Experimental and Morphological study of the xenogenic biological membranes

Full Text

В последнее десятилетие в челюстно-лицевой хирургии все более активно используются различные барьерные резорбируемые мембраны биологического и синтетического происхождения [1, 2]. Необходимо отметить, что при операциях по направленной регенерации костной ткани в различных клинических ситуациях использование данных материалов является определяющим [2, 3]. Важными факторами, опосредующими выбор ограничительных мембран, являются два независимых аспекта: стоимость изделия и, соответственно, цена конкретного оперативного вмешательства с его использованием и, конечно, надежность, то есть возможность получить предсказуемый успешный результат лечения [1-5]. В свою очередь, основными показателями, влияющими на надежность таких материалов, являются: - время биорезорбции мембраны, т.е. срок, в течение которого она сможет выполнять барьерную функцию (предотвращение врастания мягких тканей в зону остеогенеза); - отсутствие негативного влияния на окружающие ткани, в частности, на структуру слизисто-надкостничного лоскута; - адаптация мембраны в тканях и возможность ее надежной фиксации в зоне имплантации [3-6]. Дополнительными факторами, определяющими выбор барьерной мембраны оперирующим хирургом, могут являться доступность (синтетические мембраны стоят очень дорого), а также простота применения [1, 2, 5]. В связи с вышесказанным, цель данной работы - экспериментально-морфологическая оценка биологических барьерных мембран из тканей быка (диафрагма, перикард, твердая мозговая оболочка), изготовленных по оригинальной методике ЦИТО им. Н.Н. Приорова [7], для определения степени их им-муногенности и времени биодеградации (окончание барьерной функции) в организме реципиента. Выбор указанных материалов обусловлен основными требованиями к тканеинженерным биосовместимым материалам, такими как доступность, простота применения (возможность придать любую форму и размер), отсутствие иммуногенности (обеспечивается проведением децеллюляризации), биорезорбиру-емость и высокий потенциал интеграции с тканями реципиентного ложа (биологический бесклеточный донорский материал с высокой степенью гомологии внеклеточного матрикса) [2-5, 8, 9]. материал и методы В эксперименте протестированы барьерные мембраны из диафрагмы (М-Д), перикарда (М-П), твердой мозговой оболочки (М-ТМО) бычьего происхождения, изготовленные по методике, разработанной в ЦИТО им. Н.Н. Приорова (механическая и химическая обработка с целью удаления клеток донора и элементов крови, лиофилизация из замороженного состояния, радиационная стерилизация) [7, 8]. Для исследования биосовместимости и степени кальцификации биоматериалов использовали стандартную модельную тест-систему гетеротопической подкожной имплантации крысам (самцы линии Wistar массой 180-200 г, стандартные условия содержания) экспериментальных образцов мембран [2, 10]. Все манипуляции с животными выполняли в соответствии с международными правилами гуманного обращения, в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 10993-2-2009. Все операции выполняли под золетил/ксилазиновым наркозом (6/12 мг на 1 кг веса). По 2 варианта каждого из образцов М-Д, М-П и М-ТМО имплантировали крысам (n = 6) вдоль спины через разрез кожи в нижней ее части. Анализ экспериментальных образцов выполнялся для исходных вариантов (до имплантации, 0 сут.), а также через 30, 45 и 70 сут. после имплантации. Сроки промежуточной и финальной эксплантации образцов были выбраны, исходя из минимального времени резорбции материалов на основе донорских матриц [6, 10]. После эксплантации материал подвергался комплексному макро- и микроскопическому (гистологическому) анализу. При макроскопическом анализе оценивались общий характер изменений: степень истончения образца (не менее 10 измерений для группы), характер минерализации, сохранение барьерных свойств, интенсивность резорбции и т.д. При гистологическом анализе определялись: средняя толщина образца (не менее 10 измерений для не менее 7 образцов - показатель значим при исходной одинаковой толщине образцов), общий характер прорастания реактивно измененной волокнистой соединительной тканью, степень васкуляризации и тип новообразованных сосудов, интенсивность клеточной инфильтрации и т.д. Для гистологического анализа срезы, изготовленные по стандартной методике, окрашивали гематоксилином и эозином; выполняли иммуногистохимические реакции с антителами (DakO, Дания) к а-гладкомышечному актину (а-SMA) - выявление миофибробластов, периваску-лярных клеток; CD68 - оценка количества макрофагов, CD4 - выявление CD4+-клеток, Т-лимфоцитов. Иммуногистохимический анализ носил качественный характер: реакция считалась положительной при выявлении клеток с цитоплазматическим окрашиванием. Оценка общей лимфоцитарной инфильтрации и степени разрушения структуры имплантов за счет прорастания соединительной ткани осуществлялась полуколичественно по импровизированной шкале (в крестах). Степень васкуляризации образца оценивалась как общее количество сформированных (дефинитивных) сосудов в исследованных полях зрения (не менее 3 повторов на каждый препарат). Количественную оценку минерализации (преципитаты кальция) в образцах проводили методом адсорбционной спектроскопии (TECAN Infinity F200, Австрия; набор Calcium AS FS (Arsenazo III; DiaSys, Германия)) [2, 10]. Для полученных результатов определяли среднее значение и стандартную ошибку среднего значения. Учитывая непараметрическое распределение количественных признаков, для сравнения групп (различных мембран) использовали U-критерий Манна - Уитни. результаты Мембраны из диафрагмы После гетеротопической имплантации мембраны на основе децеллюляризованной диафрагмы подвергались ряду морфофункциональных преобразований с выраженной динамикой: постепенное истончение и уплотнение образца, врастание в него элементов реактивно измененной соединительной ткани с кровеносными сосудами и наличием выраженного клеточного лимфоцитарно-гистиоцитарного инфильтрата, придающими ей сходство с грануляционной тканью (рис. 1, табл.). В период от 30 до 45 сут. после имплантации врастающая новообразованная соединительная ткань состояла из богатого аморфными компонентами матрикса и разнообразных клеточных элементов: фибробластов, миофибробла-стов, макрофагов, лимфоцитов (рис. 1). К 45 сут. наблюдалось характерное образование многочисленных сосудов микроциркуляторного русла (рис. 1). К 70 сут. выявлялась практически полная резорбция имплантированных фрагментов или выраженное истончение единичных оставшихся образцов (рис. 1). При этом в структуре нерезорбировавшихся образцов наблюдалось отсутствие новообразованной соединительной ткани между фрагментированными пучками матрикса диафрагмы, появление плотного поверхностного тонкого новообразованного коллагенового слоя и дистрофическое обызвествление протяженных фрагментов стромы имплантированного материала под новообразованным тонким слоем. Также по всему объему образцов обнаруживались полноценные кровеносные сосуды с вполне дифференцированной стенкой (табл.). В целом протективные свойства и эластичность материала имплантированных фрагментов постепенно убывала к 45 сут. имплантации. К 70 сут. наблюдалось замещение ткани имплантата на новый, прочный, очень тонкий коллагеновый неоматрикс, содержащий большое количество сформированных сосудов. Проявляющаяся к 70 сут. кальцификация образцов (рис. 1; табл.) свидетельствовала о процессах утилизации «старого» имплантированного матрикса через минерализацию уже после образования «нового» (собственного) матрикса, что говорит, в целом, о кондуктивном эффекте используемого типа биологических мембран. 30 сут. 45 сут. 70 сут. Рис. 1. Мембраны из диафрагмы на разных сроках после подкожной имплантации: 1 - соединительнотканная капсула; 2 - фрагменты девитализированной диафрагмы; 3 - вросшая реактивно измененная рыхлая волокнистая соединительная ткань; 4 - сосуды; 5 - соединительная ткань, заместившая мембрану; 6 - участки минерализации (удалены в процессе изготовления препарата). Окраска: А-В - гематоксилин и эозин; Г-Е - иммуногистохимическая реакция с антителами к a-SMA, гематоксилин. Ув.: А-Г х100; Д, Е х200 Мембраны из перикарда Таблица. Выраженность процессов преобразования имплантированных децеллюляризованных М-Д, М-П, м-тмо на разных сроках наблюдения Показатель Срок М-Д М-П М-ТМО Ангиогенез - среднее количество 30 сут. 10,4±4,8 6,75±3 6,4±2,6 кровеносных сосудов в поле зрения (х200) 45 сут. 7,2±2,5 4,5±1,7 7,2±4,6 70 сут. 8,8±2 3,3±0,8 8,9±4,6 Средняя толщина соединительнотканной 30 сут. 164,5±24,8 244,7±66,5 капсулы (мкм) 45 сут. 96,3±15 97,7±13 - 70 сут. 91,2±46,5 - - Разрушение структуры, прорастание соединительной тканью Среднее по всем срокам ++ + +/- Лимфоцитарная инфильтрация Среднее по всем срокам +++ ++ + Минерализация - содержание кальция 30 сут. 0,37±0,08 11,83±7,32 0,43±0,31 (мкг/мг)* 45 сут. 10,47±0,62 71,69±10,41 0,94±0,61 70 сут. 50,92±5,43 92,16±18,64 52,8±10,12 * содержание кальция в материалах до имплантации - 0,14 ±0,02 мкг/мг. Имплантированные фрагменты этой группы отличались более выраженным (в сравнении с М-Д] сохранением структуры и барьерных характеристик имплантированного материала (рис. 2, табл.]. Даже к 70 сут. имплантации массированного врастания тканей из реципиентного ложа в структуру образца не происходило (рис. 2]. К 30 сут. после имплантации выявлялось развитие рыхлой грануляционной ткани по периферии имплантата (рис. 2], которая уже к 45 сут. резко истончалась с заменой на мощные параллельно ориентированные пучки коллагеновых волокон, свидетельствующие о преобразовании грануляционной ткани в формирующуюся капсулу (рис. 2, табл.]. В целом, васкуляризация материала носила преимущественно поверхностный характер с максимальным сосредоточением новообразованных сосудов в матриксе формирующейся капсулы (рис. 2]. В дальнейшем, к 45 сут. после операции новообразованные кровеносные сосуды увеличивались в диаметре; к 70 сут. общее количество сосудов уменьшалось, они приобретали дефинитивную структуру (рис. 2]. К 70 сут. процесс замещения материала импланта новообразованной соединительной тканью становился более выраженным и проявлялся в развитии пограничной кальцификации и значительном «уплотнении» образца за счет более тесного примыкания друг к другу новообразованных коллагеновых волокон (рис. 2]. На всех исследованных сроках гистологических данных, свидетельствующих об активной фагоцитарной и лимфоцитарной реакции на материал, выявлено не было. В отличие от материалов, созданных на основе ксенодиафрагмы, М-П начинали кальцифицироваться уже к 30 сут. после имплантации (табл.]. К 45 сут. минерализация образцов носила тотальный характер, при этом кальцифицированные участки соответствовали слоям перикарда и имели ленточное расположение вдоль внешней или внутренней стороны формирующейся капсулы (рис. 2, табл.]. К 70 сут. после операции области кальцификации, контактирующие с мышечной тканью реципиента, представляли собой тонкую пограничную пластинку. В целом полученные данные свидетельствовали о возможном остеогенном эффекте М-П. Мембраны из твердой мозговой оболочки По сравнению с предыдущими материалами, М-ТМО быка характеризовались наименьшей «реактогенностью» (табл.]. Лишь на ранних сроках (30 сут.] наблюдалась лимфоцитарная инфильтрация поверхностных слоев тканевого фрагмента. В тоже время уже на 30 сут. имела место активная резорбция пограничных слоев матрикса имплантированных мембран, центральные участки материала при этом оставались незадействованными в процессе биопреобразований (рис. 3]. Миграция лейкоцитов в поверхностные слои наблюдалась одновременно с врастанием кровеносных сосудов (рис. 3, табл.]. Через 45 сут. наблюдалось завершение активных процессов со стороны формирующейся соединительнотканной капсулы, при этом клеточные элементы врастающих структур не мигрировали в сопредельные слои тканевого образца (рис. 3]. Несмотря на относительно быструю резорбцию материала, сохранившие целостность имплантаты не подвергались общему расслоению, структура имплантатов была сохранена. Через 70 сут. после имплантации срединный волокнистый остов М-ТМО становился более разобщенным, сосуды приобретали более выраженную дефинитивную структуру (рис. 3], врастания соединительной ткани и синтеза «молодых» коллагеновых волокон и аморфного компонента не наблюдалось. Практически все имплантированные фрагменты подверглись интенсивной пограничной кальцификации (табл.], при этом характер наблюдающейся минерализации носил преимущественно деструктивный характер. 45 сут. 30 сут. 70 сут. Рис. 2. Мембраны из перикарда на разных сроках после подкожной имплантации: 1 - соединительнотканная капсула; 2 - фрагменты девитализированного перикарда; 3 - субкапсулярный минерализованный слой мембраны; 4 - сосуды; 5 - гигантская многоядерная клетка инородных тел. Окраска: А-В - гематоксилин и эозин; Г, Д - иммуногистохимическая реакция с антителами к a-SMA, гематоксилин. Ув.: А-В х 100; Г х400; Д х200 30 сут. 45 сут. 70 сут. Рис. 3. Мембраны из твердой мозговой оболочки на разных сроках после подкожной имплантации: 1 - поверхностный слой мембраны; 2 - центральный слой мембраны; 3 - вросшая реактивно измененная рыхлая волокнистая соединительная ткань; 4 - сосуды; 5 - соединительнотканная капсула. Окраска: А-В - гематоксилин и эозин; Г, Д - иммуногистохимическая реакция с антителами к a-SMA, гематоксилин. Ув.: А-В х 100; Г, Д х400 обсуждение В рамках проведенного исследования были изучены резорбируемые мембраны, изготовленные из трех типов донорских тканей. В ходе исследования было выявлено, что реакция реципиентного ложа и структурные преобразования протестированных барьерных мембран характеризовались различной динамикой в части новообразования соединительной ткани и биорезорбции материала. Полученные результаты дают основания планировать для каждого вида мембраны специфическое предназначение. На основании полученных данных можно заключить следующее: 1. Все имплантируемые материалы биосовмес-тимы. 2. Наиболее быстро и полно (30 сут. - 80%] подвергается резорбции М-ТМО. При этом данный материал в целом истончается, но не теряет своей барьерной функции. Помимо этого, группа М-ТМО показала самую низкую степень минерализации, а также невыраженную гистиоцитарную/ лимфоцитарную инфильтрацию и ангиогенез. Следовательно, наименее выраженные процессы реактивности после имплантации индуцировали именно образцы из ТМО. 3. Наиболее продолжительный срок биодеградации наблюдался у М-П. По данным гистологического и иммуногистохимического исследований, наиболее выраженная инкапсуляция также имела место в группе М-П. В тоже время, у образцов М-П наблюдалось наименее выраженное разрушение структуры, минимальные инфильтрация и прорастание соединительной тканью. Кроме того, материалы данного вида характеризовались выраженной минерализацией, что потенциально может повысить интеграцию с костной тканью. 4. Наименьшие протективные свойства (в виде быстрой деструкции] выявлялись у М-Д. В образцах данной группы определялся активный ангиогенез и минерализация материалов. Инфильтрация тканей была более выраженной, чем в группе М-П. При этом более быстрый срок резорбции и выраженный кондуктивный эффект данных материалов может быть определяющим критерием для их использования в случаях, не требующих длительной барьерной функции, а, напротив, максимально быстрой утилизации имплантатов биологического происхождения. Таким образом, каждая разновидность разработанных биологических мембран в клинической практике может иметь различные показания. Важно понимать, что протективные свойства мембран, то есть срок сохранения целостности, является важным для выполнения их предназначения в клинической практике (барьерная функция, кондуктивная роль - направление формирующегося регенерата; оптимизация репаративного процесса]. Учитывая, что М-ТМО является наиболее биои-нертной, имеет средний срок биорезорбции (из трех исследованных материалов] и не теряет барьерной функции вплоть до 70 сут., она может быть использована для предотвращения врастания эпителия в зону остеогенеза и удержания остеопластического материала в области имплантации, так как сроками формирования пригодного для дальнейшей работы (имплантологическое лечение] костного регенерата являются 5-6 мес. после аугментации [1, 8]. В свете выявленных свойств мембраны М-Д можно рекомендовать как материал выбора для аугментации мягких тканей, как альтернативу аутотканям, а именно свободному соединительнотканному и слизистому лоскуту с твердого неба, что является, несомненно, в высшей степени актуальным в современной практике хирургии полости рта [1, 9]. В случае направленной регенерации костной ткани без возможных осложнений в виде гетеро-топической кальцификации из-за применения привнесенных остеоиндуктивных факторов, можно использовать М-П. Помимо этого, М-П характеризуется наиболее длительной биорезорбцией, без выраженных процессов ангиогенеза даже к 70 сут. после имплантации, вследствие чего данный вид мембраны может являться материалом выбора для формирования более плотной и качественно устойчивой структуры десны в области костной регенерации или дентальной имплантации. Такой вид мембран может быть особенно актуален при техниках костной аугментации с преимущественным использованием аутотканей или донорских (полученных от человека посмертно или прижизненно] материалов, в том числе по причине более быстрого формирования «рабочего» регенерата по сравнению с материалами ксеногенного и синтетического происхождения. В тоже время, выраженная биосовместимость материалов и сравнительно слабая степень клеточной инфильтрации свидетельствуют о том, что исследованные ограничительные мембраны можно целенаправленно модифицировать за счет дополнительной обработки биологическими агентами с определенными эффектами. Так, например, насыщение мембраны антибиотиками или антисептиками в липосомаль-ной форме может профилакттировать воспаление в послеоперационном периоде. Если модифицировать кондуктивную функцию, то насыщение мембран индуктивным агентом, например, rhBMP-2, rhBMP-7 и др., может обеспечить активацию остеогенеза в зоне костного дефекта или атрофии костной ткани. Внесение в структуру М-Д биологически активных веществ, стимулирующих регенерацию, может быть востребовано для усиления восстановления мягких тканей. В целом, требуются дальнейшие доклинические исследования разработанных биологических мембран. Возможно, они будут иметь различное применение в клинической практике, т.е. позволят добиться успешных результатов лечения для различных групп пациентов.

About the authors

A. Yu Ryabov

Dentisrty center «Interdentos»

Korolev, Russia

I. S Fadeeva

Institute of Theoretical and Experimental Biophisics of RAS; Pushchino State Institute of Natural Sciences

Pushchino, Russia

R. V Deev

Human Stem Cells Institute

Moscow, Russia

N. O Vezhnina

Institute of Theoretical and Experimental Biophisics of RAS

Pushchino, Russia

Yu. B Yurasova

Russian Children Clinical Hospital

Moscow, Russia

N. I Fesenko

Pushchino State Institute of Natural Sciences

Pushchino, Russia

V. V Guriev

A.I. Evdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry

Moscow, Russia

E. D Sklyanchuk

A.I. Evdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry; «Bio-Medical» Co. Ltd.

Moscow, Russia

M. V Lekishvili

N.N. Priorov Central Institute of Traumatology and Orthopedics; «Bio-Medical» Co. Ltd.

Moscow, Russia

V. S Akatov

Institute of Theoretical and Experimental Biophisics of RAS; Pushchino State Institute of Natural Sciences; «Bio-Medical» Co. Ltd.

Moscow,Pushchino, Russia

References

Supplementary files