Detection of apoptosis pathway's molecular lesions in acute megacarioblastic leukemia by RNA-seq

Abstract

Full Text

Острый мегакариобластный лейкоз (ОМЛ М7) представляет собой редкое онкогематологическое заболевание, развивающееся вследствие клональной экспансии поврежденных на генетическом уровне клеток-предшественниц мегакариоцитарного ростка. Известно, что повреждение одного протоонкогена или гена-супрессора опухолевого роста не является достаточным условием для злокачественной трансформации, а потому для описания патогенеза лейкозов используется «пошаговая» модель, согласно которой формирование опухолевого клона начинается с «условно-инициирующей» мутации. Тем не менее, сведения о количестве молекулярных повреждений тех или иных генных кластеров в период клинической манифестации лейкоза в доступной литературе отсутствуют. Цель исследования - оценить возможность применения технологии массивного параллельного секвенирования транскриптома (RNA-seq) для идентификации молекулярных повреждений генов белков апоптоза и нефункционирующих звеньев аппарата программируемой гибели опухолевых клеток при остром мегакариобластном лейкозе. Материал и методы. Исследована проба аспирата костного мозга грудины от больного 49 лет с впервые выявленным ОМЛ М7, верифицированным цитологически и иммунофенотипически. При стандартном цитогенетическом исследовании лейкозных клеток (G-banding) определялся нормальный кариотип (46, XY). Тотальную РНК из опухолевых клеток выделяли набором реагентов «QIAamp RNA Blood Mini Kit». После выделения РНК секвенировали на полногеномном секвенаторе HiSeq 2000 (Illumina, США) в соответствии с протоколом производителя. Получены ~42,4 млн 100-нуклеотидных односторонних последовательностей с Q-оценкой > 15 по системе оценки качества секвенирования PHRED. Выравнивание последовательностей проводили по алгоритму COBWeB (Strand, США) относительно референсного генома человека hg19 и базы последовательностей транскриптов RefSeq от 01.04.2013. После выравнивания идентифицирована геномная локализация для ~31,9 млн последовательностей (~73%), неидентифицированные последовательности исключены из анализа. Выявление SNP для целевых генов, участвующих в процессах программируемой клеточной гибели (каспазы, Вс12-семейство белков, TP53 и другие, в соответствии с http://www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?hsa04115+7157), проводили посредством алгоритма МАОс (Li et al., 2008). Идентификацию известных SNP проводили по базе данных dbSNP137, функциональные последствия SNP оценивали по базе данных dbNSFP 2.0 (Liu et al., 2013). Результаты и обсуждение. Точечные мутации определены в 9 целевых генах и были представлены двумя инсерциями, приводившим к сдвигу рамки считывания, и двенадцатью несинонимичными нуклеотидными заменами (таблица). Среди замен нуклеотидов преобладающим вариантом были транзиции (8 наблюдений), из них 5 - в пуриновых остатках. В четырех генах (ATM, CASP7, PIDD, TNFRSF10B) одновременно определялись по две мутации, в остальных - по одной. Гомозиготные мутации определены в пяти генах (ATM, CASP7, CASP9, CHEK и TP53), гетерозиготные - в шести. В генах ATM, ATR и PIDD впервые выявлены гетерозиготные инсерции ins(1409) AATTC, ins(3517)A и замена C974T, соответственно. Таким образом, в исследованном случае ОМЛ М7 апоптозный каскад имеет несколько молекулярных дефектов - как на уровне регуляторов апоптоза (ATM, TP53), так и каспаз. Оказывался заблокированным внутренний путь активации апоптоза через каспазу 9 наряду со снижением эффективности реализации внешнего пути (мутации BID и CASP10), а также дублер ключевой эффекторной каспазы 3 - каспаза 7. Результаты детекции точечных мутаций при ОМЛ М7 Ген Экзон Мутация* Зиготность Кол-во ридов dbSNP Id Изменения в белке ATM 8 ins(1409)AATTC гетеро 10 новая FS** 40 A6333G гомо 45 rs659243 N->S ATR 17 ins(3517)A гетеро 12 новая FS** BID 3 C682G гетеро 103 rs201438109 S->T CASP7 8 C919G гомо 53 rs2227310 T->S 8 G934A гомо 53 rs2227309 R->K CASP9 5 T738C гомо 23 rs1052576 Q->R CASP10 10 T1982A гетеро 49 rs13006529 L->I CHEK1 13 A2308G гомо 22 rs506504 I->V PIDD 4 C974T гетеро 22 новая R->Q 6 T1139C гетеро 28 rs10902221 Q->R TNFRSF10B 1 G388A гетеро 41 rs1129424 P->L 5 A865G гетеро 49 rs13265018 V->A TP53 4 G417C гомо 28 rs1042522 P->R - позиция указана по последовательности кДНК; ** FS - фреймшифт. Заключение. Таким образом, идентификация конкретных молекулярных дефектов при остром ме-гакариобластном лейкозе методом RNA-seq позволяет выявлять нефункционирующие звенья апоптоти-ческого каскада опухолевых клеток, что может быть использовано для персонифицированного подхода к лечению пациентов. При этом, себестоимость определения мутаций для всего транскриптома оказывается на два порядка ниже, а затраты по времени - на три порядка ниже в сравнении с прямым автоматическим секвенированием по Сэнгеру.