Поиск Кабинет

Выделение и культивирование миофибробластов печени крыс методом эксплантации

Гены & Клетки: Том VII, №3, 2012 год, стр.: 112-115

 

Авторы

Миянович О.,  Шафигуллина А.К., Ризванов А.А., Киясов А.П.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

При развитии фиброза печени источником соединительной ткани являются миофибробласты, происходящие из двух популяций клеток печени: звёздчатых клеток печени и портальных фибробластов. Маркёром миофибробластов является экспрессия α-гладкомышечного актина (α-SMA). Отличительным признаком миофибробластов, происходящих из звёздчатых клеток печени, является сохранение экспрессии маркёра звёздчатых клеток – десмина. Процесс активации, пролиферации и трансдифференцировки клеток в миофибробласты находится в тесной зависимости от активности транскрипционного фактора NF-kB и его ингибитора IkBα. Целью нашей работы было получение культуры миофибробластов печени, изучение их происхождения, фенотипа, связи экспрессии NF-kB и IkBα с процессами активации и трансдифференцировки звёздчатых клеток печени в миофибробласты. Для этого методом эксплантации мы выделили гетерогенную популяцию клеток печени крысы. Практически все полученные нами клетки экспрессировали десмин и α-SMA. На основании этого мы предполагаем, что полученная нами культура миофибробластов являлась производной звёздчатых клеток печени, а единичные десминотрицательные клетки – производными портальных фибробластов. Таким образом, звёздчатые клетки печени обладают большим потенциалом к активации, росту, пролиферации и трансдифференцировке в миофибробласты по сравнению с портальными фибробластами. Подтверждением активированного состояния клеток явилась устойчивая экспрессия NF-kB и его ингибитора IkBα во всех клетках на протяжении всего эксперимента.

Звёздчатые клетки печени (ЗКП, клетки Ито, или перисинусоидальные клетки печени) – одна из самых малоисследованных популяций клеток в печени млекопитающих. Доказано, что они играют ключевую роль в обмене и накоплении витамина А, гистогенезе и регенерации печени [1, 2]. Вследствие их высокой биосинтетической активности и способности трансдифференцироваться в миофибробласты, которые синтезируют макромолекулы межклеточного матрикса соединительной ткани, ЗКП считали главными «виновниками» развития цирроза и фиброза печени [3]. Однако в последнее время появляется всё больше данных о том, что, помимо ЗКП, источником миофибробластов могут являться фибробласты портальных трактов, или портальные фибробласты (ПФ). Таким образом, на сегодняшний день обе эти популяции клеток, ЗКП и ПФ, рассматриваются как источник миофибробластов и соединительной ткани при фиброзе печени [4]. Общепринятым маркёром миофибробластов является α-гладкомышечный актин (α-SMA). Отличительным признаком миофибробластов, происходящих из ЗКП, является сохранение в цитоскелете миофибробластов десмина – одного из компонентов цитоскелета ЗКП.

Процесс активации, трансформации клеток в миофибробласты, а также защиты клеток от апоптоза регулируется транскрипционным фактором NF-kB. Предполагают, что ингибирование данного фактора позволит запустить апоптоз активированных ЗКП и ПФ и предотвратить последующее отложение миофибробластами соединительной ткани в печени [5, 6].

Миофибробласты в условиях in vitro можно получить при культивировании ЗКП. При этом трансформация ЗКП в миофибробласты происходит на 5–7 сут. культивирования. Общепринятый метод выделения ЗКП – коллагеназо-проназная перфузия печени с последующим разделением в градиенте плотности гистоденза – позволяет получить не все клетки, а лишь часть клеточной популяции, в цитоплазме которых есть жировые капли с витамином А [7]. Методов же выделения ЗКП, не содержащих в своей цитоплазме витамина А и находящихся на стадии миофибробластов, не разработано. Мы предполагаем, что методом получения миофибробластов для моделирования активации ЗКП и ПФ может быть эксплантационная культура, в которой клетки с высокой биосинтетической активностью мигрируют из кусочков тканей in vitro с образованием монослойной культуры [8].

Исходя из этого, целью нашей работы было получение культуры миофибробластов печени методом эксплантации, изучение происхождения и фенотипа миофибробластов, связи экспрессии NF-kB и IkBα с процессами активации и трансдифференцировки клеток в миофибробласты.

Материал и методы

Проводили эксплантацию печени здоровых четырёхдневных новорожденных крысят (Rattus norvegicus, линия Wistar, Питомник лабораторных животных «ПУЩИНО»). Удаляли капсулу, в каждой доле печени выделяли краевую, среднюю части и область ворот. Далее каждую часть измельчали стерильным скальпелем и кусочки органа помещали в 6- и 12-луночные планшеты, культивировали с питательной средой DMEM (Dulbecco`s modified essential meidium, ПанЭко) с добавлением смеси пенициллин-стрептомицина (ПанЭко), 10% сыворотки крови плодов коровы (ПанЭко) в инкубаторе при 37оС во влажной атмосфере с содержанием 5% СО2. На 3 сут. кусочки печени убирали, фиксировали в формалине и заливали в парафин по стандартной методике. Иммуногистохимическое окрашивание парафиновых срезов было проведено методом меченых полимеров (Novolink, США) с применением антител к десмину и α-SMA (Dako, США). Фенотип клеток изучали методом иммуноцитохимического окрашивания с антителами, приведёнными в таблице. Анализ препаратов проводили на микроскопе AxioOberver.Z1 (Carl Zeiss, Германия). Подтверждение экспрессии α-SMA, NF-kB и IkBα было проведено методом иммуноблоттинга. Для этого в лунке геля наносили лизат клеток собранных на 3, 5, 7 и 12 сут. В качестве контроля при иммуноблоттинге использовали антитела к β-актину. Визуализацию иммунного преципитата проводили с помощью набора для хемилюминесцентной детекции белка Amersham™ ECL™ Prime Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare Bio-Sciences AB, #RPN2232). Детекцию люминесценции проводили на приборе ChemiDoc™ XRS+ System (Bio-Rad, Сингапур).

Результаты и обсуждение

На 3 сут. мы наблюдали миграцию клеток из культивируемых кусочков печени (рис. 1А). При этом отличий между ростом клеток из различных участков печени отмечено не было. Морфология клеток напоминала морфологию ЗКП и миофибробластов – крупные клетки с многочисленными отростками (рис. 1Б) Фенотип полученных клеток исследовали на 3, 5, 7 и 12 сут. методом иммуноцитохимического окрашивания на десмин, α-SMA, С-kit, СК-18 (Е), СК-19 ,NF-kB, IkBα, CD45, альбумин, α-фетопротеин, каспазу-7, матричную металлопротеиназу-3 и матричную металлопротеиназу-9. При исследовании фенотипа была показана устойчивая экспрессия маркёра ЗКП крыс десмина (рис. 1В) на всех сроках эксперимента, что позволяет нам предположить, что мигрировавшие клетки были преимущественно ЗКП, лишь единичные десмин-отрицательные клетки могли быть ПФ. Динамика экспрессии α-SMA постепенно нарастала, что свидетельствовало о постепенной трансформации выделенных клеток в миофибробласты (рис. 1Г). На всех сроках была отмечена высокая экспрессия С-kit – маркёра прогениторных и стволовых клеток (рис. 1Д). Экспрессии цитокератина 18 (рис. 1Е) не было выявлено, что позволяет утверждать, что полученные клетки были не эпителиального происхождения. О высокой активности клеток можно было судить по иммуноцитохимическому окрашиванию культуры клеток антителами к NF-kB (рис. 1Ё) и IkBα (рис. 1Ж), для которых были отмечены устойчивый ядерный и цитоплазматический паттерн экспрессии во всех клетках и на протяжении всего эксперимента. Экспрессия преимущественно в ядре указывает на постоянную активацию траскрипционого фактора. Экспрессии маркёра гемопоэтических клеток CD45 выявлено не было, что свидетельствовало об отсутствии клеток крови в исследуемой культуре. Отсутствие экспрессии альбумина и α-фетопротеина было показателем того, что полученные клетки не были зрелыми гепатоцитами. Отсутствие экспрессии матриксной металлопротеиназы-3 и каспазы-7 свидетельствовало о том, что клетки активно пролиферировали и не вступили в апоптоз. Подтверждение экспрессии белков NF-kB, IkBα и α-SMA проводили с помощью иммуноблоттинга (рис. 2). Наблюдалось снижение уровня экспрессии NF-kB и IkBα на 12 сут. культвирования. В то же время наблюдалось увеличение уровня экспрессии α-SMA, что свидетельствует о трансдифференцировке клеток в миофибробласты.

При проведении иммуногистохимического окрашивания гистологических срезов фрагментов печени на 3 сут. после культивирования in vitro мы наблюдали некротические изменения в центре фрагмента, тогда как по периферии ткани было отмечено большое количество десмин-позитивных ЗКП. При окрашивании срезов на α-SMA положительную реакцию демонстрировали только единичные клетки сосудов. Таким образом, при эксплантации клеток печени происходит преимущественно активация и выселение ЗКП, а не ПФ (рис. 3).

На основании полученных результатов можно сделать следующие выводы. Метод эксплантации позволяет получить культуру миофибробластов печени крысы. Наблюдаемый in vitro процесс активации напоминает изменения, происходящие с ЗКП и ПФ в естественных условиях при фиброзе печени [9]. Анализируя фенотип полученных клеток можно утверждать, что полученные миофибробласты являются следствием трансдифференцировки преимущественно ЗКП, а не ПФ. Для полученной культуры миофибробластов была характерна высокая активность транскрипционного фактора NF-kB и его ингибитора IkBα. Таким образом, модель эксплантации клеток печени может быть использована при получении миофибробластов печени для проведения последующих экспериментов по ингибированию NF-kB и исследованию процессов, приводящих к фиброзу печени. Понимание происхождения и биологии миофибробластов открывает новые возможности для поиска противофиброзной терапии.

Подняться вверх сайта