Gastrointestinal stromal tumor cell lines - the mechanisms of chemosensitivity in vitro

Full Text

Гастроинтестинальные стромальные опухоли (ГИСТ) представляют собой наиболее распространенную группу опухолей желудочно-кишечного тракта, происходящих из интерстициальных клеток Кахаля, в норме регулирующих моторику желудочнокишечного тракта. Так как главным патогенетическим механизмом развития ГИСТ в большинстве случаев (более 85%) является активирующая мутация гена тирозинкиназного рецептора KIT (CD117), приводящая к бесконтрольной пролиферации клеток, основным нехирургическим методом терапии больных с неоперабельными и (или) метастатическими формами ГИСТ является проведение таргетной терапии и назначение селективных ингибиторов тирозинкиназ, в первую очередь, Иматиниба (Гливека) [1, 2]. Тем не менее, несмотря на впечатляющие результаты таргетной терапии на начальных этапах ее проведения, стабилизации опухолевого процесса удается достичь далеко не у всех пациентов с ГИСТ (не более 30% случаев), а случаи длительных ремиссий являются чрезвычайно редкими. Следует отметить, что спустя 2 года после начала проведения таргетной терапии иматинибом более чем у половины пацие-mail: boichuksergei@mail.ru нтов с ГИСТ развивается резистентность к данному препарату, обусловленная развитием вторичных мутаций, возникающих в опухолевых клетках [3, 4]. Разработка и внедрение в практическую онкологию препаратов второй и третьей линии - Сунитиниба (Сутент) и Регорафениба (Стривага), ингибирующих активность сразу несколько типов тирозинкиназ, лишь частично решила проблему развивающейся резистентности и существенным образом не повлияла на прогноз заболевания [5, 6]. Важно отметить, что в настоящее время проведение химиотерапии больным с ГИСТ считается малоперспективным по причине их химиорезистентности [7]. Данная точка зрения базируется на результатах клинических исследований, проведенных до внедрения в практическую онкологию точных, в том числе, иммунохимических методов диагностики ГИСТ. Это дает основание усомниться в однородности популяции пациентов, принимавших участие в исследованиях по оценке эффективности химиотерапии больным с ГИСТ. Например, лейомиосаркомы (ЛМС) желудочно-кишечного тракта и ГИСТ имеют весьма схожие патоморфологические признаки, и, принимая во внимание тот факт, что ЛМС являются резистентными к большинству химиопрепаратов, резонно полагать, что присутствие пациентов с ЛМС могло существенным образом повлиять на достоверность результатов проведенных исследований. Результаты проведенных нами ранее исследований показали, что некоторые химиопрепараты могут быть эффективными по отношению к клеточным линиям ГИСТ in vitro [8]. Примечательно, что обнаруженный нами эффект был выявлен как в имати-ниб-чувствительных, так и резистентных к имати-нибу линиях ГИСТ. Кроме того, выявленные нами изменения уровня экспрессии белков, участвующих в репарации повреждений ДНК, дают основание полагать, что чувствительность клеток ГИСТ к химиопрепаратам может являться следствием их неспособности «переживать» генотоксический стресс и осуществлять репарацию повреждений ДНК, вызванных химиопрепаратами. Учитывая вышеизложенное, целью исследования явилось изучение потенциальной противоопухолевой активности некоторых химиопрепаратов (например, ингибиторов топоизомераз II типа). Материал и методы В качестве объекта исследования были выбраны клеточные линии ГИСТ, как чувствительные (GIST882 и T-1), так и резистентные (GIST430) к Иматини-бу. Клетки культивировали в стандартных условиях (37°С, СО2 5%) в соответствующих культуральных средах с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки, антибиотиков и L-глутамина (все реагенты Invitrogen). Использовали следующие препараты - доксорубицин, иматиниб и таксол (Sigma, США), это-позид и гидроксимочевина (Calbiochem, Германия). Цитотоксическую активность вышеназванных химиопрепаратов по отношению к клеткам ГИСТ оценивали с помощью микроколорометрического полуавтоматического MTS-теста. Анализ клеточного цикла, апоптоз проводили методом проточной цитометрии (FACsCanto II, BD). Экспрессию белков оценивали методом иммуноблоттинга с использованием соответствующих моноклональных антител (мАТ). Результаты На начальном этапе исследования было проведено сравнительное изучение цитотоксичности таргетного препарата - иматиниба и описанных выше химиопрепаратов по отношению к различным клеточным линиям ГИСТ. Ожидаемо, что максимальный противоопухолевый эффект в отношении иматиниб-чувствительных клеточных линий ГИСТ (GIST882 и T-1) был обнаружен у иматиниба (рис. 1А, Б). Была также выявлена чувствительность вышеназванных клеточных линий ГИСТ к ингибиторам топоизомеразы II - этопозиду и доксорубицину, в то время как эффект гидроксимочевины и таксола был менее выраженным. Активность исследуемых соединений варьировала в зависимости от типа клеточной линии. Например, максимальный цитотоксический эффект в отношении клеток GIST882 был выявлен у этопозида, в то время как в отношении клеток GIST Т-1 наиболее эффективным оказался препарат доксорубицин. В то же время, иматиниб-резистентная опухолевая линия GIST 430, оказалась умеренно чувствительной только к доксорубицину, в то время как другие химиопрепараты, а также иматиниб не оказывали подобного эффекта (рис. 1В). Было также обнаружено, что в клетках ГИСТ док-сорубицин, этопозид приводили к значительному дозо-зависимому повышению уровня экспрессии гистона 2А (Н2АХ), фосфорилированного по остаткам серина в положении 139, именуемого в дальнейшем как у-Н2АХ, и являющегося общепризнанным маркером двунитевых разрывов ДНК (рис. 2). Данный эффект этих препаратов был обнаружен во всех 3 исследуемых клеточных линиях ГИСТ. Уровень экспрессии у-Н2АХ в клетках ГИСТ после их инкубации с исследованными соединениями коррелировал со значительным повышением уровня экспрессии фосфорилированной (активированной) формы ATM-киназы (pATM Ser1981), являющейся, как известно, одним из ключевых факторов, фос-форилирующих гистон 2А и запускающих каскад реакций, направленных на репарацию двунитевых разрывов ДНК. Рис. 1. Доля жизнеспособных клеток линий GIST 882 (A), GIST T1 (Б) и GIST 430 (В) после их инкубации с химиопрепаратами в течение 48 ч. * - различия при сравнении с контролем статистически значимы при р<0,05 Обнаруженный нами эффект препаратов доксо-рубицина и этопозида был также «время-зависи-мым». Было показано, что с увеличением времени инкубации клеток GIST882 и Т-1 с доксорубицином происходило повышение уровня экспрессии y-H2AX, что сопровождалось активацией спасательных механизмов репарации повреждений ДНК (повышение экспрессии pATM Ser1981) (рис. 3). В пользу активации механизмов репарации доксорубицининдуцированных повреждений ДНК свидетельствовало значительное увеличение уровня экспрессии рекомбиназы Rad51, являющейся одним из ключевых факторов процесса гомологичной рекомбинации. В клетках ГИСТ после инкубации с доксо-рубицином было также обнаружено увеличение уровня экспрессии его фосфорилированной формы (р53 Ser15), что свидетельствовало об его активации. Рис. 2. Активность белков репарации повреждений ДНК в условиях генотоксического стресса, вызванного химиопрепаратами, в клеточных линиях GIST 882 (A) и GIST T1 (Б) в зависимости от концентрации препарата: К - контроль; ДОКС - доксорубицин; ЭТО - этопозид; ГМ - гидроксимочевина А Б Рис. 3. Активность белков репарации повреждений ДНК в условиях генотоксического стресса, вызванного доксорубицином и иматинибом, в клеточных линиях GIST 882 (A) и GIST T1 (Б). ДОКС - доксорубицин. Цифрами отмечено время экспозиции каждого препарата (в часах) Примечательно, что в иматиниб-чувствительных клеточных линиях ГИСТ (например, T1 и 882), данный ингибитор тирозинкиназы также индуцировал накопление вышеназванной фосфорилированной формы гистона (см. рис. 2, 3). Учитывая тот факт, что механизм действия иматиниба обусловлен ингибированием тирозинкиназной активности c-Kit-рецептора и не связан с повреждением ДНК, обнаруженный нами факт значительного повышения уровня экспрессии фосфорилированной формы гистона 2А в клетках ГИСТ после воздействия на них данного таргетного препарата, представляет научный интерес. Важно отметить, что, несмотря на активацию в клетках ГИСТ спасательных механизмов репарации повреждений ДНК, вызываемых доксорубицином, этопозидом, через 48 ч инкубации клеток с данными соединениями наблюдалась их гибель, о чем свидетельствовали результаты колориметрического MTS-теста, а также световой микроскопии. Известно, что одним из возможных механизмов гибели опухолевых клеток под действием химиопрепаратов может быть апоптоз. В пользу этого свидетельствовало дозо- и время-зависимое накопление в клетках ГИСТ расщепленной формы поли-АДФ-рибоза-полимеразы (ПАРП) (см. рис. 2, 3). Известно, что расщепленные фрагменты данного фермента (например, 86 и 24 кДа) появляются в результате активации каспаз-3 и -7 и поэтому являются общепризнанным маркером апоптоза. О способности этопозида и доксорубицина индуцировать апоптоз клеток ГИСТ также свидетельствовали результаты проточной цитометрии, подтвердившие увеличение количества гиподиплоидных клеток ГИСТ после их инкубации с вышеназванными препаратами. Примечательно, что данный эффект наблюдался как в иматиниб-чувствительных, так и резистентных к иматинибу клеточных линиях ГИСТ. Обсуждение Одним из основных механизмов гибели опухолевых клеток под действием противоопухолевых препаратов является апоптоз, развивающийся вследствие несостоятельности процессов репарации повреждений ДНК на фоне генотоксического стресса, индуцируемого химиопрепаратами. Проведенный нами ранее комплексный анализ состояния различных систем репарации повреждений ДНК в клетках ГИСТ позволил выявить ряд изменений в базальном уровне экспрессии различных белков, свидетельствующих о потенциальных дефектах в различных путях репарации повреждений ДНК (например, процессов гомологичной рекомбинации, репарации ошибочно спаренных нуклеотидов, а также эксцизионной репарации). В связи с вышеизложенным, было предпринято изучение способности вышеназванных химиопрепаратов индуцировать в клетках ГИСТ повреждения ДНК in vitro и запускать механизмы их репарации повреждений ДНК. Результаты проведенного исследования показывают, что некоторые химиопрепараты (доксо-рубицин и этопозид) способны индуцировать повреждения ДНК в клеточных линиях ГИСТ in vitro. Известно, что после индукции повреждений ДНК, появление данной фосфорилированной формы гистона является необходимым фактором, обеспечивающим последующее привлечение к месту повреждения ДНК белков-репаратнов, в частности, MDC1, распознающих исключительно данную форму гистона [9]. Кроме того, данные последних лет также указывают на то, что помимо описанной выше функции участия в процессах репарации повреждений ДНК, повышение уровня экспрессии как общей, так и фосфорилированной форм гистона 2А в клетках может являться про-апоптогенным сигналом и индуцировать их последующую гибель по механизму апоптоза [10-12]. Интересным, на наш взгляд, представляется также факт значительного зависимого от времени снижения уровня экспрессии рекомбиназы Rad51 в иматиниб-чувствитель-ных клетках ГИСТ после их инкубации с данным ингибитором тирозинкиназы. Это может свидетельствовать об иматиниб-индуцируемом ослаблении процессов гомологичной рекомбинации в клетках ГИСТ, а, следовательно, об увеличении их чувствительности к ДНК-повреждающим агентам на фоне воздействия таргетного препарата. Для подтверждения данной гипотезы требуется проведение дальнейших исследований. Таким образом, проведенные нами исследования ставят под сомнение традиционную точку зрения о химиорезистентности ГИСТ и иллюстрируют способность некоторых химиопрепаратов индуцировать гибель клеток ГИСТ по механизму апоптоза. Обнаруженный нами факт чувствительности клеток ГИСТ к химиопрепаратам (в частности, доксорубицину и этопозиду) открывает новые перспективы терапии больных ГИСТ после развивающейся резистентности к иматинибу, и возможно, к другим таргетным препаратам. Кроме того, обнаруженный нами факт иматиниб-индуцированного снижения уровня ре-комбиназы Rad51 в клетках ГИСТ дает основание предполагать повышение чувствительности клеток ГИСТ к химиопрепаратам после воздействия на них иматиниба. В пользу этого свидетельствуют данные об эффективности использования малых доз доксо-рубицина, использованных в комбинации с иматини-бом у больных с неоперабельными формами ГИСТ, рефрактерными к монотерапии данным таргетным препаратом [13]. Заключение Клетки ГИСТ чувствительны к некоторым химиопрепаратам, способным вызывать их гибель по механизму апоптоза. Важно, что данный эффект наблюдается как в иматиниб-чувствительных, так и резистентных к препарату клеточных линиях. Полученные нами данные открывают перспективы для изучения возможности применения химиотерапии больным с ГИСТ на фоне развившейся лекарственной резистентности к таргетным препаратам. Благодарности Работа финансировалась грантом Российского Научного Фонда (РНФ) № 14-15-00342.

About the authors

S. V Boichuk

Kazan State Medical University; University of Pittsburgh Cancer Institute

B. R Ramazanov

Kazan State Medical University

A. R Galembikova

Kazan State Medical University

I. G Mustafin

Kazan State Medical University

A. Duensing

University of Pittsburgh Cancer Institute

References

Supplementary files