеинкиназа, англ. Mitogen-activated protein kinase) и сигнальная система стероидных гормонов, аксональный транспорт, дифференцировка. Регулируя эти процессы, CSN влияет на транскрипцию, фосфорилирование и стабильность белков [36]. COP9 комплекс также регулирует деградацию белка, так как может влиять на активность cullin-RING-E3 убиктивиновой лигазы. С CSN взаимодействует свыше 50 белков, но только два с субъединицей CSN4: торсин А и тескалцин [27]. Тескалцин специфично взаимодействует с CSN4 через ее PCI домен по кальций-зависимому механизму Белок-белковое взаимодействие было показано при использовании рекомбинантных очищенных белков с помощью двугибридной дрожжевой системы и культур эукариотических клеток Нокдаун тескалцина стимулирует активность CSN. Гомологи тескалцина CHP1 и CHP2 не взаимодействуют с COP9 комплексом В исследовании также показано, что тескалцин может взаимодействовать с CSN5, но взаимодействие слабее по сравнению с CSN4. Нокдаун те-скалцина вызывал изменение в уровне экспрессии факторов транскрипции p53 и c-Jun в эритролейкемических линиях клеток К562 и HEL [27]. Гены & Клетки Том X, № 1, 2015 ОБЗОРЫ 33 Ассоциация тескалцина с онкологическими заболеваниями Потенциальное использование тескалцина в качестве маркера для диагностики и как эффективной онкомишени в случае рака толстой кишки (колоте-ральный рак, англ . Colorectal cancer, CRC) получило недавно экспериментальное подтверждение ген TESC имеет высокий уровень экспрессии в тканях рака толстой кишки по сравнению с нормальными тканями человека В тканях и сыворотках, пораженных CRC, тескалцин сверхэкспрессируется, в то же время нокдаун TESC ингибирует Akt-зависимый NF-kB путь, предотвращая фосфорилирование основных белков пути, что не наблюдается в случае с контрольной киРНК. Akt-фосфорилирование и активация NF-kB и p65 снижены . Нокдаун тескал-цина уменьшает выживаемость раковых клеток in vitro . Применение киРНК, вызывающей нокдаун гена TESC, на 80% снижает развитие опухоли в случае рака толстой кишки [3]. Уровень экспрессии те-скалцина в раковых тканях значительно коррелирует с клинико-патологическими повреждениями тканей раковых больных: поражение лимфатических узлов, стадия Дюкса, глубина инвазии, степень дифферен-цировки опухоли В образцах сыворотки концентрация тескалцина в раковых тканях была больше, чем в нормальных, но между образцами разных стадий рака не было разницы в концентрациях тескалцина [3] Тескалцин каким-то пока неясным образом влияет на экспрессию PTEN, супрессора большинства опухолей В то же время он влияет на клеточную пролиферацию, клеточный рост и онкогенность опухоли CRC . Авторы выдвигают гипотезу, что тескалцин может регулировать пролиферативную активность клеток рака толстой кишки через Akt-зависимый NF-kB сигнальный путь . Это позволяет предположить будущее использование тескалцина в качестве белка-онкомишени [3] На данный момент отсутствует должная степень прогнозирования рака толстой кишки, и использование уровня экспрессии тескалцина в качестве маркера диагностики могло бы послужить увеличению эффективности прогнозирования CRC . Так, общая средняя выживаемость больных раком толстой киш ки с высоким уровнем экспрессии тескалцина ниже выживаемости больных с низким уровнем экспрессии этого белка [3]. Взаимодействие тескалцина с NHE1 вовлечено в патогенез острого миелоидного лейкоза (FLT3-ITD + AML). Было показано, что в клеточных линиях острого миелоидного лейкоза MOLM-13 и MV4-11 тескалцин сверхэкспрессируется, а его нокдаун с помощью киРНК вызывает ацидоз и апоптоз раковых клеток . Кроме того, TESC - один из генов, экспрессия которого наблюдается в период формирования устойчивости раковых клеток к противоопухолевому препарату сорафенибу (Sorafenib) . Ингибирование NHE1 также вызывает подавление устойчивости и более продолжительный эффект от лечения сора-фенибом [37] Заключение Таким образом, показана ассоциация тескалци-на с онкологическими заболеваниями и возможность его применения в качестве диагностического онкомаркера . Исследования показали его участие в развитии головного мозга человека и, на клеточном уровне, в процессе дифференцировки определенных клеток . Описано взаимодействие тескалцина с субъединицей 4 сигналосомы COP9, NHE1 и его участие в сигнальных путях митоген-активируемой протеин-киназы и регулируемой транскрипции генов . Для более глубокого понимания возможных молекулярных механизмов регуляции клеточных функций тескал-цина необходимы дальнейшие исследования

About the authors

K. G Kolobynina

Kazan (Volga Region) Federal University

V. V Solovyeva

Kazan (Volga Region) Federal University

V. Z Slepak

University of Miami Miller School of Medicine

A. A Rizvanov

Kazan (Volga Region) Federal University

Email: Albert.Rizvanov@kpfu.ru

References

Supplementary files