Поиск Кабинет

Звёздчатые клетки печени стимулируют дифференцировку мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга крысы в гепатоциты in vitro

Гены & Клетки: Том VI, №4, 2011 год, стр.: 72-81

 

Авторы

Гумерова А.А., Шафигуллина А.К., Трондин А.А., Газизов И.М., Андреева Д.И., Калигин М.С., Ризванов А.А., Киясов А.П.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Широкое распространение хронических гепатитов и недостаточная эффективность их лечения требуют разработки новых подходов к терапии данной патологии. Одно из перспективных направлений поиска связано с использованием для стимуляции дифференцировки мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) в гепатоциты фактора роста фибробластов 4 и фактора роста гепатоцитов, определяющих первичную дифференцировку эпителиальных клеток передней кишки в гепатоциты в ходе пренатального онтогенеза млекопитающих. Известно, что естественным источником данных факторов в печени являются звёздчатые клетки печени (ЗКП), выполняющие роль микроокружения, необходимого для дифференцировки эпителиальных клеток печени в онтогенезе и при регенерации органа. Целью настоящего исследования стало изучение возможности стимуляции гепатоцитарной дифференцировки ММСК костного мозга крысы путём культивирования в среде, кондиционированной звёздчатыми клетками печени. ММСК культивировали в различных режимах: 1) в свободной от ростовых факторов среде; 2) в среде с последовательным добавлением факторов роста; 3) в культуральной среде, кондиционированной ЗКП; 4) совместно с ЗКП, отделёнными от ММСК полупроницаемой мембраной; 5) в смешанной культуре ММСК+ЗКП. Результаты исследования показали, что вырабатываемые ЗКП в культуральную среду факторы роста и цитокины оказывают выраженное воздействие на ММСК, индуцируя их дифференцировку в гепатобласты и гепатоциты, стойко (в отличие от ММСК, культивированных с факторами роста) сохраняющие экспрессию эпителиальных маркёров и альфафетопротеина. Непосредственные межклеточные контакты ММСК и ЗКП в ко-культуре стимулируют более массовую и выраженную экспрессию гепатоцитарных маркёров в культивируемых клетках по сравнению с монокультурой, однако при этом феномена слияния клеток двух популяций не выявлено. Таким образом, результаты проведённого исследования подтверждают гипотезу о роли ЗКП как важнейшего фактора микроокружения, обеспечивающего реализацию потенций ММСК к дифференцировке по гепатоцитарному пути в условиях in vitro.

Хронические заболевания печени различной этиологии – чрезвычайно актуальная проблема современной медицины. Около 500 миллионов людей в мире страдают только от вирусных гепатитов, ежегодная смертность от хронических гепатитов достигает одного миллиона человек, этот показатель входит в первую десятку среди всех причин смерти и лидирует в гастроэнтерологии [1]. К сожалению, существующие методы терапии заболеваний печени, несмотря на определённые успехи в лечении вирусных гепатитов, остаются недостаточно эффективными, что приводит к высокой частоте развития фиброза/цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы в исходе данных заболеваний. В этом случае единственным методом лечения остается трансплантация печени. Однако существующий дефицит донорской печени, большие листы ожидания, высокая стоимость трансплантации и необходимость последующей иммуносупрессивной терапии диктуют необходимость поиска новых подходов к терапии данной группы заболеваний. Одним из наиболее перспективных путей решения данной проблемы на сегодняшний день является разработка методов клеточной терапии с использованием стволовых клеток.

Впервые вопрос о стволовой клетке печени был поднят в 1958 г. Дж. Вильсоном и Е. Ледуком, которые установили, что целостность ткани печени может восстанавливаться, несмотря на отсутствие пролиферации гепатоцитов [2]. В последующем такая возможность была подтверждена на различных моделях химического повреждения печени веществами, одновременно с повреждением блокирующими пролиферацию гепатоцитов [3–8]. Появляющиеся при этом в перипортальных областях интенсивно пролиферирующие мелкие клетки с узким ободком цитоплазмы и овальным ядром были названы овальными клетками, которые расцениваются как бипотентные эпителиальные предшественники гепатоцитов и холангиоцитов [9]. Именно на изучении этих клеток сфокусировано большинство исследований стволовых клеток печени.

Однако результаты работ, опубликованных в последние годы, внесли существенный диссонанс в общепринятую теорию, рассматривающую овальные клетки как стволовые клетки печени. Так, в 1999 г. впервые было показано, что гепатоциты могут развиваться из кроветворной стволовой клетки, то есть клетки не энто-, а мезодермальной [10]. Сегодня возможность гепатоцитарной дифференцировки кроветворных стромальных клеток [11–15] и мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток (ММСК) [13, 16–19] продемонстрирована во многих экспериментах, что требует изучения механизмов дифференцировки кроветворных стволовых клеток и ММСК в гепатоциты и возможностей управления данным процессом с помощью различных факторов, а также обосновывает поиск региональной стволовой клетки среди мезенхимальных клеток печени.

Одно из перспективных направлений поиска связано с использованием для стимуляции дифференцировки ММСК в гепатоциты факторов роста, определяющих первичную дифференцировку эпителиальных клеток передней кишки в гепатоциты в ходе пренатального онтогенеза млекопитающих. Наиболее значимыми среди них являются фактор роста фибробластов 4 (FGF-4), необходимый на начальном этапе дифференцировки для формирования зачатка печени in vivo [20–23] и фактор роста гепатоцитов (HGF), имеющий важное значение на средних этапах дифференцировки и поддерживающий фетальные гепатоциты [23–25].

Применение данных факторов и их комбинаций уже позволило получить ряд важных результатов. Так, ММСК из разных источников (костного мозга крысы, пуповинной крови человека) при определённых условиях культивирования с использованием дексаметазона, эпидермального фактора роста (EGF), HGF, FGF-1, FGF-4 и онкостатина М в течение трёх недель приобретали морфологию и фенотип гепатоцитов и начинали выполнять ряд специфических для них функций, таких, как синтез мочевины, секреция альбумина, индукция цитохрома р450 [26–31]. При этом важным оказалось применение при культи вировании комбинации FGF-4 и HGF [32–35] – в этом случае отмечены более высокие уровни экспрессии α-фетопротеина (α-ФП), альбумина и цитокератина 18 культивируемыми клетками. Большой интерес вызывает также работа Снайкерса с коллегами [36], в которой было установлено, что добавление FGF-4 и HGF в последовательности, характерной для нормального развития печени, вызывает более быструю и эффективную дифференцировку ММСК в гепатоциты, чем применение обоих факторов одновременно [23].

Полученные данные привели к закономерному вопросу: если гепатоцитарная дифференцировка ММСК наилучшим образом происходит в условиях, имитирующих эмбриональное развитие печени, то не будет ли ещё более оптимальным помещение культивируемых клеток в среду, воспроизводящую их естественное микроокружение в процессе пренатального развития? Известно, что микроокружение клеток формируется главным образом благодаря непосредственным межклеточным контактам с популяцией стромальных клеток и секретируемым ими факторам роста [37]. Какие же клетки могут играть роль такого микроокружения?

По нашему мнению, таким клеточным типом являются звёздчатые клетки печени (ЗКП). Именно они создают микроокружение как для фетального печёночного гемопоэза, так и для дифференцировки гепатоцитов и холангиоцитов в ходе пренатального развития [38–41]. Более того, именно эти клетки являются важнейшим участником восстановления массы клеток паренхимы в ходе регенерации печени, как за счёт вырабатываемых ими макромолекул межклеточного матрикса и его ремоделирования [42], так и за счёт продукции факторов роста [43]. ЗКП продуцируют значительное число морфогенных цитокинов – фактор роста гепатоцитов [44, 45], эпидермальный фактор роста [46–48], мезенхимальный морфогенный протеин эпиморфин [49], плейотрофин [50], эритропоэтин [51, 52], нейротрофин [53], оказывающих влияние на дифференцировку как эпителиальных клеток печени, так и кроветворных стволовых клеток [43]. Они также экспрессируют потенциальный хемоаттрактант для кроветворных стволовых клеток стромальный фактор SDF-1a, стимулирующий их миграцию к месту гемопоэза [54], и Homebox protein Hlx [55], в случае дефекта которого нарушается как развитие самой печени, так и печёночный гемопоэз [56]. Ретиноиды, накапливаемые ЗКП, также являются важным фактором морфогенеза для кроветворных клеток [57] и эпителиев [58].

Исходя из этого, нами была выдвинута гипотеза, что звёздчатые клетки печени могут служить клеточным компонентом микроокружения, необходимым и детерминирующим дифференцировку ММСК в гепатоциты. При этом важно установить, какие именно факторы со стороны ЗКП – растворимые и (или) контактные – оказывают наибольшее влияние на такую дифференцировку. В связи с этим ММСК костного мозга крысы мы культивировали в различных режимах: 1) в свободной от ростовых факторов среде; 2) в среде с последовательным добавлением FGF-4, HGF и инсулин-трансферин-селенит натрия (ITS) и дексаметазона, которые запускают окончательные этапы дифференцировки клеток по гепатоцитарному пути [13, 36]; 3) в культуральной среде, кондиционированной ЗКП; 4) совместно с ЗКП, отделёнными от ММСК полупроницаемой мембраной (boyden chambers) 5) в смешанной культуре ММСК+ЗКП (между ко-культивируемыми клетками осуществляются как химические, так и контактные межклеточные взаимодействия).

Материал и методы

Эксперименты были проведены на культурах клеток, выделенных из белых беспородных лабораторных крыс рода Вистар весом 250–300 г, находившихся на стандартном рационе вивария и имевших свободный доступ к воде. Содержание и использование лабораторных животных соответствовало правилам и требованиям, принятым в учреждении, рекомендациям локального этического комитета и национальным законам. При проведении экспериментов животные были наркотизированы 6,4% раствором хлоралгидрата из расчёта 860 мкл на 100 г массы животного. Объектом исследования были культуры ЗКП и ММСК костного мозга крысы.

Выделение ЗКП проводили методом последовательной перфузии печени следующими растворами [59]: 80 мл GBSS, скорость перфузии 10 мл/мин; 80 мл GBSS в комбинации с 0,264 г проназы (Pronase E, Sigma), скорость перфузии 10 мл/мин; 100 мл GBSS в комбинации с 0,08 г проназы и 0,16 г коллагеназы (Collagenase Type I, Sigma), скорость перфузии 3,33 мл/мин. Далее печень была извлечена, измельчена и инкубирована в растворе GBSS в комбинации с 0,04 г проназы Е, 0,048 г коллагеназы I и 0,08 г ДНК-азы в течение 30 мин. Полученная суспензия непаренхиматозных клеток была разделена в градиенте плотности гистоденза (Histodenz, Sigma), ЗКП локализовались в верхнем слое. После промывки от гистоденза клетки были высеяны на культуральные чашки (125 тыс. кл/мл).

Одновременно из костного мозга крыс путём селективной адгезии к пластику выделяли аутогенные стромальные ММСК. Для этого были выделены бедренные кости, срезаны эпифизы и костный мозг был вымыт из диафизов фосфатно-солевым раствором Дальбекко (DPBS без ионов Ca2+ и Mg2+, ПанЭко). После однократной промывки клеточная суспензия была высеяна на культуральную чашку. Замену питательной среды проводили через каждые 2 сут.

Все работы с культурами клеток проводились в асептических условиях в ламинарном шкафу второго уровня защиты с соблюдением общепринятых правил работы. Культивирование ММСК и ЗКП было проведено в питательной среде DMEM (Sigma, США) с 10% содержанием фетальной бычьей сыворотки (Sigma, США) и 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (Sigma) в инкубаторе при 37°C и содержании 5% СО2 во влажной атмосфере.

Для проверки нашей гипотезы мы провели культивирование ММСК в 5 различных режимах:

1) культивирование ММСК в среде, свободной от ростовых факторов – отрицательный контроль;

2) культивирование ММСК в питательной среде с последовательным добавлением факторов роста по схеме [36]: 1 сут. – FGF-4, 10 нг/мкл; 3 сут. – HGF, 20 нг/мкл, далее через каждые 3 сут. была проведена замена питательной среды с добавлением смеси HGF (20 нг/мкл), ITS и дексаметазон (20 нг/л);

3) культивирование ММСК в кондиционированной среде ЗКП;

4) культивирование ММСК совместно с ЗКП на внутрилуночковых вставках (boyden chambers – полупроницаемые мембраны, отделяющие культуры клеток друг от друга и обеспечивающие циркуляцию питательной среды между ними);

5) культивирование ММСК и ЗКП в контактной ко-культуре (соотношение ММСК:ЗКП = 1:1). Для дифференциации двух клеточных популяций было проведено витальное мечение клеток флуоресцентными красителями: зелёным PKH67 (Sigma) для ЗКП и красным PKH26 (Sigma, США) для ММСК согласно методике фирмы-производителя (трипсинизированная культура клеток была отмыта от сыворотки в бессывороточной питательной среде, ресуспендирована в специализированном буфере Diluent C (Sigma, США), инкубирована с красителем (5 мкл красителя на 2,5 млн клеток) в течение двух минут, после чего действие красителя было прекращено путём добавления сыворотки, окрашенная культура была рассеяна на чашку).

Морфологические признаки клеток оценивали методами фазово-контрастной, флуоресцентной и световой микроскопии. Для исследования влияния факторов ЗКП на фенотип ММСК и возможность дифференцировки ММСК в гепатоциты было выполнено иммуноцитохимическое окрашивание опытных и контрольных культур на разных сроках культивирования. В работе были использованы коммерческие моноклональные антитела фирм DAKO (Denmark) и Novocastra (UK) к различным мезенхимальным, эпителиальным, в том числе гепатоцитарным маркёрам, а также к маркёрам стволовых и прогениторных клеток (табл.). Иммуноцитохимическое окрашивание было выполнено методом меченых полимеров и стрептавидин-биотиновым методом в различных модификациях с использованием коммерческих визуализационных систем тех же производителей.

Результаты и обсуждение

Культура ММСК (группа 1)

В контрольной культуре ММСК на ранних сроках все клетки экспрессировали виментин. Рецептор к фактору стволовых клеток C-kit присутствовал в большинстве клеток в первые недели культивирования, и в динамике его экспрессия незначительно уменьшалась. Экспрессия десмина на начальных сроках культивирования была выявлена лишь в единичных клетках, к 21-му дню культивирования число позитивных клеток возрастало – практически все ММСК становились десмин-позитивными (рис. 1А). Позднее число десмин-позитивных клеток снижалось. Экспрессия α-ГМА имела похожую динамику, на поздних сроках культивирования число позитивных клеток несколько снижалось (рис. 1Б).

Что касается эпителиальных маркёров, то первые признаки экспрессии цитокератинов (СК) 18 и 19 можно видеть в начале третьей недели эксперимента (16 сут.). Интенсивность экспрессии цитокератинов далее нарастала, позитивные клетки располагались в основном в небольших группах плотноупакованных мелких клеток, и именно в них экспрессия была максимальна (рис. 1В). К 28-м сут. эксперимента практически все клетки экспрессировали СК19 и, несколько слабее, СК18. В эти же сроки единичные клетки позитивно окрашивались с антителами к специфическому эпителиальному антигену ESA. Экспрессия специфических гепатоцитарных маркёров α-ФП и HSA не была выявлена ни на одном сроке эксперимента.

Результаты этой серии экспериментов позволили нам впервые показать возможность спонтанной эпителиальной дифференцировки ММСК костного мозга крысы, о чём свидетельствовало появление в них цитокератинов и ESA. Однако данные белки не являются специфичными только для эпителиальных клеток печени, поэтому в данном случае говорить о дифференцировке ММСК именно в клетки гепатоцитарного ряда нельзя, хотя её можно предполагать.

Культура ММСК с последовательным добавлением факторов роста (группа 2)

В данной группе отмечено более раннее формирование монослоя по сравнению с контролем (8-й день эксперимента, 5-й день после добавления HGF). Интересно, что часть клеток монослоя имела два ядра, что является одним из характерных признаков гепатоцитов [60].

Первую неделю культивирования под действием FGF-4 лишь очень немногие клетки экспрессировали десмин и α-ГМА. После добавления HGF число десмин-позитивных ММСК возрастало, и при культивировании в смеси HGF-ITS-Dex они группировались в островки (11-й день эксперимента). Также были видны и отдельно лежащие десмин-позитивные клетки (рис. 2А). После добавления HGF экспрессия α-ГМА также несколько нарастала, а затем снижалась при культивировании в смеси HGF-ITS-Dex (так же, как это происходило и в контроле). При этом единичные α-ГМА-позитивные клетки располагались на периферии описанных клеточных островков.

Добавление факторов роста к культуре ММСК приводило к более раннему началу экспрессии эпителиальных маркёров – уже через 5 дней культивирования в единичных клетках появлялся СК19. Более того, в эти же сроки в клетках можно было видеть Рис. 2. Культура ММСК с последовательным добавлением факторов роста (группа 2): А – экспрессия десмина в клеточных островках и отдельных клетках, 11 сут. культивирования; Б – экспрессия α-ФП, 5 сут.; В – экспрессия СК19, более выраженная в мелких отростчатых и округлых клетках, 5 сут., Г – нарастание числа СК19-позитивных клеток после добавления к культуре смеси HGF-ITS-Дексаметазон, 11 сут. Ув.: А, В ×10; Б, Г ×20 и α-ФП (рис. 2Б). Экспрессия эпителиальных маркёров нарастала после добавления HGF: СК19 присутствовал почти во всех клетках, экспрессия была более выражена в мелких отростчатых и округлых клетках (рис. 2В), начиналась экспрессия СК18, дающая паттерн окрашивания, подобный СК19, но менее интенсивный. Также нарастала экспрессия α-ФП. Во время культивирования в смеси HGF-ITS-Dex число мелких округлых клеток с наиболее выраженной экспрессией цитокератинов возрастало, и они были сгруппированы в островки (рис. 2Г). На третьей неделе экспрессия α-ФП начинала снижаться, а к концу эксперимента снижалась и экспрессия цитокератинов.

Паттерн экспрессии маркёров стволовых клеток мало чем отличался от контроля – ММСК экспрессировали только C-kit с тенденцией к снижению по мере дифференцировки клеток в ходе эксперимента.

Таким образом, добавление факторов роста в культуральную среду по предложенной схеме [36] действительно ускоряет и стимулирует дифференцировку ММСК не только в эпителиальные клетки, как это было в контроле, но и в гепатобласты, на что указывает появление в клетках α-ФП – секреторного белка, характерного для низкодифференцированных клеток ткани печени (гепатобластов).

Культура ММСК-КМ в кондиционированной среде ЗКП (группа 3)

Результаты исследования паракринных влияний со стороны ЗПК на ММСК костного мозга крысы показали, что при культивировании ММСК в кондиционированной ЗПК среде происходит изменение морфологии ММСК уже на второй день культивирования – клетки уменьшались в размерах, приобретали округлую форму, отростки их укорачивались (рис. 3А). К пятым суткам культивирования можно было наблюдать значительное возрастание числа ММСК по сравнению с контролем (группа 1).

Изучение фенотипа клеток позволило выявить, что растворимые факторы роста, выделяемые ЗКП, стимулируют ММСК к интенсивной экспрессии маркёров стволовых клеток – C-kit во всех клетках на всех сроках культивирования (рис. 3Б), на поздних сроках (28 дней) – рецептора к фактору роста гепатоцитов C-met и Bcl-2 в единичных клетках. Интересно, что при культивировании ММСК со средой ЗКП поздних пассажей Bcl-2 появляется в этих клетках раньше (в середине 3-й нед.) и в значительно большем числе клеток.

С другой стороны, экспрессия десмина и α-ГМА была существенно подавлена – на первой неделе экспрессия этих протеинов была выявлена в единичных клетках, далее постепенно их число росло, и наибольшее количество позитивных клеток было отмечено на 14-е сут. (рис. 3В, Г).

Самым же важным является то, что в процессе культивирования (на 3–4 неделях) в ММСК не только начинается экспрессия ESA и цитокератинов, которая по сравнению с контролем была более выражена, особенно в мелких клетках, число которых росло по ходу эксперимента (рис. 3Д, Е), но и практически во всех клетках появлялся α-ФП (рис. 3Ж), а в единичных клетках на 28-й день культивирования – специфический антиген гепатоцитов HSA (рис. 3З).

Результаты проведенного эксперимента позволяют сделать вывод о возможности дифференцировки ММСК в гепатобласты и гепатоциты, и этот путь дифференцировки не запускается спонтанно, а становится возможным под воздействием паракринных факторов со стороны ЗКП. Очень важно, что в данном случае абсолютно исключена возможность слияния клеток двух популяций, что свидетельствует о возможности прямой дифференцировки ММСК в клетки гепатоцитарного ряда. При этом правомочно говорить о фенотипе не только гепатобластов, экспрессирующих α-ФП, но и гепатоцитов, поскольку в конце эксперимента отдельные культивируемые клетки начинали экспрессировать маркёр зрелых гепатоцитов – специфический маркёр гепатоцитов HSA. Таким образом, вырабатываемые ЗКП в культуральную среду факторы роста и цитокины несомненно оказывают выраженное воздействие на ММСК, повышая их потенции стволовых/прогениторных клеток и стимулируя их дифференцировку в гепатобласты и гепатоциты. При этом важно отметить, что по мере культивирования и пассирования самих ЗКП очевидно меняется не только их фенотип, но и композиция вырабатываемых ими факторов, на что указывает изменение паттерна экспрессии Bcl-2 ММСК, культивируемых в среде ЗПК поздних пассажей.

Сравнение же результатов данного эксперимента с результатами, полученными при культивировании ММСК с добавлением факторов роста (группа 2), позволят сказать, что они имеют ряд серьёзных отличий. Во-первых, добавление факторов роста не позволило получить клетки, стойко сохраняющие экспрессию эпителиальных маркёров и α-ФП – к концу эксперимента она существенно снижалась. Во-вторых, в этой группе не удалось получить даже единичных клеток, экспрессирующих маркер зрелых гепатоцитов HSA, тогда как такие клетки были выявлены в культуре ММСК при культивировании в среде, переработанной ЗКП.

Ко-культура ММСК+ЗКП, разделённых полупроницаемой мембраной (группа 4)

Ко-культивирование ММСК с ЗКП на внутрилуночковых вставках (Boyden chambers) показало, что в этом случае с морфологией клеток происходят изменения, подобные описанным для ММСК, культивируемым в кондиционированной среде ЗКП. При этом, однако, выявлены определённые отличия между клетками данных серий экспериментов. Так, в группе 4 экспрессия десмина была достаточно выраженная и сохранялась на всех сроках эксперимента, позитивные клетки располагались вокруг островов.

Экспрессия цитокератинов была выявлена на 3–4-й нед. эксперимента и нарастала в динамике по интенсивности и числу окрашенных клеток. Позитивные клетки преимущественно располагались внутри островков. В эти же сроки отмечена экспрессия α-ФП, однако этот белок присутствовал лишь в единичных клетках. HSA-позитивных клеток не было выявлено ни на одном из сроков эксперимента.

По всей вероятности, обнаруженные отличия между группами 3 и 4 объясняются тормозящими паракринными влияниями со стороны ММСК на звёздчатые клетки печени, что приводит к недостаточному функционированию последних в качестве фактора микроокружения, необходимого для гепатоцитарной дифференцировки ММСК, и процесс этой дифференцировки останавливается на стадии гепатобластов.

Контактная ко-культура ММСК+ЗКП (группа 5)

Результаты флуоресцентной и фазово-контрастной микроскопии показали отсутствие слияния клеток двух ко-культивируемых культур (рис. 4 А–В).

Совместное культивирование ММСК и ЗКП позволило установить, что все клетки смешанной культуры в начале эксперимента экспрессировали виментин, но по ходу эксперимента экспрессия виментина снижалась. Большинство клеток первые две недели также активно экспрессировало десмин и α-ГМА, далее число позитивных клеток уменьшалось, и десминпозитивные клетки были расположены вокруг десминнегативных клеточных островков (рис. 4Г).

Как и в других вариантах культивирования, наиболее стабильной была экспрессия C-kit, на ранних сроках весьма интенсивная и далее постепенно снижающаяся к 3–4-й нед. В смешанной культуре также была отмечена экспрессия и других маркёров стволовых клеток: на 3-й неделе все клетки слабо экспрессировали C-met и Bcl-2, и далее экспрессия последнего, в отличие от C-kit и C-met, нарастала.

Первые эпителиальные маркеры появлялись к концу третьей недели – почти все клетки с разной интенсивностью экспрессировали ESA, СК18, СК19 (рис. 4Д). Экспрессия цитокератинов далее нарастала и была более яркой у СК18. В эти же сроки практически у всех клеток выявлена строгая экспрессия α-ФП (рис. 4Е), однако клеток, экспрессирующих HSA, выявить не удалось.

Результаты данной серии позволят сделать вывод, что непосредственные межклеточные контакты несомненно являются важным фактором для дифференцировки обеих популяций клеток. Если сравнивать данный эксперимент с культивированием ММСК в среде ЗКП (группа 3), то в целом закономерности изменений фенотипа клеток похожи, однако обращает на себя внимание более яркий и массовый паттерн экспрессии гепатоцитарных маркёров. Вполне вероятно, что в данном случае в гепатобласты дифференцируются не только ММСК, но и сами ЗКП (возможность такой дифференцировки ЗКП в монокультуре была показана нами ранее [61]). Однако маркёр зрелых гепатоцитов в клетках при этом не появлялся, что, возможно, связано с конкуренцией клеток в смешанной культуре. С другой стороны, в данном случае в среде присутствовали растворимые факторы, вырабатываемые не только ЗКП, но и ММСК, которые, так же, как и в группе 4, могли препятствовать завершающим этапам гепатоцитарной дифференцировки. Интересно, что экспрессия маркёров стволовых/прогениторных клеток в этом эксперименте оказалась сходной с таковой для ММСК, культивированных в среде ЗКП (группа 3).

В 2008 г. была опубликована статья, в которой было показано, что ЗКП, активированные клетками Купфера, стимулируют ММСК костного мозга к дифференцировке в гепатоциты при контактном кокультивировании [62]. Однако результаты нашего исследования показали, что не только активированные, но и покоящиеся ЗКП обладают такой способностью. Более того, такая дифференцировка осуществляется при культивировании ММСК не только совместно с ЗКП, но и просто в среде, переработанной этими клетками, что свидетельствует о важности именно паракринных влияний со стороны ЗКП на ММСК для реализации ими программы гепатоцитарной дифференцировки.

Нельзя не отметить, что сама вероятность прямой дифференцировки ММСК в гепатобласты/гепатоциты до сих пор вызывает споры. В настоящее время опубликованы работы, как подтверждающие [19, 28, 36], так и отрицающие [63] такую возможность. Результаты нашей работы указывают на реализацию такой дифференцировки под влиянием как добавленных в среду факторов роста, так и под действием растворимых факторов, вырабатываемых ЗКП.

Также существуют опасения, что трансплантированные мезенхимальные и кроветворные стволовые клетки могут дифференцироваться в миофибробласты и таким образом способствовать фиброзированию печени [64]. По нашим данным, исключить такую возможность нельзя, но число α-ГМА-позитивных миофиброластов в изученных культурах имеет тенденцию к снижению в процессе эксперимента, в связи с чем вряд ли целесообразно пренебрегать данными клеточными источниками получения гепатоцитов.

Еще один вопрос, не дающий покоя исследователям, – это механизм появления гепатоцитов из кроветворных стволовых клеток и ММСК. Происходит ли это в результате слияния клеток, или имеет место прямая дифференцировка? Многие склонны считать, что новые гепатоциты появляются в результате слияния ММСК и кроветворных стволовых клеток с полиплоидными эпителиальными клетками [65], однако нам удалось показать в монокультурах всех изученных клеток возможность прямой дифференцировки ММСК в гепатобласты/гепатоциты. Кроме того, факт слияния не был подтвержден и в смешанных культурах клеток при использовании флуоресцентного мечения.

Поводя итог, можно сказать, что результаты проведённого исследования подтверждают гипотезу о роли ЗКП как важнейшего фактора микроокружения, необходимого для поддержания жизнеспособности ММСК и обеспечивающего реализацию их потенций к дифференцировке по гепатоцитарному пути в условиях in vitro, что диктует необходимость продолжения исследований в данном направлении с целью разработки методик получения из ММСК максимального числа функционально активных гепатоцитов и применения полученных клеток в терапии заболеваний печени.

Подняться вверх сайта