Поиск Кабинет

Выбор стратегии экспансии мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга, полученных от доноров с сердечной недостаточностью и коморбидностями

Гены & Клетки: Том VIII, №1, 2013 год, стр.: 36-42

 

Авторы

Дмитриева Р.И., Клюкина М.А., Минуллина И.Р., Анисимов С.В., Зарицкий А.Ю.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

трансплантация аутогенных мультипотентных мезен химных стромальных клеток (ММСК) костного мозга рас сматривается в качестве нового перспективного подхода в лечении сердечно-сосудистых заболеваний, в том числе хронической сердечной недостаточности (ХСН). Кандида тами для такого лечения могут оказаться пожилые паци енты с широким спектром сопутствующих заболеваний, которые могут влиять на функциональные свойства клеточ ного образца – субстрата трансплантации. В данной работе впервые исследовано влияние ХСН, ожирения и сахарного диабета на свойства клеточного препарата, а также ис следованы возможности снижения зависимости свойств клеточного материала от индивидуальных характеристик донора.

ММСК были получены из образцов костного мозга 10 здоровых доноров, 16 пациентов с изолированной ХСН, 21 пациента с ХСН и ожирением, 3 пациентов с ХСН и сахар ным диабетом, и 9 пациентов с ХСН, ожирением и диа бетом. Свойства полученных образцов исследовали на по следовательных пассажах при различной плотности посева в условиях гипоксии и нормоксии: иммунофенотип, проли феративная активность, дифференцировочный потенциал. У пациентов с ХСН и коморбидностями пролифератив ная активность клеток существенно снижалась по сравне нию с полученными от здоровых доноров уже на ранних пассажах и сопровождалось развитием признаков репли кативного старения, снижением доли клоногенных мульти потентных клеток. При уменьшении плотности посева до 100 кл/см2 наблюдалось существенное увеличение числа удвоений клеточной популяции при сохранении стабильной пролиферативной активности, а гипоксия дополнительно увеличивала продолжительность поддержания высокой пролиферативной активности образца без развития при знаков репликативного старения.

Показано, что изменение тактики in vitro экспансии существенно снижает влияние индивидуальных особенно стей донора на функциональные свойства ММСК костного мозга.

Большинство заболеваний сердечно-сосудистой системы, занимающих ведущее место среди причин смерти во всем мире, приводят к развитию хрони ческой сердечной недостаточности (ХСН). При этом доступные в настоящее время терапевтические методы могут лишь уменьшить выраженность её симптомов и замедлить прогрессию. В терминаль ной стадии ХСН единственным радикальным мето дом лечения становится трансплантация сердца – операция, которая не может стать массовой из-за отсутствия достаточного количества доноров, высо кой стоимости и проблем, связанных с иммуносу прессией[1]. Поэтому для снижения смертности от ХСН, а также для предупреждения развития стойкой декомпенсации необходимы новые терапевтические подходы, направленные на восстановление структу ры и функции сердечной мышцы. В качестве одного из наиболее перспективных уже на протяжении не скольких десятков лет рассматривают клеточную те рапию. Результаты экспериментов как in vitro, так и на моделях у животных, а также результаты недавних клинических исследований подтверждают эффективность данного направления биотехнологий[1–8].

Клетки, пригодные для клеточной терапии ХСН, должны обладать определенными характеристиками, как то: доступность в необходимом количестве, без опасность применения, эффективность с точки зрения выживаемости in vivo и обеспечения репаративной ре генерации миокарда[8]. В качестве материала для клеточной терапии рассматривают различные типы клеток: мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (ММСК), гетерогенная популяция мононукле арных клеток костного мозга, миобласты скелетных мышц, резидентные стволовые клетки миокарда и скелетной мышцы, фетальные кардиомиоциты, фи бробласты[2, 8–10, 11]. Результаты клинических исследований, проведенных с использованием раз ных типов клеток, являются противоречивыми и не позволяют сделать однозначные выводы о том, ка кие клетки являются наиболее эффективными для терапии сердечно-сосудистых заболеваний. Однако признано, что ММСК костного мозга являются од ними из наиболее удобоваримых для клинического использования благодаря возможности их быстрой и эффективной экспансии in vitro и их иммунопри вилегированному статусу, что указывает на потен циальную возможность аллогенной трансплантации[12–16]. Несмотря на то, что многие исследовате ли полагают, что ММСК костного мозга могут быть успешно трансплантированы в аллогенном варианте, большинство авторов считают, что идеальной явля ется аутологичная трансплантация[8, 17]. Тем не менее, при рассмотрении возможности использова ния аутогенных клеток всегда необходимо учитывать тот факт, что донор-реципиент для этого вида ле чения будет пожилым, с широким спектром сопут ствующей патологии и получающим определенное лечение. Недавние исследования когорты пациентов с ХСН в США показали, что в течение двух последних десятилетий доля пациентов старше 80 лет среди больных ХСН выросла в два раза. Существенно воз росло число пациентов с такими коморбидностями, как ожирение, сахарный диабет, остеопороз, забо левания почек и щитовидной железы, гиперхолесте ринемия. Употребление лекарственных препаратов выросло более чем на 50%[18]. Все эти факторы могут оказывать существенное влияние на свойства ММСК, полученных из тканей больного ХСН, и ограничивать возможности аутологичной трансплантации. Влияние возраста донора на свойства ММСК активно изучалось в последние годы во многих лабораториях[19, 20], однако исследование характеристик ММСК, полученных от пациентов с ХСН и сопутствующей патологией (ожирение и сахарный диабет) ранее не проводилось. В нашей работе впервые на большой группе доноров было исследовано влияние ХСН и таких коморбидностей, как ожирение и сахарный диабет на свойства ММСК костного мозга. Также были оценены возможности улучшения качества образцов ММСК костного мозга, полученных от таких пациентов.

Материал и методы

Характеристика пациентов

В исследование было включено 49 доноров, в том числе 10 здоровых доноров, 16 пациентов с изолированной ХСН, 21 пациент с сердечной недо статочностью и ожирением (ХСН+О), 3 с сердечной недостаточностью и диабетом (ХСН+Д) и 9 с сер дечной недостаточностью, ожирением и диабетом (ХСН+О+Д). Исследование проводилось в соот ветствии со стандартами Хельсинской Декларации (1989), всеми пациентами было подписано инфор мированное согласие.

Получение культур ММСК костного мозга

Аспират костного мозга получали из подвздош ной кости донора. Культуру ММСК получали стан дартным методом[21]. Выделенные в градиенте плотности фиколла мононуклеарные клетки костно го мозга высевали в культуральные флаконы (2×105 кл/см2 ) и культивировали в среде α-МЕМ (ПанЭко, Россия) с добавлением 10% сыворотки плодов коровы (HyClone, США), 2 мМ L-глутамина и 1% смеси пенициллин/стрептомицин (Invitrogen, США) в стандартных условиях до получения конфлюэнт ной культуры. Этому пассажу присваивали нулевой номер (Р0). Часть мононуклеаров отбиралась для определения содержания клоногенных клеток (CFU) в исходном образце (описание метода см. ниже).

Определение времени удвоения популяции (PD) и числа кумулятивных делений

Хотя при изучении клеток, полученных путем экспансии исходного образца, наиболее удобным методом документирования и систематизации ре зультатов является подсчет пассажей, нормализа ция результатов по номеру пассажа может оказать ся некорректной и привести к неверным выводам. С этой точки зрения более корректным является под счет числа удвоений популяции клеток in vitro[22]. Культуру ММСК получали методом селекции по ад гезии. Начальное количество ММСК в исходном об разце мононуклеаров костного мозга определялось при подсчете CFU в каждом образце. Подсчет CFU производился, исходя из предположения, что каждая колония ММСК была образована из одной «роди тельской» клоногенной клетки. Метод хорошо описан ранее[23], в его основе лежит принцип последова тельных разведений: суспензию клеток последова тельно разводили в два раза в шести рядах 96-лу ночного культурального планшета таким образом, чтобы в первом ряду было 2×104 клеток на лунку, в шестом ряду – 625 клеток на лунку. Через 10 сут. культивирования в стандартных условиях подсчиты вали лунки, в которых образовались и не образо вались колонии ММСК, исходя из чего вычисляли содержание клоногенных клеток в исходном образ це. После этого на каждом пассаже подсчитывали количество клеток и определяли время удвоения по пуляции и число кумулятивных удвоений популяции in vitro.

Определение числа CFU и дифференцировочного потенциала ММСК

Суспензию ММСК костного мозга последова тельно разводили в два раза в восьми рядах двух 96-луночных культуральных планшетов таким обра зом, чтобы в первом ряду было 50 клеток на лунку, в последнем ряду – 0,39 клеток на лунку.

Через 10 сут. культивирования подсчитывали в каждом ряду положительные и отрицательные лун ки и вычисляли содержание CFU в культуре ММСК. После этого в одном планшете полученные колонии индуцировали к дифференцировке в адипогенном, а во втором планшете – в остеогенном направле нии. Клоногенные клетки с адипогенным потенциа лом (CFU-Ad) определяли через 14 сут. реакцией с OilRedO, с остеогенным потенциалом (CFU-Ost) через 21 сут. после окраски Alizarin Red. Адипогенная сре да содержала 1мкМ инсулина, 1 мкМ дексаметазо на, 0,5 мМ изобутил-ментил-ксантина, остеогенная – 10 мM β-глицерофосфата, 10 нM дексаметазона, 50 мкг/мл натрий-L-аскорбил-2-фосфата[23].

Определение клеточного старения

В качестве биомаркера клеточного старения ММСК использовали активность β-галактозидазы. Окрашивание проводили согласно инструкции про изводителя (Senescence Cells Histochemical Staining Kit, SIGMA, США).

Иммунофенотип клеток

Международным Обществом Клеточной Те рапии (ISCT) в 2006 году было предложено при менять термин ММСК к популяциям клеток, экс прессирующих определенный набор поверхностных маркеров: CD105+; CD73+; CD90+; CD45-; CD34-; CD14- или CD11b-; CD19- или CD79α-[11]. ММСК были проанализированы на экспрессию этих мар керов с использованием антител, конъюгированных с фикоэритрином (PE), флуоресцеин изоцианатом (FITC) и аллофикоцианином (APC) (Becton-Dickinson BioSciences, США). Использовали прибор Guava EasyCyte 8 и программное обеспечение ExpressPro.

Результаты

Характеристика первичных культур ММСК

В ходе исследования все образцы ММСК костно го мозга рутинно тестировались на соответствие ми нимальным критериям Международного Общества Клеточной Терапии (ISCT)[11]: клетки были выде лены селекцией по адгезии к пластику, экспрессиро вали поверхностные маркеры CD105, CD73, CD90, СD166, СD146 и не экспрессировали маркеры ге мопоэтических клеток CD45, CD34, CD14 и CD19; были способны к дифференцировке в адипогенном и остеогенном направлениях (репрезентативные ре зультаты показаны на рис. 1).

Пролиферативная активность, репликативное старение

Для каждого образца мононуклеарных клеток костного мозга определяли количество CFU, после чего на 3–4 последовательных пассажах определя ли время удвоения популяции и число кумулятив ных делений. CFU в образцах мононуклеарных кле ток костного мозга колебалось в пределах от 1 до 8 клеток на миллион и не зависело от статуса доно ра, что согласуется с литературными данными[21, 24]. Время удвоения популяции является удобным индикатором пролиферативной активности образ ца, снижение которой указывает на начало разви тия процессов клеточного старения[25]. На ранних этапах экспансии время удвоения популяции MМСК составляло около 1 сут., а затем увеличивалось от пассажа к пассажу, и на третьем пассаже достигало 7 и более сут. При этом динамика снижения про лиферативной активности отличалась для разных групп доноров. Результаты анализа времени удвое ния в разных группах доноров на третьем пассаже представлены на рис. 2. Из графика следует, что у доноров с ХСН и коморбидностями вероятность су щественного снижения пролиферативной активности повышалась по сравнению со здоровыми донора ми уже на втором пассаже (после приблизительно 14 удвоений in vitro). Снижение пролиферативной активности указывает на начало процессов репликативного старения популяции ММСК[25], что подтверждается результатами исследования активности β-галактозидазы и свидетельствует о низкой перспективности использования таких образцов в клинических протоколах.

Клоногенность и мультипотентность

Следующим этапом нашего исследования явля лось выявление возможных связей между развити ем признаков репликативного старения в популяции ММСК и изменением функциональных свойств кле ток. Главными свойствами ММСК являются клоно генность и мультипотентность. Доля CFU в культуре ММСК является основным фактором, определяю щим время удвоения популяции ММСК, а репрезен тативным индикатором мультипотентности является доля клоногенных клеток с потенциалом к адипоген ной (CFU-AD) и остеогенной (CFU-OST) дифференцировкам. Эти показатели определялись нами на нескольких последовательных пассажах, результаты показаны на рис. 3. Как и ожидалось, доля CFU в образцах ММСК существенно снижалась от пассажа к пассажу, достигая в некоторых образцах значений ниже 1%. Увеличение времени удвоения коррелировало с уменьшением числа CFU в культуре (рис. 3А). При этом доля CFU, способных дифференцироваться (CFU-AD, CFU-OST), оставалась практически неизменной при переходе от второго пассажа к четвертому (рис. 3Б). Это позволяет сделать вывод о том, что даже в «стареющей» культуре сохраняется клоногенная фракция, в которой способность к дифференцировке поддерживается на неизменном уровне, а изоляция и экспансия субпопуляции клоногенных клеток из «стареющей» культуры MМСК могла бы привести к получению более однородных образцов с высоким содержанием митотически активных мультипотентных клеток без признаков старения.

Влияние условий культивирования на изменение свойств MМСК

Далее нами было проведено исследование воз можности обогащения образца MМСК клоногенной фракцией путем изменения условий экспансии кле точного материала. В основе экспериментального подхода к решению этой проблемы лежала класси ческая идея о том, что истинно клоногенная клетка способна образовывать колонии фибробластопо добных клеток при так называемом «клональном» высевании на пластик, то есть при очень низкой плотности посадки. Неклоногенные клетки в таких условиях, как правило, погибают[26]. Большинство протоколов культивирования MМСК предлагают для экспансии высевать от 2000 до 5000 клеток на см2 культурального флакона, однако недавние исследования свидетельствуют о том, что при по севе с низкой плотностью (25–200 кл./см2) можно получать культуры MМСК с высокой пролифератив ной активностью, что позволяет сделать экспансию более эффективной[27, 28]. В нашей работе мы исследовали возможность повышения эффективно сти экспансии MМСК, снизив плотность посева на последовательных пассажах до 100 кл./см2 и куль тивируя их в условиях гипоксии (мультигазовый ин кубатор MCO-18М (SANYO, Япония), концентрация СО2 и О2 по 5%). Для этой цели были выбраны пять образцов ММСК с разной динамикой увеличения времени удвоения и развития признаков клеточного старения при культивировании в обычных условиях: образец 1 (здоровый донор, стабильная пролифе ративная активность на протяжении 24 удвоений in vitro), образец 2 (ХСН, небольшое увеличение PD после 18 удвоений in vitro), образец 3 (ХСН+О, существенное увеличение PD после 13 удвоений in vitro), образцы 4 и 5 (ХСН, существенное увеличение PD после 11–14 удвоений in vitro). Во всех образ цах MМСК снижение плотности посева на последо вательных пассажах сопровождалось существенным увеличением числа удвоений клеточной популяции при сохранении стабильной пролиферативной активности, а умеренная гипоксия (концентрация О2 5%) дополнительно увеличивала продолжительность поддержания высокой пролиферативной активности образца (рис. 4). Так, например, в образце 2 про лиферативная активность MМСК, полученных при плотности посева 3000 клеток на см2, снижалась после 14,5 удвоений in vitro, в то время как для MМСК, полученных при плотности посева 100 кле ток на см2, снижение пролиферативной активности наблюдалось лишь после 21 удвоения in vitro. Таким образом, изменение условий получения культуры MМСК повышало эффективность экспансии каж дого образца MМСК и увеличение эффективности варьировало от 23 до 27 раз.

Обсуждение

Трансплантация аутогенных ММСК все чаще рас сматривается в качестве наиболее перспективного терапевтического подхода к лечению сердечно-со судистых заболеваний, в том числе ХСН. Разработка протоколов эффективной экспансии MМСК костно го мозга in vitro при сохранении функциональных свойств клеточного материала является важной технологической задачей, без решения которой невозможно развитие протоколов клеточной тера пии. В нашем исследовании было впервые показа но, что для образцов MМСК, полученных из кост ного мозга значительной группы пациентов с ХСН, при in vitro экспансии характерно раннее снижение пролиферативной активности и появление призна ков репликативного старения по сравнению с об разцами, полученными от здоровых доноров. Также нами показано, что наличие сахарного диабета у таких пациентов являлось фактором, повышающим вероятность получения образцов MМСК низкого качества. Кроме того, нами было установлено, что изменение условий культивирования позволяет повысить эффективность ex vivo экспансии и улучшить качество клеточных культур, полученных от пациентов с ХСН и коморбидностями. Так, для всех исследованных образцов из одного и того же объема костного мозга при снижении плотности высевания MМСК с 3000 клеток/см2 до 100 кл./см2 были получены образцы MМСК в 23–27 большего объема, с высокой пролиферативной активностью и без признаков репликативного старения. Положительный эффект гипоксии (5% О2) также наблюдался, но был не всегда ярко выражен (рис. 4 А–Д). Молекулярные механизмы, лежащие в основе этих эффектов, остаются не изученными до конца. Существуют литературные данные, свидетельствующие о том, что плотность высевания MМСК костного мозга влияет на пролиферативную активность образца[27, 29–31], и соответственно, низкая плотность посева способствует увеличению скорости экспансии MМСК, однако, однозначных выводов о том, какие сигнальные пути участвуют в регуляции контроля пролиферации MМСК, сделано не было. Литературные данные часто противоречивы и указывают на то, что поддержание функциональных свойств MМСК при ex vivo экспансии регулируется на разных уровнях; роль плотности посева и гипоксии в запуске регуляции этих механизмов остается неясной. Например, было показано, что посеянные в низкой плотности клетки в течение нескольких дней находятся в латентной фазе, перед выходом из которой они начинают активно секретировать белок DKK-1, ингибитор сигнального пути Wnt[31]. Высокая концентрация DKK-1 стимулирует вступление ММСК в клеточный цикл и способствует, таким образом, быстрому росту популяции. В другом исследовании[32], напротив, было показано, что стимуляция сигнального пути Wnt литием также стимулировала быстрый рост популяции ММСК при низкой плотности посева. Результаты исследований влияния гипоксии на функциональные свойства MМСК также можно назвать противоречивыми. Так, недавно были опубликованы данные, свидетельствующие о том, что комбинирование клонального высевания и гипоксии при экспансии ММСК предотвращает раннее развитие признаков репликативного старения[33]. Регуляция гипоксией клеточных процессов и сигнальных каскадов опосредована транскрипционным фактором HIF-1, который способен активироваться в ответ на изменение концентрации О2. Авторы показали, что механизм эффекта гипоксии может быть связан со стимуляцией экспрессии сигнального пути «HIF-1 – TWIST» (TWIST – фактор, который экспрессируется в MМСК и участвует в индукции эпителиально-мезенхимального перехода), что в свою очередь предотвращает активацию циклин-зависимого ингибитора киназы 1А (р21) и, соответственно, развитие признаков апоптоза и репликативного старения. Также, недавно было показано, что прекондиционирование MМСК в условиях гипоксии способствует увеличению адипогенного и остеогенного потенциала клеток[34], если индукция дифференцировки проводится в условиях нормоксии; однако при стимуляции диффференцировки при гипоксии (5% О2) наблюдалось небольшое снижение способности MМСК к минерализации внеклеточного матрикса и накоплению липидных капель, по сравнению дифференцировкой при 20% О2, а при 1% О2 MМСК практически полностью теряли способность к минерализации матрикса и не могли успешно дифференцироваться в адипоцитарном направлении[35]. В заключение следует ещё раз отметить, что полученные нами результаты свидетельствуют о низкой перспективности использования ММСК костного мозга, полученных от больных ХСН с коморбидностями, при использовании стандартных условий культивирования in vitro. Для снижения зависимости качества клеточного материала от индивидуальных характеристик донора и/или пациента необходима разработка воспроизводимых и надежных протоколов in vitro экспансии клеточного материала: изменение плотности посева клеток и снижение уровня кислорода в культуральных инкубаторах могут оказаться перспективными подходами в решении этой задачи.

Подняться вверх сайта