Поиск Кабинет

Выделение и культивирование хондроцитов, полученных из различных источников

Гены & Клетки: Том I, №4, 2006 год, стр.: 48-51

 

Авторы

Ким И.И.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Целью данного исследования явилась отработка условий получения и культивирования клеток хрящевых тканей, полученных из различных источников.

В работе проводили сравнение способов выделения и культивирования хондроцитов, полученных из хрящевой ткани фетусов человека и из позвоночника больных идиопатическим сколиозом, а также из хрящевой ткани межпозвонковых дисков новорожденной собаки.

Исследования по подбору условий выделения и культивирования хондроцитов показали, что применение растворов коллагеназы в течение 12-16 часов при температуре 37°С и непрерывном перемешивании позволяет получить суспензию клеток с жизнеспособностью более 90%. Максимальное количество жизнеспособных хондроцитов наблюдали при выделении клеток с помощью 0,15% коллагеназы. Хрящевая фетальная ткань человека и межпозвонковых дисков собаки диссоциируется в коллагеназе 5-8 часов, ткань позвоночника больных идиопатическим сколиозом - 18-20 часов. При культивировании наилучшей пролиферативной способностью обладали хондроциты фетуса человека. Культура хондроцитов, полученных из позвоночника больных идиопатическим сколиозом, обладала низким показателем индекса пролиферации и коротким сроком культивирования по сравнению с фетальной культурой.

Введение

Лечение заболеваний и травм опорно двигательного аппарата остается актуальной проблемой современной ме дицины. Несмотря на способность к репарации, костная и хрящевая ткани иногда не в состоянии полностью устранить дефицит, возникший в результате действия повреждающе го фактора. Попытки восстановить утраченную часть кости или хряща предпринимались с давних пор и сводились, прежде всего, к аллотрансплантации кусочков ткани или ис пользованию синтетических материалов [1]. Однако у этих широко применяемых и ставших уже рутинными технологий есть множество недостатков - от наличия иммунологическо го барьера и дефицита пластического материала до остаточ ного ограничения качества жизни, даже после проведенного лечения (синтетические протезы). Развитие клеточной био логии и, в частности, исследований в области тканевой ин женерии открывают новые перспективы в реконструктивной ортопедии (2, 3]. Как известно, клеточная технология позво ляет, не меняя поврежденный орган, «обновлять» его кле точный состав [4]. Поэтому подбор оптимальных условий получения и культивирования хондроцитов представляется актуальной задачей.

Целью данного исследования явилась отработка уело вий получения и культивирования клеток хрящевых тканей, полученных из различных источников.

Материал и методы

В работе использовали хрящевую ткань фетусов челове ка, хрящевую ткань позвоночника больных идиопатическим Клеточная трансплантология и тканевая инженерия № 4 (6), 2006 сколиозом, а также хрящевую ткань межпозвонковых дисков новорожденной собаки. Хрящевую ткань позвоночника боль ных идиопатическим сколиозом после проведения плановых операций, а также хрящевую ткань межпозвонковых дисков новорожденной собаки, получали из научно исследовательс кого института травматологии и ортопедии г. Новосибирска.

Выделение хондроцитов из хрящевой ткани проводили механо ферментативным методом, используя в качестве диспергента коллагеназу IV типа (МР Biomedicals) в кон центрациях 0,05%, 0,1%, 0,15%, трипсин (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора) в концентрации 0,025%, ги алуронидазу I S типа (Sigma Aldrich) в концентрации 0,05% и сочетание ферментов коллагеназы и гиалурони дазы в концентрации по 0,05% каждого. Хрящевую ткань, очищенную от окружающих мягких тканей, измельчали до кусочков размером 1 3 мма, затем обрабатывали фермен том фетальную ткань в течение 5 8 часов и 18 20 часов хрящевую ткань позвоночника больных идиопатическим сколиозом при постоянном помешивании при температу ре 37°С. После ферментации полученную взвесь клеток пропускали через нейлоновый фильтр и отмывали 2 раза от раствора диспергента питательной средой, затем цент рифугировали при 1500 об/мин в течение 10 мин. Процент жизнеспособных хондроцитов подсчитывали с помощью трипанового синего (5).

Индекс пролиферации культуры определяли при каждом пассаже. Клетки культивировали с использованием среды DMEM/F12 (Биолот, Санкт Петербург) с добавлением 20% сыворотки крови плодов коровы (Биолот, Санкт Петербург). Клетки с поверхности культурального флакона снимали с помощью смеси растворов 0,02% Версена (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора) и 0,025% трипсина (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора) в соотношении 5:1. Пассирование проводили 2 раза в неделю [6, 7].

Морфологию культур клеток оценивали с помощью ин вертированного микроскопа «Carl Zeiss Jena».

Криоконсервацию проводили ступенчатым методом погружения в жидкий азот с помощью внутриклеточного криопротектора DMSO (МР Biomedicals) в концентрации 10% [6, 7].

Для статистической обработки данных использовали метод достоверности различий между группами по крите рию Стьюдента (t) с определением показателя статистичес кой достоверности (при р<0,05 различия рассматривались как статистически достоверные).

Результаты исследования и обсуждение

При получении первичных культур клеток одним из важных моментов является подбор протеолитических ферментов. Хрящевые ткани в зависимости от возраста и вида источника требуют разного способа выделения клеток.

Для получения первичных культур клеток используется целый ряд дезагрегирующих ферментов и реагентов: трип син, химотрипсин, коллагеназа, тринатрий цитрат, смесь версена и трипсина и др. Следует отметить, что, несмотря на многообразие предлагаемых ферментов, наиболее распро страненными на сегодняшний день является использование трипсина и коллагеназы [8].

Для получения суспензии хондроцитов использовали кусоч ки хрящей из межпозвонковых дисков новорожденной соба ки, которые диссоциировали с помощью растворов 0,025% трипсина или 0,1% коллагеназы (п = 4). Результаты показа ли, что при использовании растворов трипсина остается боль шое количество кусочков недиссоциированной ткани, а увеличение времени воздействия трипсина приводило к ги бели клеток. Применение же растворов коллагеназы позво ляло получить суспензию клеток с жизнеспособностью более 90%.

Анализ литературных данных показал, что не существует универсальной методики выделения хондроцитов. В рабо тах использовали различные диспергенты: коллагеназу, гиалуронидазу, проназу и др. [9 13]. В нашей работе мы сравнили способы выделения хондроцитов с помощью ра створов коллагеназы и гиалуронидазы (п = 6). Данные по выделению жизнеспособных клеток в зависимости от вида и концентрации ферментов представлены на рис. 1.

Как видно из рисунка, при использовании 0,05 % гиалу ронидазы количество жизнеспособных хондроцитов соста вило 10 млн/г ткани. В то же время использование 0,05% коллагеназы приводило к увеличению количества выделен ных клеток приблизительно в 2 раза. Количество жизнеспо собных хондроцитов при использовании 0,1% коллагеназы или смеси гиалуронидазы и коллагеназы в концентрации по 0,05% каждой было сравнимо с таковым при использовании 0,05% коллагеназы. Наибольшее количество выделенных клеток в данном исследовании наблюдали при использова нии 0,15% коллагеназы. Количество жизнеспособных клеток составило более 30 млн/г ткани.

Сравнительное исследование особенностей диссоциации хрящевой ткани фетуса и хрящевой ткани позвоночника больных идиопатическим сколиозом показало, что эти тка ни требуют разного времени ферментативной диссоциации (п = 6). Хрящевая фетальная ткань человека и межпозвон ковых дисков собаки диссоциировала в коллагеназе 5 8 ча сов, а хрящевая ткань позвоночника больных идиопатическим сколиозом - 18 20 часов. Увеличение времени воздей ствия фермента приводило к гибели жизнеспособных хонд роцитов, а уменьшение к снижению выхода клеток.

При культивировании хондроцитов из разных источни ков получения было отмечено различие морфологических и культуральных свойств клеток каждого источника.

Хондроциты фетальной хрящевой ткани прикреплялись и распластывались на поверхности культурального флако на на 2 час культивирования. В первые сутки можно было различить очаги роста, содержащие эпителиоподобные клетки. На 3 сутки культивирования хондроциты фетуса че ловека 1 пассажа формировали плотный монослой. При этом клетки имели специфическую эпителиоподобную морфологию (рис. 2А). К 3 пассажу культура хондроцитов приобретала фибробластоподобную форму (рис. 2В, С), что соответствует литературным данным [14]. Важно отме тить, что культура хондроцитов суставов фетуса человека к 4 пассажу содержала больше фибробластоподобных кле ток по сравнению с культурой хондроцитов позвоночника фетуса человека. На всем протяжении культивирования фетальные хондроциты показывали высокий уровень про лиферации, индексы пролиферации составили 4 и 5 на втором и третьем пассажах соответственно. При длитель ном культивировании индекс пролиферации снижался, в культуре наблюдали гибель клеток.

Хондроциты позвоночника больных идиопатическим сколиозом в отличие от хондроцитов фетальной ткани при культивировании только на 14 сутки прикреплялись ко дну культурального флакона и начинали делиться и к 21 суткам формировали неплотный, сетчатый монослой. Клетки име ли многочисленные вакуоли, более крупные размеры, по сравнению с хондробластами здоровой ткани (рис. 2D). При пассировании хондроциты позвоночника больных идиопа тическим сколиозом показывали низкий уровень пролифе рации, индекс пролиферации не больше 2, к 6 пассажу культура полностью деградировала. Таким образом, хонд роциты позвоночника больных идиопатическим сколиозом по сравнению с хондроцитами фетальной ткани обладали худшей культуральной активностью. Это может быть связа но как с возрастом донора, так и с нарушением обменных процессов в хрящевой ткани больных идиопатическим сколиозом [15].

Клетки межпозвонковых дисков новорожденной собаки показывали ту же динамику культивирования, что и хондро циты фетальной ткани человека (рис. 3): ко 2 часу культи вирования клетки прикреплялись и распластывались по поверхности культурального флакона, к 3 суткам формиро вали плотный монослой. Хондроциты межпозвонковых дис ков новорожденной собаки, по сравнению с фетальными хондроцитами человека, обладали меньшими размерами, имели округлую или полигональную форму. На протяжении периода культивирования хондроциты межпозвонковых дисков новорожденной собаки так же, как и хондроциты фетуса человека, показывали высокий уровень пролифера ции (рис. 4).

Заключение

Таким образом, в результате исследования показано, что для получения максимального количества жизнеспособных хондроцитов наилучшим методом диссоциации хрящевой ткани из разных источников выделения является обработка 0,15% раствором коллагеназы для фетальной ткани в те чение 5 часов, а для ткани позвоночника больных идиопа тическим сколиозом в течение 18 20 часов.

Культуры хондроцитов, полученные из разных источни ков, отличаются друг от друга по культуральным и морфологи ческим свойствам. Наибольшей культуральной активностью обладают клетки, выделенные из хрящевой ткани фетуса человека.

Обнаруженные нами различия в морфологии и культу ральной активности хондроцитов, выделенных из различных источников, в перспективе могут быть использованы при раз работке способов воздействия на регенерацию суставного хряща или межпозвонковых дисков; наиболее перспектив ным материалом в этом плане следует признать фетальные хондроциты.

Подняться вверх сайта