Поиск Кабинет

Выделение, культивирование и дифференцировка мультипотентных мезенхимных стромальных клеток из жировой ткани крыс Rattus norvegicus и хомяков Mesocricetus auratus

Гены & Клетки: Том VII, №3, 2012 год, стр.: 82-87

 

Авторы

Катина М.Н., Гайфуллина Р.Ф., Хаятова З.Г., Эмене Ч.Ч., Ризванов А.А.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Клеточная терапия различных заболеваний представляется в последние годы все более перспективным направлением в медицине. Для терапевтических целей возможно получать аутогенные стволовые клетки из жировой ткани. Для доклинических исследований клеточной терапии заболеваний требуются модели заболеваний на животных, однако чаще всего применяемые крысы и мыши не способны к развитию целого ряда актуальных заболеваний, которые могут быть смоделированы на сирийских хомяках. При анализе литературных данных не было обнаружено каких-либо сведений о получении и исследовании свойств стволовых клеток хомяков, что важно для разработки методов клеточной терапии с применением моделей заболеваний у этих животных. В данном исследовании впервые получены стволовые клетки из жировой ткани сирийских хомяков, описана их морфология, свойства и потенциал дифференцировки в различных направлениях. Показано, что эти клетки аналогичны мультипотентным мезенхимным стромальным клеткам по их способности к дифференцировке в остеогенном и адипогенном направлении. Также показана способность клеток дифференцироваться в нейрогенном направлении.

Клеточная терапия различных заболеваний представляется в последние годы все более перспективным направлением в медицине и биотехнологии. Стволовые и прогениторные клетки для терапевтических целей могут быть выделены из различных органов и тканей. Так, они обнаружены в кроветворном костном мозге, эпидермисе, нервной, мышечной, костной и жировой ткани, в небольших количествах содержатся и в периферической крови. В клинической практике для получения аутогенных стволовых клеток возможно использование аспиратов из жировой ткани и костного мозга. Благодаря тому, что процедуры изъятия ткани при этом малотравматичны и не ведут к образованию косметического или функционального дефекта, возможно одномоментное взятие довольно большого объема образца, что позволяет в более короткие сроки получить необходимое количество клеток [1]. Жировая ткань состоит в основном из зрелых адипоцитов – клеток, малоспособных к пролиферации. Прогениторные клетки, за счет которых происходит обновление жировой ткани, содержатся в периваскулярной зоне мелких сосудов и составляют так называемую стромально-васкулярную фракцию. Эти клетки довольно гетерогенны, представлены перицитами, фибробластами, преадипоцитами, а также мультипотентными мезенхимными стромальными клетками (ММСК), способными дифференцироваться в адипогенном, остеогенном, хондрогенном, миогенном и фиброгенном направлениях [2]. Дифференцировочный потенциал их в некоторой степени схож с так называемыми мезенхимными стволовыми клетками – клетками мезенхимы эмбриона, способными дифференцироваться в различные клетки соединительной ткани и кроветворные клетки. Однако ММСК жировой ткани являются клетками взрослого организма и не способны к дифференцировке в кроветворном направлении [3]. Считается, что ММСК являются наиболее удобным и безопасным материалом для клеточной терапии и тканевой инженерии.

Прежде чем новый препарат или метод лечения войдет в широкую клиническую практику, он должен пройти целый ряд доклинических (in vitro и in vivo) и клинических исследований. Крысы и мыши – одни из самых «популярных» лабораторных животных, позволяющих моделировать ряд заболеваний и патологических состояний человека. другие грызуны, как, например, сирийские хомяки также применяются в доклинических исследованиях. Их частое использование обусловлено простотой содержания, быстрым размножением и развитием, а также рядом анатомических и физиологических особенностей организма. Такие особенности их иммунной системы, как высокая чувствительность к вирусному онкогенезу [4], наличие иммунопривилегированных защечных мешков, необычные характеристики молекулы главного комплекса гистосовместимости и Т-клеток, делают этих животных незаменимыми при исследованиях в области иммунологии и онкологии. Также хомяки подвержены таким инфекционным заболеваниям человека, как лейшманиоз, токсоплазмоз, сифилис [5], микоплазменная инфекция. Сирийские хомяки – единственные животные, у которых возможно развитие спонтанного тромбоза [6]. На сирийских хомяках моделируется эпилепсия, кардиомиопатия, они являются недорогой и легко воспроизводимой моделью таких широко распространенных заболеваний, как атеросклероз, сахарный диабет и кариес [7].

Тем не менее, мы не обнаружили каких-либо литературных данных об исследовании клеток хомяков, которые могли бы использоваться для терапии вышеуказанных заболеваний в моделях на животных.

Одним из наиболее достоверных способов определения принадлежности той или иной культуры клеток к популяции ММСК является исследование их способности к дифференцировке в различных направлениях. ММСК in vitro могут дифференцироваться в остеобласты, хондробласты, адипоциты, а также под действием некоторых факторов могут проходить «трансдиффренцировку» в клетки немезенхимного ряда, такие как нейроны [8], гепатоциты [9] и др.

Мы исследовали дифференцировочный потенциал ММСК жировой ткани хомяков в сравнении с ММСК жировой ткани крыс. Результаты данной работы и сделанные выводы позволят эффективно исследовать возможности апробации клеточной терапии ряда заболеваний человека на моделях с применением сирийских хомяков.

Материал и методы

Выделение и культивирование ММСК. ММСК были выделены из подкожной и висцеральной жировой ткани взрослых самцов крыс Rattus norvegicus линии Wistar и сирийских хомяков Mesocricetus auratus (Питомник лабораторных животных «ПУЩИНО», РФ). Животные содержались на стандартном рационе вивария и имели свободный доступ к воде. Содержание и использование лабораторных животных соответствовало правилам, принятым в КФУ, рекомендациям местного этического комитета и национальным законам [10]. Животным выполнялась декапитация 2с целью избежать влияния наркотизирующего средства на ход и результаты эксперимента.

Все манипуляции по выделению ткани и работы с культурами клеток проводились в стерильных условиях при ламинарном токе воздуха.

Стромально-васкулярная фракция клеток была получена по стандарной методике [11] в результате инкубации жировой ткани с 0,2% раствором коллагеназы краба (Биолот, Россия) в DPBS в течение 1 ч при 37°С и постоянном покачивании. Полученные клетки культивировали на среде α-MEM (ПанЭко, Россия) с добавлением 10% сыворотки плодов коров (FBS, ПанЭко, Россия), 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 mM L-глутамина (ПанЭко, РФ) и 1 нг/мл основного фактора роста фибробластов человека (FGF2, Sigma, США). Не прикрепившиеся к пластику клетки были удалены через 48 ч при смене среды. Культуры клеток поддерживались в течение пяти пассажей. Пересев осуществляли с помощью 0,25% раствора трипсина-EDTA (Gibco, США).

Дифференцировка ММСК. Для исследования способности полученных клеточных культур к дифференцировке клетки третьего пассажа были высеяны на 12-луночные планшеты по 30 тыс. клеток на лунку и инкубировались в ростовой среде α-MEM с добавлением 1 нг/мл FGF2 до получения монослоя (48 ч). В дальнейшем для индукции дифференцировки клеточные культуры инкубировали со специальными средами. Дифференцировку осуществляли в трех направлениях: в остеогенном, адипогенном и нейрогенном.

Для остеогенной дифференцировки использовали среду α-MEM с добавлением 10% FBS, 100 нM дексаметазона (Sigma, США), 0,5 μM 2-фосфата аскорбиновой кислоты (Sigma, США), 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 mM L-глутамина (ПанЭко, Россия). В качестве контрольной среды использовали среду α-MEM с добавлением 10% FBS, 0,5 μM 2-фосфата аскорбиновой кислоты, 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 mM L-глутамина. С 10 сут. инкубации в среду для остеогенной дифференцировки, так же, как и в контрольную среду, добавляли 0,2 μM раствора β-глицерофосфата (Sigma, США) [11].

Для индукции адипогенной дифференцировки использовали среду DMEM High glucose (ПанЭко, Россия) с добавлением 10% FBS, 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 mM L-глутамина, 1 μM дексаметазона, 100 μM индометацина (Sigma, США), 500 μM 3-изобутил-1-метилксантина (IBMX, Sigma, США) и 10 μg/ml инсулина (Sigma, США). С 10 сут. среду заменяли на поддерживающую, отличающуюся отсутствием дексаметазона, индометацина и IBMX. В качестве контрольной среды на всех этапах использовали DMEM High glucose с добавлением 10% FBS, 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 mM L-глутамина [11].

Для нейрогенной дифференцировки посев клеток осуществляли на лунки, покрытые поли-L-лизином. Использовали дифференцировочную среду NBM (Neural basal media, Gibco, США) с добавлением 1% FBS, 5% лошадиной сыворотки (Биолот, Россия), добавок N2 и B27 (Invitrogen, США), 10 мкг/мл трансферрина (Sigma, США), 60 мкМ путресцина (Sigma, США), 25 мкг/мл инсулина, 0,02 мкМ прогестерона (Sigma, США), 0,5 мкМ ретиноевой кислоты (Sigma, США), антибиотика и 10 нг/мл нейротрофического фактора мозга (BDNF, Sigma, США). Контрольной средой послужила среда α-MEM с добавлением 10% сыворотки плодов коров (FBS), 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 mM L-глутамина [12].

Анализ диффренцировки. Осуществляли ежедневное прижизненное наблюдение за культурами клеток с помощью инвертированного микроскопа AxioObserver Z1 (Carl Zeiss, Германия) методами фазово-контрастной и световой микроскопии.

Для установления факта дифференцировки в определенных направлениях на 20 сут. инкубации с дифференцировочными средами культуры клеток фиксировали охлажденным метанолом в течение 20 мин при -20°С, проводили цитохимическое окрашивание и использовали иммунофлуоресцентный метод определения экспрессии специфических белков.

Для определения минерализации, являющейся признаком остеогенной дифференцировки, использовали реакцию vаn Kossa с 2% нитратом серебра. Эта реакция основана на связывании ионов серебра с фосфатными группами. Полученное соединение подвергается фотохимической деградации (в течение 1 ч при ярком освещении) с выделением ионов серебра, придающим минеральным депозитам серокоричневый цвет.

Для выявления дифференцировки в адипогенном направлении использовали качественную реакцию на нейтральные жиры с красителем Oil Red O (Sigma, США), окрашивающим жировые включения в красный цвет. Ядра клеток докрашивали раствором гематоксилина (Sigma, США).

Факт нейрогенной дифференцировки определяли по экспрессии нейрональных маркёров, таких как β3-тубулин, глиофибриллярный кислый белок GFAP, нейрофиламент L. Применяли иммунофлуоресцентный метод с использованием специфических антител к вышеуказанным белкам (Santa Cruz, США, sc-51670, sc-9065, sc-25652, соответственно) и вторичных антител, конъюгированных с флуорохромами Alexa 488 и 555 (Invitrogen, США) в соответствии с инструкциями фирм-производителей. Для окрашивания ядер использовали DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole). Микроскопию выполняли на инвертированном флуоресцентном микроскопе AxioOberver.Z1 (Carl Zeiss, Германия).

Результаты

До начала процедуры индукции дифференцировки ММСК крысы и хомяка 5 пассажа имели типичную для этих клеток фибробластоподобную форму. При культивировании ММСК крысы и хомяка в остеогенной среде наблюдали изменение формы клеток с веретеновидной на кубическую, свойственную остеобластам. Реакция vаn Kossa выявила наличие значительных минеральных отложений в культурах ММСК как крысы, так и хомяка (рис. 1А, В), в то время как в культурах, инкубировавшихся в контрольной среде, таковых не наблюдалось (рис. 1Б, Г).

В культурах ММСК крысы и хомяка с 10–12 сут. инкубации со средой для адипогенной дифференцировки отмечали появление жировых микровезикул в цитоплазме клеток при витальной микроскопии. В последующем при окрашивании фиксированных культур Oil Red O на 20 сут. инкубации в культурах ММСК наблюдали большое количество клеток с морфологией, типичной для адипоцитов (рис. 2А, В): обилие жировых везикул различных размеров, окрашенных Oil Red O в красный цвет, и эксцентрично расположенное ядро. В клеточных культурах, инкубированных в контрольной среде, признаков адипогенной дифференцировки не выявили (рис. 2Г, Б).

При флуоресцентной микроскопии культур клеток, подвергнутых нейрогенной дифференцировке и окрашенных с применением антител к белкам, специфическим для нервной ткани, наблюдали появление положительно окрашенных колоний (рис. 3Б) и отдельных крупных клеток (рис. 3А, В) с нейроноподобной морфологией и наличием большого количества длинных тонких отростков. Следует отметить, что в то время как вышеописанные клетки и их колонии в культуре ММСК хомяка встречались довольно часто (рис. 4), в культуре клеток крысы их было обнаружено значительно меньше (рис. 5). Вероятно, это указывает на более высокую способность ММСК хомяков к нейрогенной дифференцировке при культивировании на применяемой дифференцировочной среде или недостаточную ее оптимизацию для дифференцировки ММСК крысы. Клетки, экспрессирующие нейральные маркеры, также в единичных экземплярах встречались в культурах клеток, инкубированных с контрольной средой, что указывает на выраженную гетерогенность популяции ММСК жировой ткани.

Обсуждение

В результате проведенного исследования определен потенциал к дифференцировке ММСК жировой ткани крыс и хомяков. Впервые получены и охарактеризованы ММСК жировой ткани хомяков. Показана способность ММСК хомяков дифференцироваться in vitro в клетки мезенхимного ряда (успешно индуцирована остеогенная и адипогенная дифференцировка), возможность трансдифференцировки в немезенхимном направлении (факт нейрогенной дифференцировки определен на основании экспрессии клетками белков, специфичных для нервной ткани). Полученные данные позволят в дальнейшем успешно моделировать ряд заболеваний человека на крысах и хомяках и исследовать возможности клеточной терапии с применением аллогенной трансплантации стволовых клеток при различных патологиях.

Подняться вверх сайта