Поиск Кабинет

Зависимость пролиферации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток от характеристик доноров

Гены & Клетки: Том IV, №2, 2009 год, стр.: 70-75

 

Авторы

Гоигорян А.С., Кругляков П.В., Таминкина Ю.А., Полынцев Д.Г.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Применение мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), выделенных из костного мозга, является эффективным терапевтическим методом, направленным на лечение широкого спектра заболеваний, в том числе онкогематоло-гических. Для применения ММСК в клинике требуется их экспансия в культуре для наращивания необходимого количества клеток. Однако относительно свойств данного типа клеток, в том числе и таких простых для исследования, как пролиферация, по сей день не существует общего мнения. В данной работе мы изучили влияние на пролиферацию ММСК, определяемую по экспресии рецептора трансферрина (CD71) от третьего до седьмого пассажа после криоконсервации, наиболее часто применяющихся в клинике, таких факторов, как пол и возраст доноров клеток, а также количество CD71' клеток в костном мозге, из которого были выделены ММСК. Мы обнаружили, что пролиферативная активность ММСК не имеет выраженной зависимости от указанных факторов, а чистые популяции ММСК возможно получать от доноров в возрасте от 18 до 70 лет.

Введение

В последние годы применение мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга (ММСК) вошло в терапию множества различных заболеваний на уровне клинических испытаний [1—5]. В настоящее время ММСК используются главным образом для снижения выраженности реакции «трансплантат против хозяина» при трансплантациях гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) костного мозга у пациентов с онкогематологическими заболеваниями [6—9], а также в ортопедии [10—13]. ММСК обладают способностью дифференцироваться в направлении большого числа клеточных типов, хотя естественными их производными считаются остеобласты, хондроциты и адипоциты, а также теноциты [14—16]. Интерес клиницистов к ММСК объясняется не только уникальными свойствами этих клеток, но и сравнительной простотой их выделения из костного мозга и экспансии in vitro [17].

По данным большинства авторов, при длительном культивировании (до 25 удвоений) ММСК не подвергаются злокачественной трансформации и гибнут посредством апоптоза, достигнув фазы старения [18]. Некоторым авторам удавалось культивировать ММСК до 30 [19] и даже до 50 пассажей [20], прежде чем прирост популяции останавливался. Тем не менее, в 2006 г. было показано, что после шестого пассажа культуры ММСК человека, полученные из костного мозга разных доноров, в разное время вступают в фазу старения, чему сопутствует постепенное снижение их пролиферативной активности и способностей к дифференцировке. Точно определить, когда в каждой конкретной культуре ММСК наступит блок пролиферации, практически невозможно [21]. Эти данные были подтверждены в независимой лаборатории научной группой W. Wagner, продемонстрировавшей, что ММСК человека после седьмого пассажа претерпевают морфологические изменения, нарушения профиля экспрессии положительных маркеров CD13, CD29, CD44, CD73, CD90, CD105, CD 146 и CD 166, ив конце концов перестают пролиферировать [22]. По этой причине в терапевтических целях предпочтительно использовать клетки, прошедшие менее шести пассажей in vitro. Это могло бы стать серьезным недостатком в отношении удобства работы с ММСК, поскольку ограниченное время, которое клетки могут провести в культуре, может накладывать временные рамки на их использование в клеточной терапии. Однако ММСК, как и любую другую клеточную культуру, возможно сохранять сколь угодно долго в замороженном состоянии, что практически не влияет на их свойства, по крайней мере, на пролиферацию и экспрессию характерных маркеров [23], а также на жизнеспособность и способность дифференцироваться в остеогенном направлении [24].

При изучении свойств ММСК и их применимости в клинике возникает вопрос о факторах, которые могут влиять на характеристики ММСК, в том числе на их пролиферацию, поскольку она позволяет рассчитывать сроки наращивания в культуре необходимого для проведения клеточной терапии конкретному пациенту количества клеток. Такими факторами могут являться возраст, пол и патология пациента, иммунофенотип клеток костного мозга и полученных из него ММСК. На сегодняшний день большинство вопросов о корреляциях экспансии ММСК в культуре с различными характеристиками доноров остаются открытыми, поскольку данные, получаемые в независимых лабораториях, сильно разнятся. Например, до сих пор не ясно, действительно ли существует отрицательная зависимость пролиферативного потенциала ММСК от возраста донора [21, 25, 26].

Существуют единичные работы, посвященные выявлению зависимости терапевтического потенциала ММСК от пола донора [27]. В указанной работе исследователи показали, что ММСК, изолированные из костного мозга самок крыс, оказывают при трансплантации лучший эффект на восстановление функций сердца после инфаркта миокарда, нежели ММСК самцов.

Касательно других факторов, например, корреляции экспрессии ММСК маркера CD71 (рецептор трансфер-рина), который принято считать в работах клеточных биологов маркером пролиферации, и реальной пролиферации культуры, практически нет данных. Хотя для ти-моцитов с помощью проточной цитофлуориметрии была показана прямая зависимость пролиферативной активности и экспрессии на мембране клеток CD71 [28].

В своей работе мы поставили цель определить зависимость пролиферации ММСК после криоконсервации от следующих факторов: пола и возраста донора; CD71-статуса образцов костного мозга, из которых были выделены клетки; и CD71-статуса культур ММСК перед криоконсервацией.

Постановка такой цели объяснима: в основном в практике для решения клинических задач используются именно ММСК, подвергавшиеся криоконсервации с последующим размораживанием и наращиванием в культуре. Также, исходя из соображений клинического применения ММСК, мы сосредоточили свое внимание на изменениях, происходящих с клетками до седьмого удвоения популяции.

Помимо этого, основываясь на весьма разрозненных литературных данных и на опыте собственных исследований, мы заключили, что пролиферативная активность ММСК, полученных от разных доноров, строго индивидуальна, а ее вариабельность может быть очень широкой. В связи с этим мы сочли, что при криоконсервации ММСК, предназначенных для дальнейшего применения в экспериментальной клеточной терапии, имеет смысл замораживать отдельно небольшое количество клеток (до 2 млн) в так называемой ампуле-спутнике, которые после криоконсервации будут немедленно разморожены и культивированы до седьмого пассажа. По данным о приросте ММСК из ампулы-спутника можно будет с большой точностью судить о динамике роста основной массы клеток донора, а, значит, планировать сроки подготовки культуры ММСК для использования в необходимом количестве и на точно определенном пассаже.

Материал и методы

В работе были использованы культуры ММСК, полученные из костного мозга 36 доноров. Среди них 11 здоровых человек, 20 — страдающих различными заболеваниями, исключая онкогематологические и острые воспалительные, и 5 пациентов, страдающих онкогема-тологическими заболеваниями (острый миелолейкоз и хронический миелолейкоз). Культуры ММСК, полученные от разных доноров, в том числе и от доноров с онкогематологическими заболеваниями, оценивались совокупно, т. к. ранее было показано, что ММСК доноров без онкогематологических заболеваний и ММСК пациентов с онкогематологическими заболеваниями не различаются по фенотипическим и функциональным характеристикам [29].

Суспензию КМ выделяли посредством стернальной пункции и высевали на культуральную пластиковую посуду (Sarstedt, Германия) в среде культивирования —MEM (HyClone, Новая Зеландия), содержащей 20% сыворотки эмбрионов коров (HyClone, Новая Зеландия), 0,01% рекомбинантного человеческого фактора роста bFGF (25 мкг/мл, Sigma, США) и 100 мкг/мл пенициллина/стрептомицина (Gibco, США). Через 48 час. производили отмыв адгезивной фракции костного мозга от форменных элементов крови с помощью физиологического раствора натрия хлорида (0,9% NaCI, ОАО «Биосинтез» Россия). ММСК культивировали в монослое при 37°С и 5%С02, каждые трое суток заменяя питательную среду. Пересевы культуры до криоконсервирования производили по достижении 100% конфлюэнтности при помощи 0,25% раствора трипсина в ЗДТА (HyClone, Новая Зеландия).

На третьем пассаже (РЗ) культуру ММСК криокон-сервировали. Для этого клетки снимали с пластика раствором трипсина и ЗДТА, центрифугировали в течение 5 мин. при 300 g и ресуспендировали в среде культивирования с добавлением в пропорции 1:1 20% раствора криопротектора — диметилсульфоксида (Bright-Line, США) на аутосыворотке. Затем криовиалы с суспензией помещали в пары жидкого азота (около —80°С).

После криоконсервации одну из криовиал с клеточной суспензией (ампулу-спутник, содержащую 2 млн клеток) размораживали при комнатной температуре, разбавляли ее содержимое 2^3 мл культуральной среды и центрифугировали 5 мин. при 300 д. Клетки в количестве 1 млн высевали на культуральный пластик, после чего культивировали в стандартных условиях по следующей схеме: пересевы производили через каждые 48^72 час., после каждого производили подсчет клеток в гемоцитометре (Bright-Line, США). Всего проводилось четыре пересева ММСК после размораживания, то есть клетки вели в культуре до седьмого пассажа (Р7). Мы, как и подавляющее большинство авторов, работающих с ММСК, употребляем здесь термин «пассаж» как синоним пересева культуры через равные временные интервалы вне зависимости от прироста популяции.

Для наиболее полной характеристики культур ММСК после криоконсервации их подвергали на третьем либо на четвертом пассаже направленной дифференцировке в остеогенном, хондрогенном и адипоцитарном направлениях. Для индукции дифференцировки ММСК использовали опубликованные протоколы и соответствующие коктейли ростовых факторов и морфогенов [30, 31]. Для остеогенной дифференцировки в стандартную среду культивирования добавляли 10-2 М р-глицерофосфата натрия, Ю^М дексаметазона и 2x10-4 М аскорбиновой кислоты. Для хондрогенной дифференцировки — 1 нг/мл трансформирующего фактора-Зр роста и 2х10~4М аскорбиновой кислоты. Для индукции адипоцитарной дифференцировки среду культивирования меняли на содержащую 1% сыворотки крови эмбрионов коров, 10~9 М инсулина и 10~7 М дексаметазона. Во всех случаях обработка индукторами дифференцировки длилась 2 нед., половину среды культивирования меняли каждые 3 сут.

Морфологические изменения после дифференцировок оценивали визуально с помощью микроскопа (Leica, Германия). В дальнейшем мы не проводили специфических окрасок, судя о дифференцировке клеток по их морфологии.

Фенотипирование образцов КМ и ММСК. Феноти-пирование образцов костного мозга и ММСК человека проводили методом проточной цитофлуориметрии на проточном цитофлуориметре FACSscan (Beckton Dickinson, США). Образцы костного мозга характеризовали по содержанию в них гемопоэтических стволовых клеток (CD34+/CD45+) и количеству CD71+ клеток; ММСК характеризовали на третьем пассаже перед криоконсервированием по «позитивным маркерам» CD90 и CD106, по «негативным маркерам» CD45 и CD34, а число предположительно пролиферирующих клеток в культуре оценивали окрашиванием клеток антителами против маркера CD71 (все антитела производства Beckton Dickinson, США). Фенотипирование проводили по стандартным протоколам фирмы-производителя.

Статистический анализ результатов. Статистическая обработка результатов была проведена в программах StatGraphics Centurion (StatPoint Inc., США) и Microsoft Excel (Microsoft Inc., США). За коэффициент прироста популяции во всех случаях принимали отношение количества клеток, полученного при пересеве культуры, к количеству клеток, полученному на предыдущем этапе, например:

К прирос™ на 4-м пассаж. = К°Л-В0 ШеТ0К НВ 4~М ПВССВЖе/кол-во клеток на 3-м пассаже. Анализ зависимости пролиферации ММСК от пола донора был оценен с помощью парного F-критерия Фишера, поскольку полученные данные подчинялись нормальному распределению.

Зависимость пролиферации клеток от возраста донора оценивалась с помощью множественного регрессионного анализа для выявления возможных корреляций; различия в пролиферации ММСК у возрастных групп были оценены по критерию Краскела-Уоллиса для распределений, имеющих отклонения от нормального.

Зависимость пролиферативной активности ММСК от доли CD71 + клеток в образцах костного мозга оценивалась по результатам множественного регрессионного анализа, различия в группах с разным содержанием CD71 +клеток оценивались по t-критерию Стьюдента.

Зависимость пролиферации ММСК от присутствия в популяции CD71+ клеток, а также сравнение пролиферативной динамики ММСК до и после криоконсервирования, было проведено тестом Краскела-Уоллиса.

Результаты

После криоконсервации и последующего размораживания все без исключения культуры ММСК успешно дифференцировались в ортодоксальных направлениях, а именно, в остеогенном, хондрогенном и адипоцитарном. Общий разброс коэффициентов прироста различных популяций ММСК независимо от пассажа после криоконсервации составил в абсолютных цифрах от 0,72 до 5,1 за двое суток.

Зависимость пролиферации ММСК после криоконсервации от возраста донора

Была проанализирована пролиферативная активность ММСК от 36 доноров в возрасте от 21 до 70 лет (рис. 1). Проведенный множественный регрессионный анализ не выявил влияния возраста пациента на динамику пролиферации его клеток на пассажах от третьего до седьмого (при уровне значимости р = 0,05). Также мы провели сравнение пролиферации ММСК между двумя возрастными группами: от 20 до 30 лет и старше 60 лет. Однако и в этом случае статистический анализ с помощью критерия Краскела — Уоллиса для распределений, отличающихся от нормального, не выявил значимых различий в пролиферации ММСК от доноров разного возраста (рис. 2).

Зависимость пролиферации ММСК после криоконсервации от пола донора Была проанализирована пролиферативная активность ММСК от 26 доноров (13 женщин и 13 мужчин). Оценка различий с помощью парного F-критерия Фишера показала, что статистически значимых различий между группами нет (при уровне значимости р = 0,05) (рис. 3). При этом у ММСК, выделенных у доноров-женщин, оказалась существенно выше вариабельность пролиферативной активности.

Зависимость пролиферации ММСК после криоконсервации от доли CD71т клеток в костном мозге донора

Была проанализирована пролиферативная активность ММСК от 36 доноров. У всех доноров была оценена доля CD71+ клеток в образцах костного мозга. Проведенный множественный регрессионный анализ не выявил влияния количества клеток, несущих на мембране маркер CD71, в костном мозге на динамику пролиферации ММСК на пассажах от третьего до седьмого (при уровне значимости р=0,05). Также мы провели сравнение пролиферации ММСК между двумя группами пациентов: у первой группы доля CD71 + клеток в костном мозге была менее 5% (0,3%-5%), у второй — более 5% (5,3%-10,1%). Однако и в этом случае статистический анализ с помощью t-критерия Стьюдента для нормальных распределений не выявил значимых различий в пролиферации ММСК от доноров разного возраста (рис. 4).

Зависимость пролиферации ММСК после криоконсервации от CD71 -статуса ММСК на третьем пассаже перед криоконсервацией Сравнительный анализ пролиферативной активности культур ММСК, различающихся CD71-статусом (по 15 образцов в группе), с помощью теста Краскела-Уол-лиса показал, что статистически значимых отличий между пролиферацией культур нет (при уровне значимости р=0,05) (рис. 5).

В научной литературе можно обнаружить большое количество разрозненных сведений относительно характера пролиферативной активности ММСК. Несоответствия данных о зависимости пролиферации ММСК от возраста доноров может быть связано с различиями возрастных групп, изученных авторами. Если обратиться к экспериментам на животных, в которых исследователи имеют неограниченные возможности подбора возрастных групп, можно увидеть четкое снижение способности к адгезии к культуральному пластику и пролиферативной активности ММСК, выделенных из костного мозга молодых и старых животных [32, 33], а также уменьшение терапевтического потенциала клеток, что было продемонстрировано на модели инфаркта миокарда у крыс. При этом было показано, что снижение пролиферативной активности ММСК in vitro является прямым показателем снижения их регенерационных способностей in vivo [34]. Однако такие работы позволяют лишь строить теоретические предположения, но в какой мере их результаты можно экстраполировать на характеристики клеток человека, остается неясным.

Для ММСК человека было лишь недавно показано, что с увеличением возраста донора снижается их пролиферативная активность и способность формировать колонии при изоляции из костного мозга [35]. Авторы изучили пролиферацию ММСК от доноров широкого возрастного диапазона, но на сегодняшний день эта работа остается единственной. Мы не отметили влияния возраста человека на пролиферативную активность его ММСК. Возможно, это также связано со слишком узким возрастным диапазоном доноров. Тем не менее, этот результат можно считать положительным, поскольку он указывает на то, что пролиферативная активность ММСК не снижается вплоть до семидесятилетнего возраста.

К сожалению, мы не обнаружили литературных данных о зависимости пролиферации ММСК от пола донора. Основываясь на результатах экспериментов, проведенных на других типах клеток [36], мы ожидали получить четкие различия в пролиферации ММСК, коррелирующие с полом донора. Однако мы увидели лишь, что в случае ММСК, выделенных у доноров-женщин, наблюдается гораздо более широкий разброс показателей прироста клеточной популяции. Трудно сказать, с чем это связано, и можно ли считать это правилом, поскольку справедливость подобного вывода можно проверить только на очень большой выборке, включающей более ста культур ММСК в каждой из групп сравнения.

Мы не увидели зависимости пролиферации ММСК от доли CD71 + клеток, присутствующих в костном мозге донора, что позволяет усомниться в том, что CD71 является маркером пролиферирующих клеток. Та же картина была отмечена и при сравнении чистых культур ММСК, имеющих различный CD71 -статус. Основываясь на наших данных, мы можем сказать, что молекула CD71, считающаяся некоторыми авторами маркером пролиферирующих клеток [28], не отражает реальной пролиферации культуры (рис. 6). Мы не смогли в полной мере оценить пролиферацию ММСК некоторых доноров, культуры которых на третьем пассаже не несут маркера CD71, поскольку такие случаи оказались крайне редки.

В целом мы можем отметить, что пролиферативная активность ММСК — весьма стабильный показатель, на который не оказывает существенного влияния ни один из изученных факторов. Конечно, пролиферативная активность — далеко не единственная важная характеристика данного типа клеток. Остаются вопросы об изменении с возрастом и под влиянием различных факторов дифференцировочного потенциала ММСК, продукции ими различных биологически активных соединений и проч., а также о поиске молекулярных маркеров, с помощью которых можно делать уверенные выводы о свойствах мультипотентных мезенхимальных клеток. В настоящее время работа в данном направлении далека от завершения.

Как мы и ожидали, динамика роста у различных популяций ММСК оказалась весьма вариабельной и индивидуальной для каждого донора, хотя ее общая картина и оставалась неизменной: популяции ММСК от РЗ до Р7 удваивались в среднем за двое-трое суток, и тенденции к снижению пролиферативной активности со временем не наблюдалось ни в одном случае. Обнаруженная широкая вариабельность динамики роста ММСК подтверждает наше предположение о том, что в работе с предназначенными для использования в терапии культурами ММСК имеет смысл заготавливать при криоконсервации культуры ампулу-спутник с небольшим количеством клеток. Культивирование ММСК из ампулы-спутника может существенно помочь в работе с клетками, предназначенными для введения пациентам, позволив прогнозировать динамику роста культуры и точно координировать наращивание необходимого количества ММСК в лаборатории и проведение работы в клинике.

Обсуждение и выводы

По результатам данной работы можно сделать вывод о том, что пролиферация ММСК человека в период от РЗ до Р7 после криоконсервации не зависит от пола пациента, его возраста, а также доли CD71+ клеток в костном мозге, из которого были выделены клетки, и в популяции ММСК перед криоконсервацией. Вариабельность пролиферации культур определялась при этом исключительно индивидуальными особенностями каждого донора.

Подняться вверх сайта