Characteristics of neoosteogenesis in the model of critical defect of rats' parietal bone using traditional and three-dimensional morphometry

Full Text

Введение Вопросы регенерации костной ткани привлекают огромное количество исследователей. В хирургии и стоматологии существует ощутимая потребность в разработке новых средств, увеличивающих эффективность костной пластики, имплантации и пародонтологического лечения. Для изучения эффективности и безопасности различных остеопластических материалов, клеточных продуктов и новых технологий для костной пластики широко используют модель критического дефекта теменных костей крыс [1-4]. Для оценки остеогенеза применяются рентгенологические [5] и гистологические методы исследования, которые позволяют определить объем и площадь, занимаемые костной тканью в регенерате. Однако для морфометрии критических дефектов теменных костей из-за их цилиндрической формы [6, 7] требуются адекватные методы морфометрии, адаптированные к объекту исследования. Помимо этого, особого внимания заслуживают способы подготовки гистологического материала. Традиционные парафиновые срезы не являются оптимальными для этой задачи, так как при их изготовлении трудно избежать деформации материала. Поэтому наиболее интересными представляются серийные срезы образца, заключённого в твёрдые полимерные смолы. В этом случае отпадает необходимость освобождать образец от заливочной среды, которая служит жёсткой основой для препарата и предотвращает его деформацию. Кроме того, этот метод не требует декальцинации образцов, что позволяет использовать в эксперименте тетрациклиноподобные метки, которые связываются с ионами кальция. Классическая методика мечения тетрациклиноподобными флуорохромами подразумевает окраску только фронта минерализации, что выглядит как линия, или, при двойном мечении, как две линии, отграничивающие области костной ткани, образованной в соответствующие сроки. Такой результат неприемлем для модели дефекта теменных костей в связи со сложной формой самого регенерата и неравномерным аппозиционным ростом. Методика должна быть изменена так, чтобы костный регенерат на определенном сроке образования был полностью окрашен соотвествующим флуорохромом. Полное окрашивание регенерата облегчает последующий компьютерный анализ изображения. Прижизненное введение животным флуоресцентных тетрациклиноподобных меток позволит избежать формирования многих экспериментальных групп на разных сроках наблюдения, необходимых для классических методов исследования [8]. Изготовление недекальцинированных срезов, пригодных для изучения флуоресценции, требует заливки в твёрдые среды, обычно эпоксидные смолы или акриловые пластмассы. На сегодняшний момент самыми популярными наборами реактивов для заливки костной ткани являются Osteo-Bed (Polysciences Inc., США) и Technovit (Heraeus Kulzer e-mail: vav-stom@yandex.ru GmbH, Германия). Основные компоненты этих наборов: мономер метилметакрилата, измельчённый полиметилметакрилат и активатор пероксид бензоила. Поскольку метилметакрилат является токсичным для человека [9], желательно заменить его на безопасный аналог, например, мономер этилметакрилата, используемый в стоматологии [10]. Цели настоящего исследования: 1) разработать методику мечения флуорохрома-ми, пригодную для модели критического дефекта теменных костей крыс; 2) отработать наиболее удобный способ заливки образца в этилметакрилат для последующей флуоресцентной микроскопии и морфометрии; 3) разработать способы 30-морфометрии, более точно характеризующие регенерат в области критического дефекта теменных костей крыс; 4) сравнить разработанные нами методы оценки объема регенерата на основе гистологических препаратов с традиционными 20-методиками по данным рентгенографии. материал и методы Исследование проводили на крысах самцах (n=30) линии Sprague-0awley массой 350г. При проведении исследований соблюдались правила гуманного обращения с экспериментальными животными, регламентированные «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приказ МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г). Протокол операции Под внутримышечным наркозом (Золетил (Virbac, Франция) в дозировке 125 мкг/кг) крысам производили поперечный и вертикальный латерально-смещённый разрез кожи головы, формируя треугольный лоскут, при отслаивании которого обнажали теменные кости (рис. 1). Такой дизайн раны позволяет впоследствии избежать расположения зоны разреза мягких тканей и шва непосредственно над костным дефектом, что обеспечивает его герметичность. Посередине сагиттального шва на теменных костях формировали круглое отверстие, после чего рану послойно ушивали. Поскольку критическим у крыс считается дефект костной ткани диаметром больше 4 мм, наименьший диаметр применяемого трепана с учётом запаса величины должен был быть не менее 5 мм [2, 11]. Кроме того, конструкция самого трепана должна исключать перфорацию сагиттального венозного синуса. Для этой задачи наилучшим образом подходят Рис. 1. Схема этапов операции при моделировании критического дефекта теменных костей крысы трепаны, используемые в хирургической стоматологии для открытого синус-лифтинга. Конструкция их рабочей части имеет различные размеры и предусматривает защиту от повреждения подлежащих мягких тканей. В нашей работе использовался и хорошо зарекомендовал себя трепан С-reamer диаметром 5,5 мм и высотой 1,5 мм из набора Neobiotech SLA (Корея) (рис. 2). Данный способ позволяет получить более аккуратно сформированный дефект воспроизводимых размеров в отличие от ранее предложенных способов [1, 12]. Рис. 2. Рабочая поверхность трепана C-reamer из набора Neobiotech SLA для открытого синус-лифтинга, позволяющая выполнять остеотомию без повреждения подлежащих мягких тканей Мечение флуорохромами В послеоперационном периоде крысам последовательно вводили тетрациклиноподобные флуоресцентные маркеры с учетом их совместимости [13]. В качестве первой метки использовался доксициклин (Агрофарм, Россия) в дозировке 25 мг/кг массы тела, в качестве второй - ализариновый красный С (Вектон, Россия) в той же дозировке. Для достижения полного окрашивания регенерата мы модифицировали классическую методику ведения флуорохромов [14]. К началу активной минерализации остеоида (на 8, 9 и 10 сут. после операции) 21 крысе делали внутрибрюшинные инъекции раствора доксициклина. На 15, 16 и 17 сут. эксперимента крысам вводили раствор ализарина красного С для создания границ между метками. На 22, 23 и 24 сут. повторяли инъекции ализарина для полного окрашивания краёв минерализованного регенерата. На 28 сут. эксперимента крыс выводили из эксперимента пятикратной передозировкой Золетила в сочетании с Рометаром. Далее с помощью зуботехнического отрезного диска забирали костный фрагмент свода черепа, который фиксировали в 40% этиловом спирте в течение 24 ч. Рентгенологическое исследование Полученные образцы (n = 21) подвергали прицельной рентгенографии (радиовизиограф Gendex Expert 0C, выдержка 50 мс) (рис. 3). Рентгенограммы оценивали двумя способами. Первый способ заключался в визуальной оценке заполнения дефекта регенератом по балльной шкале от 0 до 4 [11, 15] (табл.). Рис. 3. Рабочее место для проведения прицельной рентгенографии: штатив для датчика собран из входящих комплект к прибору направляющих для его позиционирования Таблица. Балльная шкала оценки заполнения регенератом критического дефекта теменных костей крыс R R (В LQ Описание Иллюстрация 0 в регенерате отсутствует костная ткань 1 рассредоточенные маленькие островки костной ткани 2 костный регенерат только по краям дефекта 3 костные мостики между ближайшими краями дефекта 4 костные мостики между противоположными краями дефекта Второй - в измерении относительной площади регенерата. Для этого на рентгенограммах в программе Adobe Photoshop CS6 (США) выполняли измерение площади костного регенерата и площади самого дефекта. После вычисляли отношение площади регенерата к площади дефекта, то есть относительную площадь регенерата (рис. 4). Использование такой величины позволяет исправить пространственные искажения, которые возникают при позиционировании образцов относительно лучевой трубки или датчика. Подготовка образцов для морфометрии Гистологическая проводка и заключение материала. После фиксации образцы обезвоживали в восходящих спиртах (этанол) и пропитывали этилметакрилатом в течение нескольких суток. Для полимеризации образцов в твёрдые блоки полимера мы отказались от использования уже готовых наборов, содержащих токсичный метилметакрилат, в пользу безопасного этилметакрилата. В ходе сравнения различных химических реактивов мы остановились на этилметакрилате торговой марки АКР-7 (Влад-Мива, Россия), выпускаемого для ортопедической стоматологии. Мономер АКР-7 обладает следующими преимуществами: - не требует очистки, что позволяет получить однородную заливочную смесь без содержания остатков воды, щёлочи и стабилизатора; - флакон АКР-7 имеет оптимальный объём 125 мл), который удобен для хранения и приготовления заливочной смеси прямо в нём, что избавляет от необходимости использовать дополнительную лабораторную посуду; - стоимость АКР-7 меньше, чем стоимость химического реактива этилметакрилата (Вектон, Россия). Способ заключения образца в полимерные блоки полиэтилметакрилата основывался на классической методике Диффорда [16]. К этилметакрилату добавляли перекись бензоила (Вектон, Россия) в количестве 100:1 и прогревали в течении 2 ч. при +60°С. После этого разогретую смесь этилметакрилата и перекиси бензоила разливали по пластиковым баночкам, погружали в них образцы кости и помещали в термостат на +37°С. Через неделю образцы перемещали в другой термостат на +60°С для окончательной полимеризации (рис. 5). Рис. 4. Выделение области дефекта (розовый цвет) и образованного в нём регенерата (зелёный цвет) Рис. 5. Образец свода черепа, заключённый в блок Изготовление шлифов. Для получения точных 3D реконструкций и последующего морфометрического анализа при изготовлении шлифов учитывали следующие требования: 1) образец свода черепа для всех групп исследования позиционировали одинаково по отношению к пиле: плоскость гистологических срезов совпадала с фронтальной плоскостью, при этом сам образец располагали строго перпендикулярно по отношению к поверхности пилы во избежание геометрических искажений; 2) срезы для изготовления шлифов выполняли серийно, без пропусков со строго определённым шагом реза (обычно через каждые 300 мкм); 3) шлифы не освобождали от полиэтилметакрилата, чтобы не деформировать срезы и не искажать истинных размеров регенерата; 4) шлифы не окрашивали во избежание автофлуоресценции гистологического красителя. Срезы изготавливали с помощью закреплённой портативной стоматологической установки с использованием прямого наконечника и стандартного алмазного зуботехнического отрезного диска диаметром 42 мм. Образцы крепились с помощью тисков, которые, в свою очередь, закреплялись на предметном столе со взаимоперпендикулярными векторами движения его поверхности. После выполнения каждого среза к образцу в месте спила приклеивали предметное стекло с помощью цианакрилатного клея и выполняли срез вместе с закреплённым к нему стеклом (рис. 6). Рис. 6. Нарезка материала на самодельном отрезном станке Это не допускало деформации среза в процессе его отпиливания и позволяло делать тонкие срезы толщиной до 200 мкм. Далее срезы шлифовали до толщины 50-60 мкм под контролем микрометра с помощью наждачной бумаги. Шлифы полировали пробковым брусом. Математическая модель «резаный цилиндр» Морфометрия срезов. С помощью люминесцентной микроскопии (микроскоп Leica DM 4000, цифровая камера Leica DFC 310 FX, Германия) с использованием систем светофильтров GFP (возбуждающий фильтр - 470/40, пропускающий - 525/50), «S-Orange» (546/12, 585/40), DAPI ET (350/50, 460/50) визуализировали флуоро-хромное свечение новообразованной костной ткани жёлто-зелёного (доксициклин) и красного цветов (ализариновый красный С). Полученные изображения объединяли в панорамное изображение каждого среза с помощью программы Adobe Photoshop CS6 (США) (рис. 7). Далее на полученных изображениях измеряли периметр, длину и площадь каждой флуоресцентной метки отдельно (рис. 8). Рис. 7. Гистотопограмма теменных костей с регенератом. Флуоресценция ализарина (красный цвет) и доксициклина (зелёный цвет) в области новообразованной костной ткани. Флуоресцентная микроскопия Рис. 8. Гистотопограмма теменных костей с регенератом: разметка для последующей морфометрии. Зелёным (окрашена доксициклином) выделена минерализованная костная ткань, образовавшаяся к концу 14 сут. эксперимента, красным (ализариновый красный С) - образованная к концу 28 сут. Дополнительно измеряли высоту, ширину и площадь дефекта черепа. Данные переносили в Microsoft Excel 2011. С помощью автоматизированной таблицы значения площади и периметра пересчитывали в метрические размеры, получая следующие морфометрические показатели [6, 7]: - T.Ar - площадь дефекта кости. Для определения других параметров все площади и периметры измеряли только в области T.Ar (рис. 9), поскольку нашей целью было оценить характеристики регенерата, заполняющего непосредственно дефект. Такой подход облегчает стандартизацию метода; - Md.Ar.1 - площадь минерализованной костной ткани, содержащей первую метку; - Md.Ar.2 - площадь минерализованной костной ткани, содержащей вторую метку. Пересчёт плоскостных параметров в объёмные. Все вышеперечисленные параметры, использованные для описания каждого среза в отдельности, являются «плоскостными» (2D). Для получения сведений о характере всего регенерата в области дефекта Рис. 9. Схема определения 2D морфометрических параметров на срезе дефекта теменной кости. Первая метка показана зелёным цветом, вторая - красным Рис. 10. Вычисление множителя через уравнение окружности для пересчёта 2D параметров в 3D 20-параметры были переведены в объёмные (3D) благодаря использованию выведенного нами ранее коэффициента [17]. Расчет коэффициента основывается на алгебраической формуле окружности, находящейся в координатной плоскости (рис. 10). Расчет коэффициента, соответствующего каждому срезу, производили по формуле: fXn+12л/27?х - х2 dx к ~ Хп , у] 2Rxn хп Координаты конца и начала каждого среза вычисляли в соответствии с его воображаемым положением на оси абсцисс: , где п - номер среза по порядку; хп - координата начала среза; хп+1 - координата конца среза; R - радиус окружности; уп - ширина среза. Поскольку в соответствии с предложенным методом самый первый срез не может нести никакой информации, так как будет содержать только самую крайнюю часть дефекта, его отбрасывали и считали нулевым, а первым - следующий по счёту (число n в представленной выше формуле). Первый срез определял распределение регенерата в области от нулевого до второго среза (х0 - х2). Таким образом, коэффициент для первого среза имел следующий вид: f%2 2л/2Дх - х2 dx = гР_ ^2Rxr - х\ Используя выведенные коэффициенты, объёмные параметры вычислялись следующим образом. - MV.1 - объём минерализованной новообразованной костной ткани в первые 14 сут. во всём дефекте - параметр пересчёта 2D информации в 3D. Вычисляли через определённый ранее множитель, индивидуальный для каждого среза - кп. Для нахождения MV.1 параметр Md.Ar.1 умножали на kn, после чего складывали полученные со всех срезов значения. Для первого среза множитель k определялся иначе, чем в остальных случаях (см. к1). - MV.2 - объём минерализованной новообразованной костной ткани в последние 14 сут. Вычисляли через Md.Ar.2, аналогично MV.1. - MV.nb - объём всей минерализованной костной ткани в области дефекта, образованной к концу эксперимента. Вычисляли через Md.Ar.nb, аналогично MV.1. или как сумма MV.1 и MV.2 (MV.nb = MV.1 +MV.2). - TV - объём дефекта кости. Вычислялся через T.Ar, аналогично MV.1. Используя в итоге рассчитанные 30-параметры, мы имели возможность оценить полученную информацию, в том числе с помощью определённых индексов [6], которые дают качественную характеристику регенерата. Таким образом, получившаяся математическая модель вычислений подходит для описания любых цилиндрических дефектов по данным гистологических срезов, за что и получила название «резаный цилиндр». Визуальная SD-реконструкция В качестве альтернативной методики нами была рассмотрена 30-реконструкция по гистологическим срезам. Для этого на срезах выполняли разметку в программе Adobe Photoshop CS6 (США), после чего их загружали в программу Visage Imaging Amira v5.5 (США), где размещали в пространстве (рис. 11) и выполняли построение трёхмерной модели в соответствии с разметкой (рис. 12). Рис. 11. Позиционирование гистологических срезов в пространстве Рис. 12. ЭР-реконструкция теменной кости с дефектом по гистологическим срезам. Зелёным цветом показана новообразованная костная ткань. Справа для сравнения показана прицельная рентгенограмма того же образца Далее производилось вычисление объёмов регенерата и дефекта, а также их соотношение, то есть значение относительного объёма регенерата. Несмотря на безусловные достоинства, этот метод по сравнению с математическим моделированием, рассмотренным в предыдущем разделе, имел ряд существенных недостатков: 1) позиционирование каждого среза приходилось проводить на глаз, что при использовании оборудования с нестандартизированным шагом реза вносило существенные искажения размеров и форм; 2) при получении малого количества срезов (меньше 10) пространственные искажения слишком велики. В нашем случае мы получали от 8 до 14 срезов с препарата; 3) стандартный протокол программы Amira не адаптирован к построению 30-модели цилиндрической формы (костного регенерата). Однако этот метод имел и неоспоримое преимущество: в результате получалась 30-модель, по которой можно было визуально оценить характер распространения регенерата в объёме дефекта. Нами было выполнено 3 таких реконструкции. Сравнение методик морфометрии Для статистического анализа результатов в зависимости от характера распределния данных были использованы методы параметрической (парный t-тест Стьюдента) и непараметрической (корреляционный анализ по Спирмену) статистики с помощью программы SigmaStat 3.5 (SyStat Software). результаты При сравнении количественных данных, полученных с помощью различных способов морфометрии, выявлена статистически значимая положительная корреляция между визуальной балльной оценкой регенерата с относительной площадью дефекта, определенной по рентгенограммам (r = 0,72, p<0,001). Таким образом, примененные 20 методы дали сходную оценку регенерата. Относительная площадь дефекта по данным рентгенографии (66,1±2,7%) статистически значимо превышала долю регенерата в дефекте, определенную методами объемной морфометрии: при использовании математической модели «резаный цилиндр» она составила 35,8±6,5% (р = 0,002), наглядной 30-реконструкции - 30,3±6,7% (p<0,001). Таким образом, балльная оценка регенерата по прицельным рентгенограммам может использоваться для приблизительной оценки, поскольку данные, полученные этим методом, коррелируют с результатами измерения относительной площади регенерата на рентгенограммах. Измерение площади минерализованного регенерата на прицельных рентгенограммах не даёт точного представления об объёме новообразованной костной ткани, но позволяет оценить аппозиционный рост от края дефекта. Данные измерений относительной площади дефекта по рентгенограмме всегда превышали значения, полученные разработанными нами методами 30 морфометрии, поскольку рентгеновский 20-снимок не позволяет визуализировать пустоты над и под регенератом. Этот метод может применяться для оценки закрытия площади дефекта без учета толщины регенерата. Математическая модель «резаный цилиндр» очень удобна в применении и при использовании флуоресцентных меток позволяет охарактеризовать динамику регенерации на одном образце. Однако этот метод не позволяет визуализировать данные. Наглядная 30-реконструкция по гистологическим срезам уступает математической модели «резаный цилиндр» в связи с тем, что использует универсальный протокол интерполяции, не позволяющий точно воспроизвести форму дефекта. Появление артефактов напрямую зависит от шага реза: чем он меньше, тем точнее полученные данные (рис. 13). Тем не менее мы получали данные, сопоставимые с математической моделью «резаный цилиндр». Однако в отличие от этой модели, универсальность метода наглядной 30-реконструкции позволяет использовать его для морфометрии и реконструкции морфологических структур любой формы. Рис. 13. Сравнение контура дефекта и регенерата по данным наглядной ЗО-реконструкции и рентгенологической картины. В ходе ЗО-моделирования в области дефекта обнаруживаются пустые зоны сверху и снизу. Контуры самого дефекта (розовый цвет) и регенерата (зелёный цвет) имеют очертания сглаженных «ступенек» Выводы 1. Предложенный нами протокол двойного ме-чения тетрациклиноподобными метками позволяет получить полное окрашивание регенерата метками, соответствующими разным срокам остеогенеза, и таким образом делает возможным анализ динамики неоостеогенеза на модели критического дефекта теменных костей крыс. 2. Методика изготовления недекальцинированн-ных срезов предотвращает деформацию гистологического материала, что избавляет от погрешностей при морфометрии и построении 30-моделей. Использование этилметакрилата для заключения образцов в блоки не вносит существенных изменений в протокол полимеризации, но позволяет избежать токсического воздействия на организм исследователя. Реактив этилметакрилата АКР-7 (ВладМива, Россия) удешевляет производство препаратов и делает его более удобным. 3. Разработаны два метода 30-морфометрии по гистологическим препаратам, подходящие для оценки критического дефекта теменных костей крыс: математическая модель «резанный цилиндр» и визуальная 30-реконструкция. 4. Результаты сравнения разработанных нами методов 30-морфометрии по данным гистологических препаратов с традиционными 20-методиками по данным рентгенографии позволяют сформулировать рекомендации по использованию каждого из этих методов.

About the authors

A. V Vasilyev

Institute of Human Morphology of RAMS; Research Centre of Medical Genetics of RAMS

A. V Volkov

Institute of Human Morphology of RAMS

G. B Bolshakova

Institute of Human Morphology of RAMS

D. V Goldstein

Research Centre of Medical Genetics of RAMS

References

Supplementary files