Effects of Dalarginum on proliferation of multipotent mesenchymal stromal cells, dermal fibroblasts, and human osteosarcoma cells in vitro

Full Text

Впервые предположение о том, что опиоиды вовлечены в регенерацию костной ткани, было высказано ещё в 1995 г. H. Rosen с соавт. в связи с обнаружением реципрокной связи между экспрессией гена проэнкефалина (PENK) в созревающих остеобластах и их дифференцировкой [1, 2]. Опиодные рецепторы были обнаружены на остеобластоподобных опухолевых клетках [3]. Имеются данные о том, что малодифференцированные клетки остеобластического дифферона, но не зрелые остеобласты и остеокласты, способны синтезировать опиоиды [4]. В 80-90-е годы активно изучали влияние опиоидов на регенерацию других тканей, как правило, эпителия [5-7]. В результате этих исследований был создан и внедрен в клиническую практику Даларгин, единственный в своем роде препарат опиоидных пептидов периферического действия. Он был рекомендован как препарат, улучшающий регенерацию, в частности, при язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки [5]. В многочисленных исследованиях было установлено, что Даларгин ускоряет пролиферацию эпителия, стимулируя опиоидные рецепторы. Убедительные данные о влиянии опиоидов, в том числе Даларгина или его прямых аналогов, на процессы репаративной регенерации костной ткани в отечественной и зарубежной литературе отсутствуют. В процессе эмбрионального развития в формирующейся костной ткани не наблюдается экспрессии генов других предшественников опиоидных пептидов, кроме проэнкефалина [2]. Это позволяет предположить, что именно Даларгин как синтетический аналог лейэнкефалина, не проникающий через гематоэнцефалический барьер, имеет наибольший потенциал для дальнейшего использования при терапии костных патологий. Исследования, проводимые на клеточных культурах, дают возможность непосредственно оценить активацию клеточных рецепторов и подобрать оптимальную концентрацию препарата. Целью настоящей работы являлась оценка in vitro влияния различных доз Даларгина (Био-лек, Украина) и его блокатора Налоксона (Польфа, Польша) на пролиферацию мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), фибробла-стов дермы (ФД) и клеток остеосаркомы человека линии HOS. Материал и методы Получение клеточных культур Культуры ММСК и ФД были получены, соответственно, из липоаспирата и биоптата кожи взрослых здоровых доноров после подписания ими добровольного информированного согласия. Выделение трех культур ММСК из липоаспиратов было выполнено по ранее разработанной методике [8, 9]. Полученные культуры соответствовали требованиям, предъявляемым к ММСК [10]: представлены адгезивными фибробластоподобными клетками (рис. 1А) с иммунофенотипом: CD90 + , CD105 + , CD73 + , CD31-, CD45-, CD34- - и способностью к дифференцировке в остео-, адипо- и хондрогенном направлениях [8, 9]. Для выделения ФД у доноров забирали фрагмент кожи (2x3x4 мм), промывали в растворе Хэнкса (Панэко, Россия), измельчали и дезагрегировали в 0,25% растворе трипсина (Панэко, Россия) в течение 40 мин. при 37°С. Клетки осаждали центрифугированием при 1000 об./мин. в течение 5 мин., ресуспендировали в ростовой среде, состоящей из DMEM/F12 (ПанЭко, Россия), 10% фетальной телячьей сыворотки (ФТС, PAA, Австрия) и 0,1 мг/мл амикацина (Синтез, Россия), высевали на чашки Петри с плотностью посева 0,5-1 x103 кл/см2 и культивировали до формирования конфлюентного монослоя при стандартных условиях (37°С, 5% СО2) (рис. 1Б). Ростовую среду меняли каждые 3 сут. В культурах ФД путем иммунофлуоресцентного анализа была выявлена экспрессия коллагена I, III типа и эластина. Клетки остеосаркомы человека линии HOS были любезно предоставлены компанией «РеМеТэкс» (Россия) (рис. 1В). Замораживание клеток в концентрации 1,5 млн/мл производили в криопробирках в ФТС с добавлением 10% раствора ДМСО (диметилсульфоксида, ПанЭко, Россия). Сначала криопробирки помещали в морозильную камеру для охлаждения со скоростью -1°С/ч. до -80°С, а затем в жидкий азот. Культивирование клеток Клетки после размораживания культивировали в течение 1 сут., затем рассевали в чашки Петри диаметром 90 мм, выполненные из адгезивного полимера (Nunc, Дания). Культуры ММСК (n = 3) и ФД (n = 3) рассевали по 70x103 клеток на чашку. Клетки остеосаркомы человека линии HOS (n = 3) рас-севали по 50x103 клеток на чашку. Для культивирования использовали ростовую среду DMEM/F12 1:1 (ПанЭко, Россия), содержащую 2 mM L-глутамина (ПанЭко, Россия), 10% ФТС (PAA, Австрия) и 0,1 мг/мл амикацина (Синтез, Россия). Оценка влияния различных доз Даларгина и его блокатора Налоксона на пролиферацию ММСК, ФД и клеток остеосаркомы линии HOS проводилась в 5 экспериментальных группах для каждой клеточной культуры: 1 группа - Даларгин в концентрации 10 мкг/л; 2 группа - Даларгин в концентрации 100 мкг/л; 3 группа - Даларгин в концентрации 1000 мкг/л; 4 группа - комбинация Даларгина (100 мкг/л) и Налоксона (0,5мг/л); 5 группа - комбинация Даларгина (100 мкг/л) и Налоксона (3 мг/л) Контроль - 0,9%раствор хлорида натрия. Ежедневно в течение 3 сут. в культуральную среду с клетками, находящимися в логарифмической фазе роста, добавляли растворы исследуемых веществ в объёме 100 мкл для создания нужных концентраций этих веществ в каждой группе. Подсчет числа клеток После 3 сут. инкубирования клетки снимали с чашек Петри смесью растворов 0,02% Версена (ПанЭко, Россия) и 0,25% Трипсина (ПанЭко, Россия) в соотношении 1:1. Получившуюся суспензию помещали в закрытые пробирки для предупреждения испарения. Лизис клеток под действием трипсина предотвращали добавлением 2 мл ростовой среды с сывороткой. Число клеток подсчитывали на аппарате «Пикоскель ПС-4М» (НПВ Лабовэй, Россия), который работает по принципу регистрации изменений импеданса, вызванных исследуемыми частицами, проходящими через отверстие измерительной трубки. Для большей точности данных подсчёт клеток с каждой чашки Петри выполнялся трижды в 3 разных измерительных кюветах из комплекта «Пикоскель ПС-4М» в одинаковом разведении для нивелирования ошибки метода. В свою очередь, измерение количества клеток в каждой измерительной кювете производили тоже 3 раза. Статистический анализ Полученные количественные данные анализировали с помощью программы GraphPadPrism 6. Поскольку распределение отличалось от нормального, для оценки различий использовали ранговый дисперсионный анализ Краскала - Уоллеса и тест Данна. Результаты К концу эксперимента во 2 группе, где использовали Даларгин в концентрации 100 мкг/л, количество клеток остеосаркомы линии HOS было на 22- 34% меньше, чем в контроле, а количество ММСК на 19-34% больше, чем в контроле. Количество ФД не имело статистически значимых различий с контролем (рис. 2-4). В 1 группе, где применяли меньшую концентрацию Даларгина (10 мкг/л), наблюдали похожие тенденции (рис. 2-4), однако статистически значимых отличий при сравнении с контролем выявлено не было. Исключение составили два случая: в двух культурах ММСК при добавлении Даларгина в концентрации 10 мкг/л наблюдали статистически значимое увеличение количества клеток по сравнению с контролем, но оно было меньше по сравнению со 2 группой, в которой применяли Даларгин в концентрации 100 мкг/л (рис. 3). В 3 группе с использованием большей концентрации Даларгина (1000 мкг/л), наблюдали либо отсутствие эффекта, либо противоположные тенденции (рис. 2-4). Таким образом, была определена оптимальная концентрация Даларгина для стимуляции пролиферации ММСК и подавления скорости удвоения клеток остеосаркомы линии HOS - 100 мкг/л. В 4 и 5 группах с применением комбинаций На-локсона в концентрациях 0,5 мг/л и 3 мг/л и Даларгина в концентрации 100 мкг/л статистически значимых различий в изменении количества клеток ММСК, ФД и клеток остеосаркомы линии HOS, по сравнению с контрольными значениями, выявлено не было (рис. 2-4). Обсуждение Выбор клеточных культур был обусловлен следующими соображениями. Сравнение скорости пролиферации ММСК и ФД должно было позволить определить, пролиферацию каких именно клеток - малодифференцированных или специализированных - стимулирует Даларгин. Понимание этого факта имеет важное значение для дальнейшего использования препарата в оптимизации репаративной регенерации костной ткани или восстановления кожи. Анализ влияния даларгина на пролиферацию клеток остеосаркомы линии HOS позволяет дать оценку его воздействия на опухолевый рост и в связи с этим безопасности его применения. Противоопухолевое действие опиоидов было показано и ранее в других работах [11]. Однако в отдельных публикациях выводы о необходимости использования блокаторов опиоидных рецепторов с целью стимуляции регенерации были сомнительными, поскольку в качестве модели эксперимента использовался «опухолевый эквивалент» нормальных клеток и полученные результаты были ошибочно экстраполированы на нормальные неопухолевые клетки [12]. В нашем эксперименте впервые однозначно были сопоставлены данные о воздействии опиоидов и их блокаторов на рост нормальных и опухолевых клеток на примере сравнения пролиферации ММСК, как малодифференцированных клеток, и клеток остеосаркомы линии HOS, как их «опухолевого эквивалента». Результаты настоящего эксперимента позволяют предположить, что использование Даларгина при лечении костных дефектов может привести к ускорению формирования костной ткани за счет увеличения пролиферативной активности клеток-пред-шественниц (ММСК). Кроме того, важно отметить противоопухолевый эффект Даларгина, который выражается в ингибировании роста опухолевых клеток линии HOS. В многочисленных работах обсуждается наиболее эффективная дозировка Даларгина для воздействия на опиоидные рецепторы. Установлена логарифмическая зависимость между дозой Даларгина и оказываемым им эффектом [7, 13]. Результаты этих работ указывают на то, что оптимальная дозировка составляет 10 мкг/л и 100 мкг/л. В нашей работе при сравнении этих доз наибольший эффект 8. Бухарова Т.Б., Арутюнян И.В., Шустров С.А. и др. Тканеинженерная конструкция на основе мультипотентных стромальных клеток наблюдался при концентрации 100 мкг/л. Поскольку Даларгин - вещество пептидной структуры, возможную кумуляцию его в организме следует исключить. Таким образом, мы предполагаем, что и при эксперименте на животных in vivo оптимальная концентрация составит 100 мкг/л. Известно, что Даларгин стимулирует 5- и ^-рецепторы [13]. Избирательность блокатора опи-оидных рецепторов Налоксона зависит от его дозы: в концентрации 0,5 мг/л он избирательно блокирует 5-рецепторы, в то время как в концентрации 3 мг/л происходит неизбирательное блокирование опиоид-ных рецепторов всех типов, в том числе ^-рецепторов [14]. В настоящей работе при одновременном использовании Даларгина и Налоксона в концентрации 0,5 мг/л статистически значимых различий с группой 5 (налоксон в концентрации 3мг/л) выявлено не было. Эти данные позволяют предположить, что Даларгин оказывает действие преимущественно за счёт стимулирования 5-рецепторов.

About the authors

A. V Vasilyev

Research Institute of Human Morphology of RAMS; Research Centre of Medical Genetics of RAMS

Moscow, Russia

T. B Bukharova

Research Centre of Medical Genetics of RAMS

Moscow, Russia

A. V Volkov

Research Institute of Human Morphology of RAMS

Moscow, Russia

E. B Vikhrova

Research Centre of Medical Genetics of RAMS

Moscow, Russia

G. B Bolshakova

Research Institute of Human Morphology of RAMS

Moscow, Russia

D. V Goldstein

Research Centre of Medical Genetics of RAMS

Moscow, Russia

References

Supplementary files