Activity index of lymphocyte apoptosis in children with neonatal sepsis

Full Text

Дисфункция иммунной системы является одним из важнейших звеньев патофизиологии сепсиса и может иметь решающее значение в исходе заболевания. Особенно актуально это положение в раннем детском возрасте - периоде жизни человека, характеризующимся незрелостью факторов врожденного иммунитета и практически полным отсутствием адаптивных иммунных реакций, что и объясняет высокий уровень заболеваемости сепсисом в данной возрастной группе [1]. Известно, что иммунный ответ при сепсисе имеет двухфазный характер [2]. Первая фаза (стадия воспаления) протекает с преобладанием синдрома системного воспалительного ответа (ССВО), проявляющегося преимущественным синтезом провоспалительных цитокинов и других маркеров воспаления: С-реактивного белка (СРБ), прокальцитонина, ряда других «острофазных» протеинов, характерными изменениями в периферической крови в виде лейкоцитоза или лейкопении. Массивный, неконтролируее-mail: boichuksergei@mail.ru мый выброс медиаторов воспаления характерен для тяжелого сепсиса и септического шока. Именно этот так называемый «цитокиновый шторм» формирует в такой ситуации картину полиорганной недостаточности [3]. Вторая фаза иммунного ответа (стадия иммуносупрессии) характеризуется формированием противовоспалительного ответа (СПВО) [4]. Иммуносупрессия и развивающийся при этом иммунный паралич становятся основными причинами летального исхода в эту фазу сепсиса [5]. Одним из основных факторов, приводящих к развитию такого рода состояния, является апоптоз иммунокомпетентных клеток. Апоптоз, генетически программируемая гибель клеток, лежит в основе патогенеза разного рода заболеваний (онкологических, аутоиммунных), в том числе и инфекционных (ВИЧ-инфекция, сепсис) [6, 7]. Индукция этого процесса может проходить двумя путями: либо через экспрессию Fas-рецепторов цитоплазматической мембраны (внешний путь), либо через снижение мембранного потенциала митохондрий (внутренний путь) [6]. Лабораторными маркерами апоптоза иммунокомпетентных клеток являются: выраженная экспрессия белков CD95 (Fas-рецептор) и CD120 (рецептор к фактору некроза опухолей), снижение мембранного потенциала митохондрий и высвобождение цитохрома С, транслокация фосфа-тидилсерина с внутренней на наружную поверхность мембран клеток, повышение активности каспаз [6, 8]. К характерным морфологическим признакам апоптоза относят дегидратационное сжатие клеток, утрату межклеточных контактов, блеббинг, разрушение цитоскелета, конденсацию хроматина, фрагментацию ядра и деградацию ДНК [9]. В результате сепсис-индуцированного апоптоза снижается количество клеток врожденного и адаптивного иммунитета: CD4+-, 008 + -лимфоцитов, В-лимфоцитов и дендритных клеток [10-12]. Результаты морфологического исследования тканей людей, умерших от сепсиса, также подтверждают наличие выраженного апоптоза иммунных клеток [5, 11, 13]. Результат развития такого рода феномена - патологическое снижение эффективности иммунного ответа и ухудшение клиренса внутренних сред организма [14]. При этом выраженность апоптоза лимфоцитов прямо коррелирует с тяжестью септического процесса и степенью иммуносупрессии [15]. Помимо иммунной системы, аналогичные изменения регистрируется в клетках паренхиматозных органов, эндотелии сосудов и лежат в основе механизма органной дисфункции у пациентов с сепсисом [16]. Показано, что эффективное подавление апоптоза при сепсисе снижает и риск развития полиорганной недостаточности, и, соответственно, летального исхода [17]. Поэтому оценка активности апоптотических процессов потенциально может быть использована как в диагностике развивающейся иммуносупрессии, так и в оценке прогноза заболевания. Ранее нами на основе учета числа клеток со сниженным мембранным потенциалом была показана высокая активность процессов апоптоза лимфоцитов у детей с поздним началом неонатального сепсиса [18]. Однако этот параметр отражает лишь начальную, потенциально обратимую стадию процесса. Необратимость же апоптотических изменений в поздней, завершающей стадии характеризуется фрагментацией ядра и ДНК клеток. Поэтому в настоящем исследовании, продолжая изучение процессов апоптоза при сепсисе новорожденных, мы попытались оценить факт его возможной обратимости на основе учета вышеуказанных феноменов фрагментации ядра и ДНК клеток. Целью данного исследования являлаясь оценка активности апоптоза лимфоцитов крови у детей с неонатальным сепсисом на основе учета необратимых изменений в клетках. Материал и методы Проведено исследование методом «случай-контроль». Обследовано 15 детей (основная группа) с поздним началом неонатального сепсиса. Доношенными родились семеро (46,7%), недоношенными - 8 детей (53,3%), из них на сроках 28-30 недель гестации - шестеро, 35-36 недель - двое. Диагноз «сепсис» был установлен с учетом развития ССВО: повышение концентрации в крови СРБ более 1,5 мг/дл, наличии одного или нескольких очагов инфекции, выделения микроорганизма из венозной крови. Эти критерии и были условием включения детей в группу наблюдения. В 8 случаях (53,3%) сепсис развился на 6-7 сут., у семерых (46,7%) - на 10-26 сут. после рождения. У 5 детей отмечалось поражение пищеварительного тракта (язвеннонекротический энтероколит, у 3 детей осложнившийся перитонитом), еще у 7 была выявлена пневмония, в одном случае - гнойный менингит, у 2 детей имело место одновременное развитие пневмонии и энтероколита (у одного из них развилась полиорганная недостаточность). 10 детей находились на ИВЛ различной продолжительности. Этиология неонатального сепсиса была установлена только в 4 случаях (26,7%): у 3 детей в результате выделения микроорганизма из крови (в первом случае - Klebsiella pneumoniae, во втором - Pseudomonas koreenses, в третьем - грибы рода Candida), у одного ребенка (с гнойным менингитом) - при обнаружения в ликворе антигена стрептококка группы В (St. agalactae). Сводная информация по всем пациентам представлена в таблице 1. Таблица 1. Клинико-лабораторная характеристика детей с неонатальным сепсисом N Пол Сроки гестации при рождении, нед. День начала сепсиса (со дня рождения) Топический диагноз Уровень СРБ (мг/дл) Количество лейкоцитов в крови (х 109/л) Количество лимфоцитов в крови (х109/л) 1 ж 28 18 Пневмония, энтероколит 1,5 9,74 2,25 2 м 30 22 Энтероколит, перитонит 8,66 3,9 1,09 3 м 36 7 Энтероколит, перитонит 6,78 6,9 2,6 4 ж 30 5 Пневмония 11,29 41,5 5,8 5 ж 28 12 Пневмония, энтероколит 1,5 15,04 1,65 6 м 38 10 Пневмония 1,5 16,6 4,3 Окончание таблицы 1 N Пол Сроки гестации при рождении, нед. День начала сепсиса (со дня рождения) Топический диагноз Уровень СРБ (мг/дл) Количество лейкоцитов в крови (х109/л) Количество лимфоцитов в крови (х109/л) 7 м 39 5 Пневмония 1,5 28 5,5 8 м 38 5 Пневмония 2 9,54 3,2 9 м 38 25 Энтероколит 1,7 15,7 10,8 10 ж 40 24 Энтероколит, перитонит 3,5 12,96 4,7 11 ж 38 7 Энтероколит 14,1 18 3,5 12 ж 41 6 Пневмония 2,5 15,98 3,6 13 м 29 6 Пневмония 2,6 37,9 5,3 14 ж 30 7 Пневмония 1,7 30,9 4,0 15 м 35 26 Менингит 1,5 12,5 6,2 СРБ - С-реактивный белок. Случаев летального исхода среди обследованных нами больных не зарегистрировано (все наблюдаемые дети остались живы). Кровь от больных забиралась однократно в период развернутых клинико-лабораторных проявлений сепсиса. Контрольную группу составили 5 здоровых новорожденных, забор крови которым осуществлялся перед проведением БЦЖ-вакцинации. В качестве маркера фрагментации ядер клеток и деградации ДНК [10] использовали количественную оценку гиподиплоидных клеток по изменению интенсивности их окраски пропидия йодидом (Sigma Aldrich) с помощью проточной цитометрии (FACsCanto II, Becton Dickinson) [19]. Статистический анализ полученных данных был выполнен с использованием непараметрических методов с применением пакета программ Statistica for Windows 6,1 (Statsoft Inc., США) и программного обеспечения MSExel (Microsoft). Результаты Установлено, что поздний неонатальный сепсис во всех наблюдавшихся случаях протекал на фоне повышенной активности процессов апоптоза. Большое число измененных клеток отмечалось уже в 1 день исследования (в день забора крови). Однако наиболее показательные, статистически значимые изменения регистрировались на 3 и 5 день культивирования лимфоцитов (табл. 2), что наглядно демонстрирует феномен динамичного подавления жизнеспособности пула иммунокомпетентных клеток при сепсисе. Вероятно, в итоге это может способствовать развитию иммунодепрессии в данной ситуации. В литературе имеются сообщения о том, что показатели активности процессов апоптоза среди циркулирующих в крови лимфоцитов при сепсисе составляют не менее 10% измененных клеток, в то время как среди здоровых людей эта цифра не превышает 5% [20]. В нашем же исследовании медиана активности изучаемого процесса к 3 дню культивирования достигала 19,6%, в то время, как в контроле - 5,13%. Для оценки возможного влияния зрелости организма новорожденного (сроков гестации) на выраженность апоптоза лимфоцитов был проведен сравнительный анализ этого показателя у доношенных и недоношенных детей. В нашем исследовании статистически значимой разницы между показателями этих групп детей не было выявлено (табл. 3). С учетом того, что апоптоз индуцируется инфекционно-воспалительным процессом, развитие которого всегда сопровождается повышенным синтезом провоспалительных цитокинов, «острофазных белков», изменением числа лейкоцитов, нами проведен сравнительный анализ активности апоптоза лимфоцитов в зависимости от идентифицированного числа лейкоцитов капиллярной крови и численных показателей СРБ. Развитие лейкоцитоза детектировано у 10 детей с неонатальным сепсисом (66,7%), в двух случаях имела место лейкопения (13,3%), у трех детей (20%) содержание лейкоцитов в крови было в пределах нормы. Уровень СРБ был повышен у всех пациентов; выраженность этих изменений составляла 3-22 условных норм. Таблица 2. Показатели активности апоптоза лимфоцитов (в %) у детей с неонатальным сепсисом Группы Сроки культивирования лимфоцитов, сут. 1 3 5 Дети с неонатальным сепсисом (n = 15) 1,58; 0,98-2,51 19,6; 12,87-24,2 24,05; 15,89-40,69 Здоровые дети (n = 5) 0,82; 0,8-0,9 5,13; 5-7,2 8,5; 7,4-8,6 p 0,09 0,009 0,04 Данные представлены как Me (медиана); МКР (межквартильный размах); p - уровень статистической значимости различий между двумя группами. Таблица 3. Показатели активности апоптоза лимфоцитов (в %) у доношенных и недоношенных детей с неонатальным сепсисом Группы Сроки культивирования лимфоцитов, сут. 1 3 5 1. Недоношенные дети (n = 8) 1,54; 1,17-1,8 19,7; 14,53-22 21,2; 13,5-30 2. Доношенные дети (n = 8) 2,46; 0,82-3,27 19,6; 7,9-33,1 25,07; 16,29-58 3. Здоровые дети, (n = 5) 0,82; 0,8-0,9 5,13; 5-7,2 8,5; 7,4-8,6 p 1-2 0,88 0,57 0,2 p 1-3 0,1 0,002 0,03 p 2-3 0,1 0,003 0,04 Данные представлены как Me (медиана); МКР (межквартильный размах); p - уровень статистической значимости различий между двумя группами. Установлено, что активность апоптоза лимфоцитов не ассоциировалась с исходным количественным уровнем СРБ пациентов ни в 1 (Spearman R = 0,42, p = 0,11), ни на 3 (Spearman R = 0,16, p = 0,55), ни на 5 дни культивирования клеток (Spearman R = 0,29, p = 0,29). Сравнение же с уровнем лейкоцитов крови выявило умеренно выраженную прямую корреляцию показателей только в 1 день исследования (Spearman R = 0,52, p = 0,04), тогда как ни на 3 (Spearman R = -0,23, p = 0,4), ни на 5 дни культивирования (Spearman R = -0,31, p = 0,24) подобной зависимости не было выявлено. Результатом активации процесса апоптоза иммунокомпетентных клеток является, как уже указывалось, угроза истощения их пула. Так, в нашем исследовании у 4 пациентов (26,7%) наблюдалась абсолютная лимфопения (менее 2,9х109/л). Это были недоношенные дети (сроки гестации 30-35 нед.), заболевание у них протекало с развитием язвенно-некротического энтероколита. В 2 случаях лимфопения сочеталась с лейкопенией (менее 9х109/л), у троих - с тромбоцитопенией. При этом только у детей с лимфопенией была выявлена бактериемия. При сравнении показателей общего количества лейкоцитов крови и лимфоцитов выявлена корреляция изменений их числа (Spearman R = 0,55, p = 0,03). Обсуждение Индукция апоптоза лимфоцитов при сепсисе является, по-видимому, важным и обязательным фактором формирования дисфункции иммунной системы. Среди причин гибели иммунокомпетентных клеток при сепсисе апоптоз выступает в качестве основной [13]. Традиционно считается, что «всплеск» воспалительной активности характерен для первых суток заболевания. Именно этой стадии сепсиса присущи грубые микроциркуляторные расстройства, шоковая реакция, динамично формируемая полиорганная недостаточность и т.п. Однако нельзя не признать, что морфологические исследования тканей людей, погибших в первые сутки болезни, не всегда позволяют выявить массивные некротические изменения, способствующие в итоге фатальному исходу. По-видимому, причиной тяжелой дисфункции органов в данной ситуации становится иной механизм гибели клеток, не имеющий прямого отношения к реакциям врожденного иммунитета. Высокая активность апоптотических процессов может объяснить этот феномен [5]. Более того, представление о том, что активность воспалительных и противовоспалительных реакций разделена во времени, что они обязательно представляют собой последовательную смену фаз - в определенной степени механистично. Имеются сообщения о появлении признаков ускоренного апоптоза уже в первые 24 ч септического процесса [14]. Наши наблюдения в определенной мере также подтверждают это. Иными словами, мы наблюдаем одновременную, параллельную индукцию процесса гибели клеток при генерализованной инфекции, как в результате некротических, так и апоптотиче-ских изменений. Нельзя исключить и своеобразную компенсацию выраженных воспалительных изменений развернутого проявления сепсиса выбросом цитокинов противовоспалительного действия [21]. Мысль эта не нова, еще в 1997 г. R.C. Bone выделил в патогенезе сепсиса «противовоспалительную компенсаторную реакцию» (compensatory anti-inflammatory response syndrome, CARS) [22]. Выраженность этой реакции может превышать уровень воспаления. В многочисленных описаниях клиники сепсиса у взрослых обнаружить явные признаки преобладания активности той или иной системы практически невозможно. В нашем, сравнительно небольшом исследовании, мы также не выявили каких-либо патогномоничных симптомов доминирования апоптоза. По-видимому, это универсальный тип реагирования, сочетающий хаотический выброс медиаторов разнонаправленных реакций, что даже предлагается именовать синдромом смешанной антагонистической реакции (mixed antagonists response syndrome, MARS). В нашем исследовании у 7 из 15 детей (46,7%) отмечалось поражение кишечника, протекавшего в форме язвенно-некротического энтероколита. В ранее проведенных исследованиях было показано развитие при сепсисе апоптоза как лимфоцитов, так и гастроинтестинальных эпителиальных клеток [20]. Гибель клеток пищеварительного тракта может стать причиной нарушения целостности кишечной стенки, повышения ее проницаемости и транслокации грамотрицательной кишечной микрофлоры в кровоток. Более того, активация апоптоза может быть обусловлена и неинфекционными причинами, в частности, состояниями, сопровождающимися как гипоксией, так и гипероксией, гипо- и гиперкапнией. Группу риска в данном случае составляют новорожденные, родившиеся в состоянии гипоксии и асфиксии, прежде всего недоношенные дети. Повышенная активность апоптоза клеток ассоциируется с такими процессами, как бронхолегочная дисплазия, различные формы ишемически-гипок-сического поражения головного мозга (внутрижелудочковые кровоизлияния, перивентрикулярная лейкомаляция), почечная недостаточность [23]. Заключение Острый период неонатального сепсиса протекает на фоне повышенной активности процессов апоптоза лимфоцитов периферической крови. Использованный в нашем исследовании метод выявления гиподиплоидных клеток, направленный на регистрацию фрагментации ядра, позволил установить факт необратимости апоптоза лимфоцитов у всех обследованных нами пациентов. Наиболее тяжелые формы неонатального сепсиса сопровождались развитием абсолютной лимфопении, что имело место в 26,7% случаев. Активация апоптоза лимфоцитов и обусловленная этим процессом иммуносупрессия является основанием для проведения больным с неонатальным сепсисом иммуностимулирующей терапии. Благодарности Работа Бойчука С.В. и Дунаева П.Д. частично финансировалась грантом Российского Фонда Фундаментальных Исследований (РФФИ) № 13-04-97034 « р_поволжье_а » и выполнялась на оборудовании кафедры патологической физиологии и Центра Коллективного Пользования Казанского государственного медицинского университета (ЦКП КГМУ). Работа Ризванова А.А. частично финансировалась грантом Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых докторов наук МД-433.2013.4 и за счет средств субсидии, выделенной в рамках государственной поддержки Казанского (Приволжского) федерального университета в целях повышения его конкурентоспособности среди ведущих мировых научно-образовательных центров. Работа частично выполнена на оборудовании Научно образовательного центра фармацевтики Казанского (Приволжского) федерального университета.

About the authors

Kh. S Khaertynov

Kazan State Medical University

S. V Boichuk

Kazan State Medical University

V. A Anokhin

Kazan State Medical University

B. R Ramazanov

Kazan State Medical University

P. D Dunaev

Kazan State Medical University

S. F Khaiboullina

Kazan (Volga Region) Federal University

A. A Rizvanov

Kazan (Volga Region) Federal University

A. A Andreeva

Children's Republican Clinical Hospital

M. A Satrutdinov

Children's Republican Clinical Hospital

References

Supplementary files