Algorithm for estimating the safety of autologous cell cultures for clinical trials

Abstract

Full Text

Обобщение результатов исследований в области культивирования постнатальных человеческих клеточных линий, предназначенных для применения в клинике, позволило разработать четырехэтапный алгоритм, направленный на обеспечение безопасности клеточной терапии. Алгоритм включает: 1 - анамнестические данные; 2 - данные врачебного осмотра; 3 - результаты лабораторных исследований, в том числе исследования клеточных культур; 4 - результаты тестового введения клеток. Потенциальную инфицированность возбудителями социально-значимых заболеваний (ВИЧ, вирусные гепатиты В, С, цитомегаловирусная инфекция, туберкулез, токсоплазмоз, инфекции, вызываемые Chlamydia spp.) устанавливали иммунофлюоресцентным и иммунополяризационным методами с использованием закрытых систем (Abbot Lab) на анализаторе AxSym или с помощью ПЦР-анализа (с применением наборов Flash). Важной составляющей мониторинга является оценка в культурах потенциала неоплазии. В наших исследованиях для анализа мутаций используется ДНК, выделенная из культивируемых клеток, культуральной жидкости и, с целью подтверждения неогенеза, - из крови испытуемых. Анализируются мутации в генах р53 кодон 175 (1 мутация), кодон 248 (3 мутации), кодон 273 (4 мутации), B-raf (2 мутации), K-ras (2 мутации). Анализ ДНК на наличие мутаций проводили в соответствии с трехэтапной схемой: 1) скрининг на наличие изменения структуры экзонов генов-супрессоров опухолевого роста и протоонкогенов с использованием SSCP-анализа; 2) уточнение структурных изменений в экзонах посредством аллель-специ-фичной ПЦР и рестрикционного анализа экзонов; 3) верифицикация типа и положения мутации, а также количества мутантных аллелей в образце в ходе RT-ПЦР. В предварительных слепых исследованиях 33 образцов крови больных с морфологически идентифицированной онкологической патологией I-II стадий различной локализации и 8 контрольных образцов было подтверждена высокая достоверность метода - 94% (от 1 до 2 исследуемых мутаций было выявлено в 31 образце крови, в 2 образцах крови больных и в 8 контрольных образцах мутаций не обнаружено; вероятность ложноотрицательного результата 6%). В 390 исследованных краткосрочных культурах фибробластов неогенез мутаций in vitro был подтвержден. Так, в клетках одной из культур, полученной из эксплантата кожи испытуемой Н., была выявлена мутация в 248 кодоне гена р53 (G248C), получившая подтверждение в процессе выполнения всех этапов определения мутантных генов. Мутация была выявлена в клетках одной из культур после 3-го пассажа клеток. Однако в других параллельных культурах испытуемой, а также в образцах ее периферической крови мутаций в гене р53 не найдено, что послужило основанием только для выбраковки единичной культуры, содержащей мутантную ДНК. Полученные результаты хорошо согласуются с проведенными исследованиями, подтверждающими наличие элементов генетической нестабильности при длительном культивировании клеточных линий, а единичный положительный результат может свидетельствовать о том, что при сроках культивирования до 30 сут. зарегистрированное генетическое событие является сравнительно редким. Наряду с этим, как показывают проведенные исследования, необходимо одновременное исследование не только ДНК культивируемых клеток донора-реципиента, но и его крови, в связи с возможностью проявления уже имеющейся в клетках организма мутации. Отсутствие изменений ДНК периферической крови будет свидетельствовать о возникновении мутации de novo. Таким образом, проведенные исследования подтверждают возможность использования разработанной методики для многоступенчатого поэтапного контроля генетической стабильности культивируемых клеток, предназначенных для практического применения в аутогенном варианте.