Поиск Кабинет

Значение сиалидазы (нейраминидазы) ассоциированной с плазматической мембраной для морфофункциональной пластичности нейральных клеток

Гены & Клетки: Том IV, №2, 2009 год, стр.: 48-54

 

Авторы

Прошин С.Н., Бычков Е.Р., Лебедев А.А., Каминская Е.В., Шабанов П.Д.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Культивирование нейральной клеточной линии NB-1 ней-робластомы человека с дибутирил-цАМФ приводило как к повышению частоты встречаемости нейронов, которые образовывали отростки, так и к повышению активности сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной (САПМ), более чем в 2 раза. Повышение активности САПМ также сопровождалось увеличением количества мРНК этого фермента. В нейральных клетках с высокой активностью САПМ и развитыми отростками также регистрировалось достоверное повышение активности маркера биохимической дифференцировки нейральных клеток-ацетилхолинэстеразы. Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что повышение активности САПМ связано с дифференцировкой нейральных клеток в культуре и предположить возможность использования этого фермента как потенциальной мишени для терапии заболеваний, связанных с повреждением клеток нейрального происхождения, в том числе — нейронов.

Введение

Содержание ганглиозидов в плазматической мембране находится под контролем не только сиалилтрансфе-раз, участвующих в синтезе этих гликосфинголипидов, но и сиалидаз (нейраминидаз), отвечающих за их разрушение. К настоящему времени у млекопитающих выявлено, по крайней мере, четыре типа сиалидаз, отличающихся между собой по клеточной компартментализации и специфичности к субстрату [1—3]. Ранее на грызунах (мыши) было показано, что матричная РНК (мРНК) для сиалидазы, связанной (ассоциированной) с плазматической мембраной клетки (САПМ), выявляется в коре головного мозга, мозжечке, (в клетках зернистого слоя и клетках Пуркинье), а также в гиппокампе [4]. Поскольку ганглиозиды обнаруживаются в избыточном количестве в нервной ткани, можно предположить, что активность САПМ имеет значение в формировании пластичности нейронов [5]. Как известно, способность различных отделов центральной нервной системы к реорганизации была бы невозможна без нейропластичности, которая характеризуется способность нейронов изменять свои функции, химические характеристики и/или структуру (морфологию). Контакт нейрональной клетки с факторами внешней среды осуществляется через плазматическую мембрану, и САПМ может являться непосредственным участником событий, происходящих при аксоногенезе. Образование аксона нейрональной клеткой сопровождается асимметричным перераспределением определённых молекул в плазматической мембране, т.е. поляризацией нейрона [6]. Считается, что активность САПМ приводит к изменению содержания в плазматической мембране высших ганглиозидов и накоплению ганглиозидов с одной молекулой сиаловой кислоты [7]. Ганглиозиды концентрируются в участках плазматической мембраны, получивших название «липидные микродомены», которые также насыщены сигнальными молекулами (киназами) [8]. Получены данные, указывающие, что, изменяя количественный и, главным образом, качественный состав ганглиозидов в микродоменах, САМП способна модулировать активность киназ и, следовательно, реакцию клетки на определённые стимулы [9]. Несмотря на многообразие внешних стимулов, которые воздействуют на клетку, многие из них реализуются через ключевые факторы, к которым, без сомнения, относится циклическая АМФ (цАМФ) [10]. Низкий молекулярный вес цАМФ позволяет этой молекуле быстро диффундировать в клетке и регулировать многие внутриклеточные процессы. В частности, происходит активация сигнальных систем, сопряжённых с протеинкиназой А, которая, в свою очередь, проникая в клеточное ядро, подвергает фосфорилированию цАМФ-зависимый транскрипционный фактор (CREB) [11]. САПМ в своей первичной структуре имеет сайт для фосфорилирования протеинкиназой А, что предполагает регуляцию этой сиалидазы через цАМФ-сопря-жённые сигнальные системы [12, 13]. Цель настоящего исследования, проведенного на клетках нейральной клеточной линии NB-1 нейробластомы человека, состояла в изучении изменения активности САМП под воздействием цАМФ, что важно для понимания механизма формированния морфофункциональной пластичности нервной ткани и выработки терапевтических подходов к лечению соответствующей патологии.

Материал и методы

В работе использовали нейральную клеточную линию NB-1 нейробластомы человека (Health Science Research Resources Bank), которую выращивали на смеси сред RPMI-1640 (45%) и Игла (45%) с добавлением 10% эмбриональной сыворотки коров ИСК) в пластиковых чашках, покрытых поли-Ь-лизином (Falkone). Клетки высевали с плотностью, в среднем 1,5x108 клеток на см2. Через сутки после начала культивирования, когда плотность роста нейральных клеток достигала 50%, клетки инкубировали либо в полной среде (RPMI-1640, среда Игла и ЭСК), либо в бессывороточ-ной среде в течение 24 ч и 48 ч. В эксперименте в среду добавляли (однократно) синтетический аналог цАМФ — дибутирил цАМФ (дб-цАМФ, Sigma, США) в конечной концентрации 2 мМ (рис. 1). Для контроля проводили культивирование в бессывороточной среде. Через 24 ч и 48 ч на инвертированном фазово-контрастном микроскопе (DIAPHOT-TMD, Nikon) регистрировали отростки нейральных клеток, измеряя длину отростка. В каждом случае измерено не менее 600 клеток. В зависимости от длины отростка все нейральные клетки были подразделены на четыре класса: нейральные клетки с короткими (до 12 мкм) отростками (I класс), средними (12— 21 мкм) отростками (II класс), длинными (25^36 мкм) отростками (III класс) и нейральные клетки с отростками более 36 мкм (IV класс) [14]. Для биохимического анализа оценки активности САПМ, лизосомальной сиалидазы (ЛС) и ацетилхолинэстеразы (АХЗ) клетки снимали с поверхности чашек чистым резиновым шпателем и гомогенизировали в охлаждённом фосфатно-солевом буфере (ФСБ, pH 7.0), содержащем 0,5 мМ фенилме-тансульфонилфлюорид, леупептин (10 мкг/мл) и пеп-статин (10 мкг/мл) и центрифугировали при 10ОО об/мин в течение 10 мин при 4°С. Далее в одной части клеточного гомогената определяли активность САПМ, используя в качестве субстрата смесь ганглиозидов (конечная концентрация 0,5 мг/мл, Sigma) в присутствии 0,1 % тритон Х-100. После инкубации в течение 1 ч при 37°С свободные сиаловые кислоты определяли с помощью тиобарбитуровой кислоты (ТБК) и регистрировали продукт реакции (хромофор) при длине волны 549 нм (Victor2) [15]. Активность САПМ выражали в единицах на мг белка — ед./мг белка.

В другой части клеточного гомогената определяли активность ЛС, используя синтетический субстрат 4-метилумбеллиферил-1М-ацетилнейраминовую кислоту (4-МУНАНК) в конечной концентрации 2 мМ. Флуоро-метрическое измерение продукта реакции 4-умбел-лиферона проводили при 450 нм [16]. Активность фермента выражали в единицах на мг белка — ед./мг белка. Активность АХЗ регистрировали по методу Зллма-на [17]. Концентрацию белка в клеточном гомогенате определяли по методу Брэдфорд [18].

Для ОТ-ПЦР из культуральных чашек полностью удаляли питательную среду и далее выделяли РНК из клеток с использованием гуанидинтиоционата и фенол-хлороформа согласно протоколу, предложенному ранее [19]. Для получения комплементарной ДНК (кДНЮ количество РНК выравнивали, разбавляя РНК в 11 мкл воды высокой степени очистки. К каждой пробе добавляли 1 мкл олиго-Т-праймера. Образцы инкубировали при следующих температурных и временных параметрах амплификатора (Amplicon) до внесения обратной транс-криптазы (Superscript II RT): 70°С в течение 10 мин, 3°С в течение 5 мин. Непосредственно перед повышением температуры до 42°С в пробирки вносили по 7 мкл буфера для обратной транскриптазы, смесь нуклеотидов (10 мМ), 0,1 М дитиотрейтола и 1 мкл обратной транскриптазы. Далее инкубацию образцов проводили при 42°С в течение 50 мин. По завершении инкубации образцов при 70°С в течение 15 мин в пробирки добавляли 0,2 мкл РНКазы Н (из расчёта 60 U/мкл) и продолжали инкубацию при 37°С в течение 20 мин. Реакцию останавливали, добавив 480 мкл воды. Условия полимеразной цепной реакции в течение 45 циклов: 94°С — 1 мин, 60°С — 1 мин, 72°С — 2 мин. Прямой праймер: 5’^GACAGAGGGATTACCTACCGGATC-3’, нуклеотиды 55^78 от стартового кодона; обратный праймер: 5 GAGCCATGATTCTGACGGTGTT-3 ’, нуклеотиды 966^987. Образцы нормализовали по уровню экспрессии р-актина [4]. Статистическую обработку данных проводили по t-критерию Стьюдента. Полученные результаты являются экспериментами, проводившимися не менее, чем в трёх повторениях.

Результаты

Результаты показывают, что в нейральных клетках, которые инкубировали в полной среде уже через сутки можно было определить спонтанное образование отростков (в отсутствие дб-цАМФ), что было зарегистрировано по сравнению с исходной (0 ч) клеточной культурой (рис. 2, А) в повышении частоты встречаемости нейральных клеток II класса, т.е. клеток, длина отростков которых составляла от 12^24 мкм (рис. 2, С24).

В культуре клеток, которые выращивали в течение 24 ч в бессывороточной среде, также было зарегистрировано спонтанное (дб-цАМФ (—И образование отростков (рис. 2, В24). При этом ни в нейральных клетках, которые культивировали в бессыворотной среде, ни в нейральных клетках, которые инкубировали в полной среде, в отсутствие синтетического аналога цАМФ, частота встречаемости клеток III класса не превышала 3% (длина отростков 25^36 мкм), а клетки с длиной отростков более 36 мкм (IV класс) не были выявлены (рис. 3, А). Напротив, обработка культур дб-цАМФ уже через сутки позволяла зарегистрировать не только достоверное (р<0,001) повышение частоты встречаемости нейральных клеток III класса, но и выявлять клетки, длина отростков которых превышала 36 мкм (рис. 3, Б). Инкубирование нейральных клеток в течение 48 ч в полной среде в присутствии дб-цАМФ привело к ещё большему повышению частоты встречаемости клеток, длина отростков которых превышала 36 мкм (рис. 2, С48). Достоверное различие с клетками IV класса, которые культивировали в течение 24 ч (рис. 2, С24) также было выявлено (р<0,001). Исследование нейральных клеток, культивируемых в течение 48 ч в бессывороточной среде, но с добавлением дб-цАМФ, позволило выявить достоверные (по сравнению с культурой, инкубировавшейся в течение 24 ч) различия по частоте встречаемости клеток, длина отростков которых составляла менее 24, 25^36 и более 36 мкм при уровне значимости р<0,001, р<0,05 и р<0,01, соответственно (рис. 2, В48). В культуре нейральных клеток, которую инкубировали в течение 48 ч в полной среде, но в отсутствие дб-цАМФ также можно было определить повышение частоты встречаемости клеток III и IV классов (рис. 2, С48). Между культурами нейральных клеток, инкубировавшихся с добавлением или без добавления дб-цАМФ, были выявлены достоверные различия по частоте встречаемости клеток, длина отростков которых превышала 36 мкм (класс IV, р<0,001). В культуре клеток, которые инкубировали в течение 48 ч в бессывороточной питательной среде и без добавления синтетического аналога цАМФ, не определялись нейральные клетки IV класса (рис. 2, В48).

Активность САПМ в исходной клеточной культуре (0 ч) составила 4,2+1,6 ед./мг белка (рис. 4). Через сутки в присутствии дб-цАМФ активность САПМ в нейральных клетках, которые культивировали в полной среде, была зарегистрирована на уровне 8,4+1,5 ед./мг белка. Тогда как в клетках, которые культивировали в бессывороточной среде, активность САПМ повысилась более чем в 2 раза как по сравнению с исходной культурой (0 ч), так и по сравнению с активностью САПМ в клетках, культивировавшихся в отсутствии ЭСК и дб-цАМФ (рис. 4, Б) При этом были выявлены достоверные различия (р<0,05). На 2-е сут эксперимента активность САПМ в нейральных клетках, культивировавшихся в полной среде, показала тенденцию к возотличалась от активности САПМ в нейральных клетках культуры, которая не обрабатывалась дб-цАМФ (рис. 4, А). Напротив, активность САПМ в нейральных клетках, культивировавшихся в течение 48 ч в бессыворотной среде и обработанных дб-цАМФ, снизилась до 8,2 ед./мг белка (рис. 4, Б).

Исследование активности ЛС в клетках NB-1 (табл.) не выявило достоверных различий по данному показателю между контрольной клеточной культурой и в эксперименте — при обработке нейральных клеток дб-цАМФ. Повышение активности САПМ сопровождалось также повышением количества мРНК для этой сиалидазы (рис. 5). Все нейральные клетки, которые обрабатывались дб-цАМФ, продемонстрировали достоверное (р<0,001) повышение количества мРНК (кДНК) по сравнению с контролем и клетками, не обработанными дб-цАМФ (рис. 6).

Следует отметить, что в культурах нейральных клеток, которые были обработаны дб-цАМФ и образовывали длинные отростки, также регистрировалось достоверное повышение активности АХЭ (р<0,001) не только по сравнению с контролем, но и по сравнению с нейральными клетками, которые не обрабатывались дб-цАМФ (рис. 7). Поскольку АХЭ является маркером дифферен-цировки нейральных клеток, можно сделать вывод, что повышение активности сиалидазы (нейраминидазы), ассоциированной с плазматической мембраной, взаимосвязано с образованием отростков при дифференцировке нейральных клеток.

Обсуждение

Зарегистрированное выраженное образование отростков в нейральной клеточной линии NB-1 нейробластомы человека и повышение активности САПМ согласуется с ранее полученными результатами на других нейраль-нах клеточных линиях. Так, выраженное образование отростков нейральными клетками Neuro2A нейробластомы мыши также сопровождалось повышением активности САПМ [4]. Образование отростков нейральными клетками нейробластомы мыши было вызвано 5-бром-дезоксиуридином (БДУ). При этом уже на 3-и сут эксперимента более чем 44% клеток, обработанных БДУ, образовывали отростки, тогда как в контроле этот показатель составил менее 31%. В нейральных клетках Neuro2A нейробластомы мыши, которые образовывали отростки, также было зарегистрировано достоверное повышение ацетилхолинэстеразной активности. Циклический аденозинмонофосфат является фактором, который вызывает образование отростков не только в исследованной нами нейральной клеточной линии NB-1 нейробластомы человека, но и в ряде других клетках нейрального происхождения. В клеточной линии NG108-15 после обработки дб-цАМФ также было обнаружено образование отростков [20]. Являясь вторичным мессенджером, цАМФ вовлечён в разнообразные сигнальные каскады внутри клетки. Вместе с тем, принято считать, что именно сопряжённый с протеинкина-зой А (А-киназа) сигнальный каскад в клетке регулируется цАМФ [21]. К настоящему времени установлено, что и САПМ, и А-киназа в плазматической мембране клетки компартментализованы в липидных микродоменах [22—24]. Можно предположить, что при обработке нейральных клеток (и, в частности, клеток NB-1 нейро-бластомы человека) цАМФ (дб-цАМФ) происходит активация А-киназы, которая функционально — через фос-форилирование, воздействует на САПМ, поскольку установлено, что в своей первичной структуре эта сиа-лидаза имеет участок, который потенциально может быть фосфорилирован А-киназой [11, 12]. САПМ, в свою очередь, активирует факторы, вовлечённые в образование отростков нейральными клетками. Возможно, что САМП, изменяя в результате своей активности количественный и, главным образом, качественный состав ганглиозидов (GM1) в плазматической мембране, вызывает поляризацию нейронов и стимулирует аксо-ногенез (рис. 8). Таким образом, исходя из представленных данных, можно предположить, что САПМ является потенциальным фактором для регенерации аксонов нейронов. Действительно, при исследовании первичной культуры гиппокампа, выделенного из эмбрионов крыс, было установлено, что повышение активности САПМ имело решающее влияние как на аксоногенез, так и на восстановление перерезанных аксонов [14]. Нейроны гиппокампа, в которых регистрировалась высокая активность САПМ, также формировали более длинные аксоны по сравнению с нейронами, в которых активность САПМ выявлялась на низком (базальном) уровне. При повреждении (перерезке) аксона только те нейроны гиппокампа восстанавливали аксоны, чья сиалидазная активность была высокой.

Таким образом, САМП является не только одним из звеньев в механизме, направленном на формирование пластичности нейральной клетки (нейрона), но и потенциальной терапевтической (фармакологической) мишенью в лечении заболеваний, сопровождающихся повреждением нейронов.

Подняться вверх сайта