Поиск Кабинет

Не CRISPR\Cas9 единым: новые технологии для геномного редактирования

И. Яковлев

Система CRISPR\Cas9 стала наиболее доступным и популярным инструментом геномного редактирования, с момента первой публикации в 2012 году количество исследований с применением этой системы ежегодно удваивается [1], появляются новые модификации, федеральная комиссия по биобезопасности и этике США выдала разрешение на проведение первых клинических испытаний с использованием этой системы геномного редактирования [2], а команда китайских исследователей под руководством онколога Лу Ю планирует осуществить ex vivo модификацию Т-клеток для введения пациентам с раком легкого [3]. Как же будет развиваться это направление дальше? Какие новые технологии могут ускорить развитие или преобразить область геномного редактирования и генной терапии?

Существует 2 класса CRISPR\Cas систем. Нуклеаза Cas9 относится к классу 2, тип II, осенью 2015 года группой исследователей из лаборатории Feng Zhang была продемонстрирована возможность использовать нуклеазу Cpf1, соседа Cas9 по классу (тип V), для осуществления редактирования ДНК. Для функционирования CRISPR\Cpf1 необходима только 1 молекула гидовой РНК (гРНК), в отличие от CRISPR\Cas9, в составе которой должны существовать 2 молекулы. Для распознавания целевого участка ДНК в его составе должны быть PAM последовательности (Protospacer Adjacent Motif), которые определяют место взаимодействия ДНК и редактирующей системы. Cpf1 использует иные PAM последовательности, а также может произвести разрез на большем расстоянии от PAM, что расширяет возможности взаимодействия с различными участками ДНК. Кроме этого, при разрезании Cpf1 участка ДНК, возникают выступающие 5′-концы, которые, в отличие от тупых концов, формирующихся при действии Cas9, позволяют произвести более эффективную достройку нового участка. [3]

 CRISPR\Cas9  CRISPR\Cpf1
 Структура  2 РНК  (crRNA+tracrRNA=gRNA)  1 РНК (crRNA)
 Тип разреза  Острые концы  Тупые концы  (выступающие)
 PAM  NGG  TTN

В мае 2016 была представлена новая система для геномного редактирования, построенная по аналогичному CRISPR\Cas9 принципу гид-нуклеаза. Несмотря на общий принцип работы, NgAgo-gDNA имеет ряд значительных отличий. В основе системы – белок Argonaute, выделенный из Natronobacterium gregoryi, который, как и Cas9, участвует в механизме защиты от чужеродных ДНК у бактерий. Второй элемент – одноцепочечная гидовая ДНК (оцДНК), что также рознит эту систему с CRISPR\Cas, где гидом является РНК. Эта ДНК может состоять из 24 нуклеотидов, в отличии от CRISPR-РНК, лимит которой составляет 20 нуклеотидов, для функционирования системы требуется 5’ фосфорилированная оцДНК, крайне редко встречающаяся в клетках человека, к тому же свойством нуклеазы NgAgo является феномен, обозначенный в зарубежной литературе как «преданность одному гиду». Внедрение гДНК возможно только в период, когда в клетке происходит синтез этой нуклеазы, поэтому вероятность нецелевого действия посредством аналогичных присутствующих молекул практически исключена.

Еще одним плюсом является высокая чувствительность к замене даже одного нуклеотида в гидовой последовательности, так как нежелательная нуклеотидная замена может привести к нецелевому разрезу. Экспериментально показано снижение эффективности разрезания участка целевой молекулы до 85%-100% при замене одного нуклеотида.

ngago-gdna

В функционировании CRISPR\Cas систем, как уже упоминалось, важным элементом является PAM, это короткая последовательность, состоящая обычно из трех нуклеотидов, например, 5′-NGG-3′ при использовании фермента SpCas9 [4]. Дизайн гРНК должен учитывать расположение PAM в целевом участке, поэтому можно отредактировать только ту часть генома, которая предшествует этой последовательности. Несмотря на то, что PAM – достаточно часто встречающийся элемент ДНК, необходимость таргетировать гРНК только на области с этой последовательностью накладывают определенные ограничения на возможности исследователей. NgAgo-gDNA позволяет избежать ограничений, связанных с PAM, так как она не требуется для связывания этой редактирующей системы с целевым участком.

 CRISPR\Cas9  NgAgo-gDNA
 Гидовая  последовательность  РНК  5’-фосфорилированная  одноцепочечная ДНК
 Оптимальная длина  гидовой  последовательности  (нуклеотидов)  20  24
 Наличие PAM в  целевом участке  Требуется  Не требуется
 Не функционирует при  замене нуклеотидов в  гиде (к-во нуклеодитов)  >5  >1
 Размер нуклеазы  (аминокислот)  1368  887

Фенг Гао с коллегами провели сравнительный анализ эффективности двух систем на гене DYRK1A, количество разрезов, осуществленных CRISPR\Cas9 и NgAgo-gDNA оказалось практически одинаковым (31.97% для NgAgo и 32.2% для Cas9). Тем не менее в участках генов HBA2 и GATA4, c часто встречающимися нуклеотидами гуанином и цитозином, новая система показала себя более эффективной.

На клетках HEK293T успешно протестировано редактирование ДНК с использованием донорского участка, NgAgo-gDNA показала свою эффективность в восстановлении целостности ДНК посредством механизмов гомологичной репарации. Оценка работоспособности системы на клетках линии HeLa, рака груди MCF7, а также миелоидных клетках человека К562 показала наличие вставок-делеций в гене DYRK1A (последствие разрыва цепи ДНК под действием нуклеазы) в 11,2%, 13,7% и 24,8% случаев соответственно, что говорит о работоспособности системы при применении в различных культурах клеток.

NgAgo, в отличие от Cas, не просто производит разрез цепи ДНК, но и удаляет от 1 до 20 нуклеотидов в целевой последовательности [4]. Это может стать хорошим инструментом для нокаута генов и внесения искусственных мутаций, но негативно сказаться на восстановлении целостности молекулы с помощью гомологичной репарации.

В экспериментах, проведенных Фенг Гао и др. система NgAgo-gDNA показала себя как эффективный инструмент геномного редактирования, обладающий рядом преимуществ перед представителями CRISPR\Cas. NgAgo дает большую свободу в выборе целевого участка, а благодаря высокой чувствительности к нуклеотидным заменам, уникальности его гДНК для клеток человека и большей длине по сравнению с CRISPR вероятность нецелевых разрезов становится еще ниже. На треть меньший размер нуклеазы может облегчить применение геномного редактирования в области генной терапии заболеваний, где необходима замена большого участка ДНК.

Учитывая вышеперечисленные преимущества, но одинаковый уровень двухцепочечных разрезов, осуществленный CRISPR\Cas9 и NgAgo-gDNA, последняя нуждается в более детальном изучении, а также оценке безопасности и эффективности как при редактировании с участием донорской ДНК (гомологичная репарация), так и без (негомологичное объединение концов).

Компания AddGene уже распространила плазмиды, необходимые для работы с этой системой по всему миру [5], поэтому в ближайшее время нас ждет взрывной рост публикаций с использованием этой технологии. NgAgo-gDNA – это не только новая система редактирования, но и важный шаг в развитии генной терапии, повышения доступности этих технологий в практическом и экономическом плане. Появление новых модификаций CRISPR\Cas, а также более дешевых, эффективных и безопасных систем геномного редактирования даст новый импульс к проведению клинических исследований, законодательному и этическому одобрению новых технологий.

Список литературы:

1. И.А. Яковлев, Р.В. Деев, В.В. Соловьева и др. Пред- и посттранскрипционная модификация генетической информации в программе лечения мышечных дистрофий. Гены и Клетки. 2016; 2: 42-52

2. Sara Reardon. First CRISPR clinical trial gets green light from US panel, http://www.nature.com/news/first-crispr-clinical-trial-gets-green-light-from-us-panel-1.20137

3. David Cyranoski. Chinese scientists to pioneer first human CRISPR trial, http://www.nature.com/news/chinese-scientists-to-pioneer-first-human-crispr-trial-1.20302

4. Zetsche B., Gootenberg J. S., Abudayyeh O. O., et al. Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System. Cell. 2015; 163(3), 759 – 71

5. Ширяева А. А., Северинов К. В. Системы CRISPR/CAS бактерий и архей. Как компоненты адаптивной иммунной системы прокариот стали универсальным и эффективным инструментом модификации геномов, исследования эпигеномов и управления транскрипцией генов? В: С.М. Закиян, С.П. Медведев, Е.В. Дементьева, В.В. Власов, редакторы. Редактирование генов и геномов. Новосибирск: Издательство СО РАН; 2016: 133-171

6. Gao F., Shen X.Z., Jiang F et al. DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute. Nature Biotechnology. 2016; 34: 768–773

7. Mary Gearing. Comparing Cas9 to NgAgo: Can the Argonautes Best CRISPR?, http://blog.addgene.org/comparing-cas9-to-ngago-can-the-argonautes-best-crispr

Подписаться на новости
1880
Дата: 25 июля 2016 г.
© При копировании любых материалов сайта, ссылка на источник обязательна.
Подняться вверх сайта