Поиск Кабинет

Выбор условий индукции дифференцировки мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека в инсулинпродуцирующие клетки in vitro

Гены & Клетки: Том VI, №1, 2011 год, стр.: 73-79

 

Авторы

Петренко Ю.А., Мазур С.П., Грищук В.П., Лебединский А.С., Скоробогатова Н.Г., Божок Г.А., Блох К., Варди П., Петренко А.Ю.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Направленная дифференцировка мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) в инсулинпродуцирующие клетки открывает перспективы разработки методов лечения инсулинзависимого сахарного диабета. Целью работы явилось оценить in vitro способность ММСК жировой ткани человека вступать в дифференцировку в инсулинпродуцирующие клетки под влиянием экстракта поджелудочной железы новорожденных поросят и экстракта регенерирующей поджелудочной железы крыс в среде с высоким содержанием глюкозы. ММСК, полученные из жировой ткани человека, имели иммунофенотип CD29+/CD44+/CD73+/CD105+ и CD34–/CD38–/CD45–. При культивировании в среде с высоким содержанием глюкозы (25 mM) в присутствии 10 mM никотинамида ММСК изменяли морфологию, позитивно окрашивались дитизоном, образовывали кластеры и экспрессировали инсулин и проинсулин. Присутствие в среде дифференцировки экстракта регенерирующей поджелудочной железы крыс или экстракта поджелудочной железы новорожденных поросят стимулировало направленную дифференцировку ММСК в инсулинпродуцирующие клетки, причем эффективность индуцирующего действия экстракта поджелудочной железы новорожденных поросят была выше, что подтверждалось морфологически, а также при дальнейшем проведении иммуноцитохимических и морфометрических исследований на содержание инсулина и проинсулина.

В настоящее время получены убедительные экспериментальные результаты, свидетельствующие о способности мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) приобретать фенотип инсулинпродуцирующих клеток [1–4]. Это обстоятельство открывает перспективы разработки методов лечения инсулинзависимого сахарного диабета на основе применения ММСК. Однако для достижения существенных успехов в данном направлении необходимо решить ряд задач, в том числе, усовершенствовать протоколы дифференцировки ММСК в функционально активные панкреатические β-клетки.

Существующие методы индукции in vitro дифференцировки ММСК в инсулинпродуцирующие клетки малочисленны, а индукционные среды сложны и требуют дорогостоящих реактивов. В частности, в работе Timper с соавт. (2006) с этой целью использовали среду с высоким содержанием глюкозы, включающую никотинамид, активин-2, эксендин-4, фактор роста гепатоцитов, пентагастрин [2]. При культивировании в данной среде ММСК жировой ткани (ЖТ) человека удалось добиться повышения в них экспрессии панкреатических транскрипционных факторов Isl-1, Ipf-1 и Ngn3, а также индукции синтеза таких гормонов поджелудочной железы, как инсулин, глюкагон и соматостатин.

Недавно было показано, что экстракт поджелудочной железы крыс, полученный из регенерирующего органа после частичной панкреатэктомии, стимулирует дифференцировку ММСК костного мозга крыс [3] и ЖТ человека [4] в инсулинпродуцирующие клетки. При культивировании ММСК в среде с низким содержанием глюкозы в присутствии экстракта регенерирующей поджелудочной железы крыс увеличивался уровень экспрессии панкреатических транскрипционных факторов, м-РНК инсулина и С-пептида. В то же время очевидно, что использование экстрактов поджелудочной железы крыс при разработке протокола дифференцировки ММСК человека в инсулинпродуцирующие клетки вряд ли имеет перспективу последующего клинического применения, а это стимулирует поиск других индукторов.

Мы посчитали, что одним из таких индукторов может служить экстракт поджелудочной железы новорожденных поросят. Основанием для такого предположения явилось достаточно широкое использование в медицинской практике препаратов белков и пептидов, полученных из тканей свиней, основанное на сходстве биохимических характеристик данного вида и человека, а также наличие в таком экстракте значительного количества биологически активных веществ, специфичных для данной стадии онтогенеза.

В связи с этим, целью настоящей работы явилось оценить in vitro способность ММСК ЖТ человека вступать в дифференцировку в инсулинпродуцирующие клетки под влиянием экстракта поджелудочной железы новорожденных поросят и экстракта регенерирующей поджелудочной железы крыс в среде с высоким содержанием глюкозы.

Материал и методы

Выделение и культивирование ММСК ЖТ

ЖТ человека получали после процедуры липосакции с письменного согласия проинформированных доноров в соответствии с рекомендациями Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации по проведению биомедицинских исследований. ММСК из ЖТ выделяли и культивировали согласно опубликованной ранее методике [5]. Для этого ЖТ тщательно промывали фосфатно-солевым буфером (phosphate-buffered saline, PBS) и обрабатывали 0,05% раствором коллагеназы ІІ типа (Sigma) при 37°C на протяжении 90 мин для расщепления внеклеточного матрикса. Полученную в результате инкубации суспензию центрифугировали при 2500 об/мин в течение 15 мин. Верхние слои – свободный жир и адипоциты – удаляли, осадок ресуспендировали в соотношении 1:10 в фосфатном буфере, содержащем 10% эмбриональной сыворотки коров (Биолот, Россия; ЭС) и повторно центрифугировали при 1200 об/мин на протяжении 10 мин. Полученную стромально-васкулярную фракцию ЖТ фильтровали через нейлоновый фильтр с диаметром пор 100 мкм и помещали в культуральный пластиковый сосуд в ростовую среду α-МЕМ (Minimum Essential Medium Eagle, alpha modification), дополненную 10% ЭС, 2 мМ L-глутамина, 50 ед/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина. Культивирование проводили при 37°C в атмосфере 5% CO2 и абсолютной влажности. Через 12–20 ч после посева неприкрепившиеся клетки удаляли промыванием культуральной поверхности фосфатно-солевым буфером. Дальнейшее культивирование адгезивных клеток стромально-васкулярной фракции продолжали в тех же условиях с заменой ростовой среды каждые 3 сут. до достижения субконфлуента, после чего производили пересев по стандартной методике с использованием смеси растворов трипсина и версена 1:4 и последующее культивирование на протяжении 4-х пассажей.

Определение иммунофенотипа

Для определения иммунофенотипа клетки отделяли от культурального пластика по стандартной методике с использованием смеси растворов трипсина и версена 1:4 и инкубировали в течение 30 мин с моноклональными антителами CD29-РЕ, CD45PE, CD105-FITC (Serotec), CD 34 Class II-FITC, CD 38-RPE (DAKO, Holland), CD44-FITC, CD73-PE (BD Biosciences) в соответствии с инструкциями производителей. Определение осуществляли на проточном цитофлуориметре FACS Calibur (BD Biosciences, США). Результаты проточной цитометрии анализировали с использованием программы WinMDI v2.8.

Получение экстрактов поджелудочной железы

Экстракты получали из поджелудочных желез новорожденных поросят и частично панкреатэктомированных молодых крыс согласно методике Choi с соавт. (2005) [3]. Все манипуляции с животными проводились согласно требованиям Комитета по биоэтике ИПКиК НАН Украины и «Общих принципов экспериментов на животных», принятых І Национальным конгрессом по биоэтике (Киев, Украина, 2004) на основании положений «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других исследовательских целях» (Страсбург, Франция, 1986) и в соответствии с Законом Украины «О жестоком обращении с животными» (2006). Все манипуляции с животными выполняли с применением эфирного наркоза. Самцам белых крыс (возраст – 3 мес.) производили 70% панкреатомию. Через 24 ч после хирургического вмешательства остаток поджелудочной железы иссекали, немедленно помещали в охлажденный фосфатно-солевой буфер, дополненный ингибиторами протеаз, и гомогенизировали в гомогенизаторе Поттера. Гомогенат свежеизвлеченной поджелудочной железы новорожденных (1–2 сут. после рождения) поросят готовили аналогично.

Полученные гомогенаты центрифугировали сначала при 3000 об/мин в течение 10 мин, а потом для получения окончательного прозрачного супернатанта – при 12000 об/мин на протяжении 20 мин при 0°C. Полученные экстракты пропускали через мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм и хранили в аликвотах при -80°C до непосредственного использования.

Индукция дифференцировки ММСК ЖТ в инсулинпродуцирующие клетки

Индукцию дифференцировки ММСК ЖТ в инсулинпродуцирующие клетки in vitro проводили на фоне увеличенной до 25 mM концентрации глюкозы в присутствии или в отсутствие исследуемых экстрактов поджелудочной железы животных при культивировании в течение 21 сут. со сменой среды каждые 3 сут. Были сформированы 4 экспериментальные группы:

1 – ММСК ЖТ, культивированные в среде дифференцировки (СД): питательная среда DMEM/F12, содержащая 10% ЭС, 25 mM глюкозы и 10 mM никотинамида [6];

2 – ММСК ЖТ, культивированные в СД с добавлением экстракта регенерирующей поджелудочной железы крыс в конечной концентрации белка 0,2 мг/мл [3];

3 – ММСК ЖТ, культивированные в СД с добавлением экстракта поджелудочной железы новорожденных поросят в конечной концентрации белка 0,2 мг/мл;

4 – ММСК ЖТ, культивированные в ростовой среде без дополнительных индукторов.

Окрашивание дитизоном

Для экспресс-оценки способности ММСК ЖТ дифференцироваться в инсулинпродуцирующие клетки использовали метод окрашивания дитизоном (dithizone) [7]. Для этого раствор дитизона (10 мг/мл) добавляли в культуральную среду в соотношении 1:100 и проводили инкубацию в течение 15 мин при 37°C. Затем культуры клеток тщательно промывали PBS и с помощью инвертированного микроскопа выявляли дитизон-позитивные клетки, имеющие красное окрашивание.

Иммуноцитохимические исследования

Для проведения иммуноцитохимического анализа культуры фиксировали 4% раствором параформальдегида в PBS на протяжении 15 мин при комнатной температуре, трижды отмывали PBS, содержащим 0,1% бычьего сывороточного альбумина, и пермеабилизировали 0,2% раствором Triton X-100 в течение 5 мин. Клетки окрашивали первичными моноклональными антителами на инсулин, проинсулин, глюкагон и соматостатин (см. табл. 1) в течение 1 ч при комнатной температуре, после чего трижды промывали PBS. Для предотвращения неспецифического связывания моноклональных антител клетки преинкубировали в блокирующем растворе (10% молока и 90% ЭС), который затем дважды отмывали промывающим раствором на основе PBS. Инкубацию клеток со вторичными Cytm2/Cytm3-коньюгированными антителами (табл. 1) проводили в течение 30 мин в темноте, после чего трижды промывали PBS. Для контроля неспецифического связывания антител клетки окрашивали только вторичными антителами.

Все антитела были прокалиброваны с использованием клеточных линий Hep-3B (негативные на маркеры островков поджелудочной железы) и Ins-1E, а также поджелудочной железы человека (позитивный контроль на панкреатические маркеры). Связывание антител визуализировали с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа Olympus. С целью выявления ядер клетки окрашивали DAPI (4,6-diamidino-2-phenyindole) в течение 5 мин, после чего дважды отмывали PBS.

Морфометрические исследования

Для проведения морфометрических исследований использовали программное обеспечение Adobe Photoshop CS, а также программу анализа изображения Scion image beta 4.0.2. Анализ изображений проводили согласно Tokumoto S. с соавт. (2008) [8] с небольшими модификациями. С использованием Adobe Photoshop CS на микрофотографиях, полученных с помощью флуоресцентного микроскопа, выделяли синий цвет, присущий окраске ядер DAPI, по количеству ядер определяли среднее количество клеток в пяти отдельных, случайным образом выбранных полях зрения с использованием Scion image. На тех же полях оценивали площадь позитивного окрашивания клеток на инсулин и проинсулин (зеленое окрашивание). Затем определяли отношение средней площади позитивного окрашивания к среднему количеству клеток в поле зрения и выражали значения в мкм2/клетку. По этому показателю оценивали относительное содержание гормонов в клеточном монослое.

Результаты и обсуждение

Первичная культура адгезивных клеток стромально-васкулярной фракции ЖТ была представлена клеточными элементами, различающимися по морфологическим признакам. К 10–12 сут. они формировали 70–80% конфлуентного монослоя, после чего проводилась их трипсинизация. В процессе культивирования гетерогенность исходной суспензии снижалась, и после 3–4 пассажа культура была представлена преимущественно фибробластоподобными клетками (рис. 1).

Проведенный иммунофенотипический анализ показал, что культивированные фибробластоподобные клетки жировой ткани человека 4-го пассажа имеют иммунофенотип CD29+/CD44+/CD73+/CD105+ и CD34–/CD38–/CD45–, который характерен для ММСК (рис. 2). При этом содержание клеток, имеющих данный иммунофенотип, составляло около 95%, что соответствует характеристикам, полученным для ММСК из других источников [9].

Для исследования способности ММСК ЖТ человека к направленной дифференцировке в инсулинпродуцирующие клетки дальнейшее культивирование проводили в СД с увеличенной до 25 mM концентрацией глюкозы и 10 mM никотинамида в присутствии или в отсутствие исследуемых экстрактов поджелудочной железы животных. Контролем вступления клеток в индуцированную дифференцировку служили клетки, культивированные в ростовой среде без дополнительных индукторов (группа 4).

К 21-м сут. культивирования ММСК ЖТ в условиях направленной дифференцировки во всех экспериментальных группах (группы 1–3) наблюдалось появление эпителиоподобных клеток и образование клеточных групп и/или кластеров. Степень выраженности этих изменений зависела от состава культуральной среды. Применение СД без добавления экстрактов (группа 1) приводило к появлению незначительного количества эпителиоподобных клеток с формированием клеточных групп на фоне монослоя фибробластоподобных клеток (рис. 3А).

При использовании СД, дополненной экстрактом регенерирующей поджелудочной железы крыс (группа 2), отмечено увеличение количества эпителиоподобных клеток, способных к образованию довольно плотных кластеров, располагавшихся в составе малоизмененного монослоя, образованного преимущественно фибробластоподобными клетками (рис. 3Б).

Культивирование ММСК ЖТ в присутствии СД, содержащей экстракт поджелудочной железы новорожденных поросят, приводило к выраженной гетерогенности клеточных элементов монослоя с образованием кластеров. Прилегающие к кластерам клетки обладали эпителиоподобным видом и содержали множественные оптически плотные гранулы (рис. 3В). В противоположность этому, в контрольной группе, где культивирование велось в ростовой среде без индукторов, клеточные кластеры не обнаруживались, а клетки монослоя демонстрировали фибробластоподобный вид (рис. 3Г) и могли формировать характерные «потоки».

Дифференцировку ММСК ЖТ в инсулинпродуцирующие клетки диагностировали с помощью окрашивания культур дитизоном. Дитизон является цинк-хелатирующим агентом, который селективно окрашивает панкреатические β-клетки, отличающиеся высоким внутриклеточным содержанием цинка [7]. Наличие клеток, которые позитивно окрашивались дитизоном, наблюдалось во всех экспериментальных группах (группы 1–3), что позволяет говорить об успешности вступления ММСК в дифференцировку в инсулинпродуцирующие клетки (рис. 4).

Дальнейшие иммуноцитохимические исследования показали, что часть кластеров и одиночных клеток монослойной культуры ММСК ЖТ после 21 сут. культивирования в индуцирующих средах окрашиваются антителами к инсулину и проинсулину (рис. 5). Эти данные подтверждают реализацию у клеток экспериментальных групп инсулинпродуцирующего фенотипа. В группе 4, где клетки культивировали в ростовой среде, позитивного окрашивания на данные маркеры не обнаруживалось. Во всех экспериментальных группах не выявлено существенного позитивного окрашивания антителами к глюкагону. Вместе с тем, наблюдалось незначительное окрашивание культур моноклональными антителами к соматостатину.

Сравнение результатов иммуноцитохимического окрашивания на содержание инсулина и проинсулина, полученных для культур разных экспериментальных групп, показало, что оба использованных в работе экстракта поджелудочной железы оказывают стимулирующее действие на вступление в дифференцировку ММСК ЖТ. Для сравнения выраженности индуцирующего эффекта при использовании различных сред дифференцировки с помощью морфометрических исследований определяли относительное содержание гормонов в клеточном монослое. Как видно из табл. 2, экстракт поджелудочной железы новорожденных поросят оказывал более выраженный индуцирующий эффект на дифференцировку этих клеток в направлении инсулинпродуцирующих клеток по сравнению с экстрактом регенерирующей поджелудочной железы крыс.

Известно, что повышение концентрации глюкозы является фактором, приводящим к ускорению роста и дифференцировки β-клеток поджелудочной железы [10]. Lijun Yang с соавт. (2002) [6] впервые показали, что культивирование овальных клеток печени – претендентов на стволовые клетки печени – в среде с высоким содержанием глюкозы приводит к их трансдифференцировке в β-клетки поджелудочной железы, причем эффективность этого процесса увеличивается в присутствии никотинамида. Печень и поджелудочная железа развиваются из одной популяции клеток эмбриональной энтодермы, и выявленный в работе индуктор панкреатической дифференцировки – глюкоза в высокой концентрации – может оказаться недостаточно эффективным в случаях, когда в качестве источника выбираются онтогенетически разные клетки-предшественницы. Такая ситуация как раз и возникает, если осуществлять ориентированную в панкреатическом направлении дифференцировку мезенхимальных стромальных клеток, которые в настоящий момент представляются наиболее перспективными с точки зрения клеточных биотехнологий. Результаты нашей работы свидетельствуют о том, что присутствие высокой концентрации глюкозы в сочетании с никотинамидом в среде культивирования ММСК ЖТ приводит к их вступлению в дифференцировку в инсулинпродуцирующие клетки. Однако эффективность такого варианта направленной дифференцировки невысокая. Это заключение согласуется с данными работы Timper с соавт. (2006), в которой для дифференцировки ММСК ЖТ, культивированных в среде с высоким уровнем глюкозы в присутствии никотинамида, в β-клетки поджелудочной железы были необходимы дополнительные компоненты, такие как активин-2, эксендин-4, фактор роста гепатоцитов, пентагастрин и другие [2].

Среди индукторов дифференцировки ММСК в инсулинпродуцирующие клетки привлекательными, на наш взгляд, могут быть тканеспецифические природные источники. В этой связи, наше внимание привлекла работа Hardikar и Bhonde (1999), в которой показано, что экстракт, полученный из регенерирующей поджелудочной железы, стимулирует неогенез островков и вызывает нормогликемию у мышей с экспериментальным стрептозотоцининдуцированным диабетом [11]. Последующие работы показали, что присутствие такого экстракта в среде культивирования индуцировало дифференцировку ММСК костного мозга крыс [3] и ММСК ЖТ человека [4] в инсулинпродуцирующие клетки. Однако конечная цель таких исследований – клиническое применение – делает неперспективным использование агентов, полученных из тканей грызунов. В связи с этим, мы провели сравнительный анализ способности выступать в качестве индуктора дифференцировки ММСК ЖТ в инсулинпродуцирующие клетки экстрактов, полученных из регенерирующей поджелудочной железы крыс и поджелудочной железы новорожденных поросят. Наш выбор основывался, во-первых, на общеизвестной близости биохимических характеристик человека и свиньи. Во-вторых, поджелудочная железа новорожденных поросят содержит не только тканеспецифические, но и стадиоспецифические факторы, способные влиять на рост и дифференцировку клеток. Новорожденные поросята имеют некоторую анатомическую и функциональную незрелость органов пищеварительного аппарата, в том числе и поджелудочной железы [12]. В первые недели жизни поросят наблюдается интенсивный рост β-клеточной массы за счет дифференцировки из клеток-предшественниц, пролиферации β-клеток и увеличения их размеров [13], тем самым обеспечивается специфичность набора ростовых и дифференцировочных факторов в поджелудочной железе новорожденных поросят. Было показано, что трансплантированные клетки поджелудочной железы новорожденных поросят стимулируют регенерацию островков у мышей с экспериментальным диабетом [14].

Результаты нашей работы свидетельствуют о том, что экстракты регенерирующей поджелудочной железы крыс и поджелудочной железы новорожденных поросят могут служить индукторами дифференцировки in vitro ММСК ЖТ человека в инсулинпродуцирующие клетки. При культивировании ММСК в присутствии данных экстрактов наблюдалось изменение морфологии клеток с последующим формированием кластеров. Результаты иммуноцитохимических исследований и последующий морфометрический анализ позволяют сделать вывод, что эффективность индуцирующего действия экстракта поджелудочной железы новорожденных поросят выше, чем действие экстракта регенерирующей поджелудочной железы крыс.

Считают, что одним из первостепенных событий, которые имеют место при организации островков, является процесс кластеризации, т.е. миграции клеток друг к другу и образования агрегатов [15, 16]. Установлено, что панкреатические клеткипредшественницы способны выделять сигнальные молекулы, которые вызывают кластеризацию и образование островков [17]. Одной из таких молекул является кластерин, который поддерживает агрегацию эндокриноцитов поджелудочной железы в периоды пре- и неонатального развития [18, 19], а также участвует в ее регенерации [20, 21]. Недавно было показано, что в поджелудочной железе новорожденных поросят наблюдается высокий уровень экспрессии кластерина [22]. Можно предположить, что именно это обстоятельство обуславливает высокую активность экстракта поджелудочной железы новорожденных поросят при использовании их в качестве индуктора панкреатической дифференцировки in vitro.

Таким образом, в работе продемонстрирована способность ММСК ЖТ человека дифференцироваться в инсулинпродуцирующие клетки под влиянием индукторов естественного происхождения. Использование в культуре экстракта поджелудочной железы новорожденных поросят приводит к эффективной индукции дифференцировки исследуемых клеток. Результаты настоящей работы могут послужить основой при разработке новых направлений биотехнологии, предназначенных для медицинских целей, в частности для клеточной терапии инсулинзависимого сахарного диабета.

Подняться вверх сайта