Поиск Кабинет

Значение экспрессии TLR рецепторов для выбора фармакологической коррекции патологии шейки матки и эндометрия

Гены & Клетки: Том VI, №1, 2011 год, стр.: 91-97

 

Авторы

Прошин С.Н., Глушаков Р.И., Шабанов П.Д., Сайковская Л.А., Семёнова И.В., Тапильская Н.И.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

В работе проведено иммуноцитохимическое исследование клеточного материала, полученного методом жидкостной цитологии из эктоцервикса, эндоцервикса у пациенток с персистирующей папилломавирусной инфекцией, инфицированных вирусами, относящимися к высокой группе онкогенного риска, и из эндометрия женщин, страдающих бесплодием до и после лечения нуклеосперматом натрия (нуклеоспермат-Na). Иммуноцитохимическое исследование материала проводилось с использованием моноклональных антител к CD20, CD56 и Toll-like рецепторам. После лечения нуклеосперматом натрия было зарегистрировано снижение частоты CD20 и CD56-позитивных клеток и повышение частоты клеток, экспрессирующих Toll-like рецепторы 4-го и 9-го типов в исследуемом материале, а также снижение количества вируса папилломы человека высокого онкогенного риска. Полученные результаты указывают на перспективность использования нуклеоспермата натрия в лечении бесплодия, ассоциированного с хроническим аутоиммунным эндометритом, что убедительно подтверждено иммуноцитохимическим исследованием.

Введение

Слизистые оболочки репродуктивной системы являются частью мукозального отдела иммунной системы [1]. Как и все слизистые оболочки, они обладают комплексом факторов неспецифической и иммунной защиты, обеспечивающих в большинстве случаев надежный барьер на пути проникновения патогенов. Иммунная защита слизистых оболочек обеспечивается многими гуморальными и клеточными факторами. В эпителии слизистой оболочки имеются клетки, способные к презентации антигенов. К числу этих клеток относятся антиген-презентирующие дендритные клетки (ДК) и клетки эпителиоциты, осуществляющие транспорт неизмененного или процессированного антигена с поверхности эпителиального пласта.

Врожденный иммунитет – это первая линия защиты от первичного инфицирования и (или) рецидивирующего заболевания [2, 3]. Достоверно установлено, что немедленный ответ врожденной системы иммунитета млекопитающих в ответ на вторжение патогена, главным образом, опосредован через семейство рецепторов, которые получили название TLR-рецепторы или Toll-like рецепторы, что в переводе с немецкого означает «удивительные» рецепторы. Эти рецепторы экспрессируются на макрофагах, нейтрофилах, естественных киллерах, дендритных клетках и распознают высоко консервативные типовые молекулы, свойственные целым группам микроорганизмов, так называемые «патоген-ассоциированные молекулярные образцы» (PAMP-pathogen-associated microbial patterns). Примерами таких структур могут служить компоненты бактериальных стенок: липополисахариды грамотрицательных бактерий, пептидогликаны и липотейхоевые кислоты грамположительных бактерий, флагеллин, вирусные нуклеиновые кислоты [4–8].

К настоящему времени уже клонировано 11 типов данного семейства рецепторов. При этом разные типы рецепторов преимущественно связываются с разными лигандами (антигенами). Однако, несмотря на весьма большое разнообразие рецепторов этого семейства, обнаружилось, что рецепторы 1, 2, 4, 5 и 6 типов TLR связываются преимущественно с бактериальными антигенами, тогда как рецепторы 3, 7, 8 и 9 типов TLR предпочтительно связываются с нуклеотидными последовательностями РНК и (или) ДНК [9–12].

Клинические наблюдения указывают, что самые разнообразные вирусы (вирус простого герпеса, вирус папилломы человека, вирус гепатита В и С, цитомегалавирус, вирус иммунодефицита человека и т.д.) могут инфицировать женский генитальный тракт. В связи с этим особую роль приобретают данные, которые вскрывают механизм формирования немедленного ответа иммунной системы, опосредованный Toll-like рецепторами 3, 7, 8 и 9 типов на вирусную инфекцию. Так, например, считается доказанным, что TLR3 распознает двухцепочечную РНК. Следует отметить, что двухцепочечная РНК (дц-РНК) может возникать из различных источников [13–15]. Геном вириона, инфицирующего организм хозяина, может сам по себе представлять дц-РНК и напоминать, не являясь таким по существу, природный РНК вирус. Однако даже образцы одноцепочечных РНК вирусов часто содержат дефективные частицы, которые первично содержат дефективные двухцепочечные геномы. Внутриклеточная вирусная двухцепочечная РНК (дц-РНК) может быть генерирована различными способами. В случае одноцепочечных вирусов (оц-РНК) образование промежуточных продуктов репликации в виде дц-РНК обязательный этап вирусной продукции. В случае ДНК вирусов комплементарная матричная РНК часто продуцируется таким образом, что синтезируется частично перекрывающимися генами, расположенными на противоположных цепочках генома вируса (двухцепочечного). Длинная вирусная полицистронная матричная РНК часто содержит в избыточном количестве стабильные двухцепочечные «стебельки». Такого рода наблюдения, собранные воедино, указывают, что все вирусные инфекции проходят через стадию двухцепочечной РНК в момент репликации вирусного генома [16]. Недавно было показано, что матричная РНК, поступающая из гибнущих или погибших клеток самого организма-хозяина, активирует TLR3, предполагая, что активация врожденного иммунного ответа через Toll-like рецепторы может встречаться в разнообразных ситуациях [17]. Также было убедительно продемонстрировано, что вторичная структура, формирующая петлю типа «стебель» внутри матричной РНК, ответственна за активацию тех Toll-like рецепторов, лигандами которых являются нуклеиновые кислоты. Было обнаружено, что, например, TLR3 улавливает двухцепочечную нуклеиновую кислоту от Schistosoma mansoni и вовлечен в иммунный ответ против паразитов [18]. К настоящему времени в целом установлено, что ДНК и РНК из разных источников, могут вызывать немедленный иммунный ответ через определенные типы Toll-like рецепторов. Более того, Toll-like рецепторы могут представлять собой мишени для так называемой таргетной терапии. Так вирус папилломы человека в процессе эволюции приобрел феномен «ускользания» от иммунологической защиты человеческого организма. Показано, что 16 тип ВПЧ ингибирует экспрессию Toll-like рецепторов 9 типа на эпителиоцитах и дентритных клетках. В результате созданы лечебные вакцины, нагруженные адъювантами, способными активировать Toll-like рецепторы, экспрессирующиеся на поверхности дентритных клеток. В связи с этим представляет интерес изучение лекарственных средств, вступающих во взаимодействие с TLR. На роль кандидатов, выступающих модуляторами Toll-like рецепторов претендуют, в частности, различные иммуномодуляторы.

В связи с этим целью исследования являлось охарактеризовать уровень экспрессии Toll-like рецепторов в многослойном плоском и цилиндрическом эпителии шейки матки и ткани эндометрия при хроническом эндометрите до и после лечения иммуномодулятором нуклеосперматом-Na.

Материал и методы

Материал, взятый с поверхности эктоцервикса, эндоцервикса и аспират из полости матки, наносился на стекло и немедленно подвергался влажной фиксации с помощью фиксатора «BioFix» (Дания). Зафиксированные таким образом препараты сохранялись в сухом, темном месте в течение нескольких недель до постановки иммуноцитохимической реакции.

Перед началом иммуноцитохимической реакции препараты инкубировались в 50% этаноле в течение 10 мин для того, чтобы удалить фиксатор. Затем дважды промывались в дистиллированной воде и помещались в цитратный буфер (рН 6.0) (Diagnostic BioSystem, K 035, Дания), в котором в дальнейшем проводили термическую демаскировку искомых антигенов. Избыточное количество эндогенной пероксидазы блокировали в течение 10 мин с использованием коммерческого состава «Peroxidase Block», который входит в набор «PolyVue HRP/DAB Detection System» (Diagnostic BioSystem, Дания). По окончании инкубации препараты проводили через отмывочный буфер и наносили первые антитела в следующем формате: для верификации клеток, экспрессирующих антигены, известные как СD20 и NCAM/CD56, были использованы мышиные моноклональные антитела – mouse monoclonal anti B cell, CD20 (clone L26) и mouse monoclonal anti CD56 (clone 123C3.D5), соответственно. Оба продукта были получены от компании «Diagnostic BioSystem» (Дания). Для верификации клеток, экспрессирующих рецепторы TLR4 (Toll-like receptor 4) и TLR9 (Toll-like receptor 9), были использованы мышиные моноклональные антитела к антигенам человека – клон 76В357.1 и клон 26С593.2, соответственно. Оба продукта были получены от компании «Lifespan, Biosciences». Разведения всех первых антител оптимизировались в индивидуальном формате. Инкубация препаратов с первыми антителами проводилась во влажной камере при температуре 37°С в течение получаса. По окончании инкубации препараты трижды промывали в отмывочном буфере и на 10 мин (при комнатной температуре) наносили реагент «Polymer Penetration Enhancer» (Diagnostic BioSystem, Дания), который затем смывали в буфере. Для дальнейшей стадии иммуноцитохимической реакции использовали полимерную систему, направленную против первых антител (Anti-Mouse/Rabbit PolyVue HRP Label из набора «PolyVue HRP/DAB Detection System» (Diagnostic BioSystem, Дания). Препараты инкубировали в течение получаса при комнатной температуре. По окончании инкубации препараты отмывали и визуализировали продукт иммуноцитохимической реакции с помощью хромогена – диаминобензидина (DAB/plus chromogen). Далее препараты тщательно отмывали от раствора хромогена дистиллированной водой и подкрашивали гематоксилином Карраци. Ввиду того, что исследовались цитологические препараты, частота клеток, позитивно меченых моноклональными антителами, выражалась в процентах, а не по системе «Histoscore».

Документирование иммуноцитохимического исследования проводили на микроскопе MD125 Leica (Германия) в лаборатории функциональной морфологии центральной и периферической нервной систем (рук. лаборатории д.м.н. Д.М. Коржевский) Института экспериментальной медицины РАМН (Санкт-Петербург).

Для оценки вирусной нагрузки по ВПЧ (вирус папилломы человека), взятый у пациенток до и после лечения нуклеосперматом-Na материал, исследовали по общепринятому в мировой практике методу – «полимеразная цепная реакция в режиме реального времени» («Real-time PCR») [19].

Результаты

Клетки, позитивные по искомым антигенам, окрашивались в коричневые тона хромогеном диаминобензидином (рис. 1А). Распределение окрашивания в клетках, как правило, неравномерно. В ряде случаев область цитоплазмы, на которую проецируется ядро, также интенсивно окрашивается (рис. 1Б).

Частота клеток в цитологических препаратах эндометрия, экспрессирующих антигены CD20 и CD56 существенно варьирует, что, по-видимому, объясняется разной степенью реакции иммунной системы на вирус папилломы человека (рис. 2А, 2Б). Следует отметить, что в цитологическом препарате, зачастую, клетки могут быть разобщены искусственно, однако, это не снижает ценность иммуноцитохимического исследования слизистой эндометрия.

Иммуноцитохимическое исследование материала эндометрия с использованием моноклональных антител на антиген CD56, NK-клетки могут образовывать скопления, что, по-видимому, указывает на высокую степень инфильтрации эндометрия при хроническом эндометрите (рис. 3). После проведенного лечения нуклеосперматом-Na отмечено снижение инфильтрации слизистой эндометрия клетками, экспрессирующими CD56 антиген (рис. 4). Вместе с тем следует отметить, чтобы достичь более точной оценки частоты позитивно-меченых моноклональными антителами клеток необходимо исследование как можно большего количества полей зрения (а значит большего количества клеток), поскольку при воспалении материал, полученный из эндометрия, зачастую содержит слизь и обеднен клеточным материалом (рис. 5).

У некоторых пациенток клетки, экспрессирующие антиген CD20 можно было обнаружить в цитологическом материале, полученном из цервикального канала. Выявление CD20- и CD56-позитивных клеток в слизистой эндоцервикса не является ординарным случаем. Однако следует отметить, что, часть этих клеток механически (с секретом) поступает из полости матки в нижние отделы генитального тракта.

Иммуноцитохимическое исследование клеток, экспрессирующих Toll-like рецепторы 4 и 9 типов, выявило следующие различия: в материале слизистой эктоцервикса, полученном от пациенток с определяемой высокой вирусной нагрузкой в случае персистенции вирусной инфекции, частота клеток, экспрессирующих оба типа рецепторов, регистрировалась с весьма низкой частотой и составляла менее 1%. В эндоцервиксе частота клеток, экспрессирующих Toll-like рецепторы 4 типа, была заметно выше и превышала 50%. Исследование слизистой эндометрия у пациенток с отсутсивем пизнаков хронического эндометрита показывает высокую частоту экспрессии Toll–like рецепторов 4 типа (рис. 6).

При иммуноцитохимическом исследовании клеток, экспрессирующих Toll-like рецепторы, главным образом рецепторы 9 типа, сигнал в клетке распределяется диффузно (рис. 7). Как известно, TLR, лигандами для которых являются нуклеиновые кислоты, экспрессируются на внутриклеточных (эндосомальных) мембранах [1, 10]. Следовательно, при иммуноцитохимической реакции моноклональные антитела не «задерживаются» на антигенах, которые экспрессируются на плазматической мембране, а проникают внутриклеточно и затем уже связываются с TLR, экспрессирующихся на внутриклеточных мембранах эндосом.

Интересно отметить, что повышение экспрессии TLR9 в эпителии женской репродуктивной системы, надежно верифицированного с помощью проведенного нами иммуноцитохимического теста, было ассоциировано со снижением вирусной нагрузки вируса папилломы человека.

Обсуждение

Как показали ранее проведенные исследования, Toll-like рецепторы (TLR) являются ключевым компонентом врожденного иммунитета [1]. Тот факт, что к настоящему времени клонировано, по крайней мере, 11 типов TLR у млекопитающих подчеркивает эволюционное значение этого типа рецепторов в защите организма (его внутренней среды) от разнообразных патогенов. Экспрессия определенных типов Toll-like рецепторов в нижних и верхних отделах женского репродуктивного тракта различается. Так, с высокой степенью достоверности было обнаружено, что регулярная экспрессия TLR 1-го и 6-го типов, независимо от фазы цикла, регистрируется в эпителии слизистой как верхних, так и нижних отделов репродуктивного тракта: фаллопиевы трубы, эндометрий, эндо- и эктоцервикс и влагалище [4, 20–22]. Интересно отметить, что экспрессия TLR1 (Toll–like рецептора 1-го типа) регистрировалась на NK-клетках и эндотелиальных клетках сосудов эндометрия матки, тогда как экспрессию TLR6 можно было выявить не только, например, на NK-клетках, инфильтрирующих строму матки, но и на фибробластах подслизистой влагалища [21]. Регулярная экспрессия TLR2 (Tolllike рецепторов 2-го типа) регистрируется в клетках слизистой и стромы всех отделов репродуктивного тракта. При этом в стромальных клетках эндометрия экспрессия TLR2 выше по сравнению с клетками однослойного цилиндрического эпителия. Пик экспрессии TLR2 регистрируется в секреторную фазу менструального цикла [22–24]. Одним из ключевых типов TLR в защите от микроорганизмов, несомненно, является Toll–like рецепторы 4-го типа. Лигандом для TLR4 является липид А или эндотоксин, который связан с олигосахаридной цепочкой и О-антигеном. Данные компоненты в комплексе представляют липополисахарид, который является неотъемлемой частью клеточной стенки грамм-отрицательных бактерий (например, Helicobacter pylori). Кроме того, хорошо документированными лигандами для TLR4 также являются Heat-shock белок с молекулярной массой 60 Да, гликосфинголипиды протозоа и ряд белков (антигенов) вирусных капсидов. Однако наиболее важно то, что связывание Toll-like рецептора 4-го типа с молекулами MD-2 и CD14 приводит к мобилизации фактора MyD88. Это, в свою очередь, приводит к фосфорилированию киназы, ассоциированной с рецептором к интерлейкину 1-го типа, олигомеризации фактора 6, ассоциированного с рецептором к фактору некроза опухоли и следующей за данным молекулярным каскадом деградацией молекулы IkB [25, 26]. На клеточном и тканевом уровне связывание TLR4 с молекулами MD-2 и CD14 приводит к активации транскрипции генов, кодирующих различные провоспалительные цитокины, хемокины и ассоциированные с ними факторы, также необходимые для развития дальнейшего иммунного ответа. В контексте клинических данных следует сказать, что применительно к микроорганизмам лигандами для TLR4 является липополисахарид N. gonorrhoeae, липополисахарид и heat-shock белок микроорганизма C. Trachomatis и углевод маннан микроорганизма C. albicans [27–30]. Неудивительно, что TLR4, как рецептор, для которого лигандами являются клинически значимые факторы, экспрессируется клетками слизистой как нижнего, так и верхнего репродуктивного тракта. В нашем исследовании была зарегистрирована экспрессия TLR4 клетками слизистой эндо- и эктоцервикса (см. результаты). При этом мы обнаружили, что в материале, взятом из эндоцервикса, частота клеток, экспрессирующих TLR4 была выше, чем в эпителии слизистой эктоцервикса. Однако наиболее высокую частоту TLR4-экспрессирующих клеток мы обнаружили в эндометрии. Вместе с тем следует отметить, что частота клеток слизистой эндометрия, положительных по иммуноцитохимической реакции на TLR4, варьировала у разных пациенток в широком диапазоне. Были выявлены пациентки, в слизистой эндометрия которых частота TLR4 экспрессирующих клеток составила не менее 80%, и также были выявлены пациентки, в слизистой эндометрия которых частота TLR4 экспрессирующих клеток составляла не более 15%. Действительно, ряд авторов, хотя с этим соглашаются не все исследователи, обнаружили, что «градиент» экспрессии Toll-like рецепторов 4-го типа выше в клетках слизистой верхних отделов репродуктивного тракта и наименьший в клетках слизистой и стромальных элементах влагалища [23]. Определенные разногласия относительно локализации клеток, экспрессирующих TLR4 и выраженности экспрессии Toll-like рецепторов 4-го типа могут быть связаны с тем, в какую фазу менструального цикла подвергали исследованию забранный материал репродуктивного тракта. К настоящему времени получены весьма убедительные данные, свидетельствующие, что наиболее выраженная экспрессия Toll-like рецепторов 4-го типа в эндометрии регистрируется в секреторную фазу менструального цикла [22, 31].

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что, как правило, в материале эктоцервикса у пациенток с персистирующей папилломовирусной инфекцией не выявлялись клетки, экспрессирующие TLR9. В редких случаях (10%) – в материале эктоцервикса регистрируются клетки, экспрессирующие TLR9. Если до лечения в эндометрии частота клеток, экспрессирующих TLR9, не превышала 3%, то после курса лечения нуклеосперматом натрия частота клеток позитивных в иммуноцитохимической реакции с моноклональными антителами на Toll-like рецепторы 9-го типа возрастала и составила более 10% (т.е. более, чем в три раза). Известно, что TLR9 связываются с нуклеиновыми кислотами, содержащими CpG-островки (не подвергшимися метилированию) [11, 32], которые также выявлены в геноме вируса простого герпеса [33–34]. Экспрессия TLR9 была зарегистрирована в клетках фаллопиевых труб, эндометрия и шейки матки. При этом следует отметить, что в эндометрии экспрессия TLR9 не ограничивается эпителиальными клетками, но также регистрируется в стромальных элементах [24, 35, 36]. Следствием активации TLR9 может быть повышение количества ряда цитокинов, включая IL-8, на что убедительно указывают экспериментальные данные. Так, неметилированные CpG олигонуклеотиды, которые являются агонистами Toll-like рецепторов 9-го типа, индуцируют продукцию IL-8 первичными клетками, изолированными из ткани фаллопиевых труб и шейки матки [9, 37]. В связи с данным наблюдением интересно отметить, что CpG олигонуклеотиды также ингибируют персистенцию цитомегаловируса и вируса Эпштейн – Барр в эпителии слизистой влагалища. Одним из цитокинов, ингибирующих продукцию данных патогенных вирусов является интерферон-β [38–39]. Значение контаминации репродуктивной системы человека вирусом Эпштейн – Барр в воспалении и невозможности зачатия не изучено и требует полномасштабного исследования в связи с функцией Toll-like рецепторов 9-го типа, обеспечивающих немедленный противовирусный иммунный ответ.

Лечение патологии шейки матки, ассоциированной с вирусом папилломы человека высокой степени онкогенного риска, представляет значительные трудности в виду отсутствия специфической этиотропной терапии, что диктует необходимость поиска новых иммуномодуляторов, способных воздействовать на специфические мишени, в частности, на Toll-like рецепторы. Хронический аутоиммунный эндометрит является наиболее частой причиной бесплодия, невынашивания беременности, неудачных попыток экстракорпорального оплодотворения. Полученные нами данные убедительно свидетельствуют о возможности проведения патогенетически обоснованной терапии патологии шейки матки и эндометрия с помощью иммуномодулятора нуклеоспермата натрия.

Подняться вверх сайта