Поиск Кабинет

Возможные пути реализации регенерационной стратегии при лечении сахарного диабета I типа методами клеточной трансплантации

Гены & Клетки: Том II, №2, 2007 год, стр.: 23-33

 

Авторы

Закирьянов А.Р., Онищенко Н.А.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

В обзоре представлены современные концепции физиологической и репаративной регенерации р-клеток и островков Лангер-ганса поджелудочной железы при сахарном диабете I типа. Рассмотрены современные подходы к восполнению пула утраченных р-клеток за счет аллогенной трансплантации островковых клеток, а также in vitro дифференцировки взрослых прогениторных клеток поджелудочной железы и эмбриональных стволовых клеток; проанализированы возможные пути индукции in vivo тканеспецифичной регенерации и устранения дизрегуляции иммунной системы при сахарном диабете I типа с помощью терапии стволовыми клетками костного мозга и пуповинной крови.

По современным представлениям, сахарный диабет (СД) I типа - это хроническое аутоиммунное воспаление островков Лангерганса (ОЛ) [1 8], следствием которого является нарушение процессов регенерации, деструкция и гибель р клеток ОЛ [9, Ю] с развитием абсолютной инсулиновой недостаточности и гипергликемии.

Неэффективность процессов восстановительной реге нерации в ОЛ в значительной степени обусловлена и под держивается глубокими нарушениями функций иммунной системы, которая, будучи филогенетически наиболее древ ней интегративной системой организма, более других от ветственна за регуляцию морфогенеза и структурного гомеостаза [1117].

Регенерационная способность р-клеток островков Лангерганса поджелудочной железы На долю ОЛ приходится около 2% массы поджелудочной железы (ПЖ) и, в отличие от экзокринной части, ОЛ обла дают выраженной регенерационной способностью. Суще ствует ряд прямых и непрямых доказательств постоянного р индуцируется уровнем гликемии и регулируется процесса ми пролиферации, регенерации и апоптоза [9, 18 20].

Показано, что уже на ранних стадиях СД I типа под действи ем факторов аутоиммунной агрессии, а также с помощью ме ханизмов апоптоза и некроза [1] наступает гибель большей лине организм на начальных этапах пытается компенсиро вать путем запуска процессов репаративной регенерации и менной (до 7 10 месяцев) клинической ремиссией заболе вания, известной как фаза «медового месяца» (honeymoon phase) [21, 22]. Частичная клиническая ремиссия заболе вания со снижением суточной потребности в экзогенном инсулине описана у 43 80% пациентов с СД I типа [23 25], причем ее механизм связывают с частичным восстановле тественном течении заболевания носит, однако, временный характер, так как под воздействием факторов прогрессируировать со скоростью, равной скорости их гибели, и возни кает стадия развернутого клинического течения СД I типа.

Между тем, даже на этой стадии драматического сни сами гибели инсулин продуцирующих клеток, некоторые исследователи отмечают косвенные признаки их регене рации и неогенеза. Так, W. Gepts (1965) наблюдал митоти из 23 аутопсийных исследований ПЖ больных, погибших от СД I типа (27). При резекции сегмента ПЖ, выполненной у 89 летнего больного с СД I типа в связи с развитием эпи телиальной неоплазии, в свободной от опухоли ткани ПЖ тителами к инсулину и Ki 67 - маркеру пролиферативной активности клеток (28). В практике также описываются еди ничные случаи полной клинической ремиссии у больных на фоне предсуществующего длительного течения СД I типа в анамнезе, что косвенно указывает на возможность полно ценной регенерации ОЛ ПЖ (23, 29, 30]. периментальных моделях у животных: после частичной ре зекции ПЖ (31 ], при перевязке протоков ПЖ (32], введении стрептозотоцина (STZ) и аллоксана (33, 34], в условиях ги пергликемии при хронической инфузии глюкозы (35], а также на трансгенных мышах с гиперпродукцией у интерферона [36] и IL6 [37].ток и островковых клеток (ОК) в ПЖ, как у новорожденных, так и у взрослых крыс и мышей с СД I типа возникает вслед ствие следующих механизмов [38]:

- ференцировки внугриостровковых прогениторных/стволовых клеток, а также дедифференцировки соматостатин содер жащих 8 клеток);

- пролиферации эпителиальных клеток протоков и их поса также посредством созревания прогениторных/стволовых клеток, локализующихся внутри или вокруг протоков ПЖ;

- дедифференцировки ацинарных клеток и последующейнеза ОК за счет трансдифференцировки ацинарных клеток;ОЛ (рис.).

В ряде работ была подвергнута сомнению возможность участия прогениторных клеток ПЖ в процессах новообпродуцирующих клеток является основным механизмом,сы в постнатальном периоде [40 42].

Однако, более поздние исследования, проведенные S. Bonner Weir и A. Sharma (2006), доказали, что реплика ция является не единственным механизмом постнатальной ных крыс в период с 20 го по 31 й день после рождения авторы наблюдали более чем трехкратное увеличение обобразованны не в результате их собственной репликации. Также было показано, что после введения Brdll (5 bromo 2 deoxyuridine), маркера клеточной пролиферации, крысам с 90% резекцией ПЖ в первую очередь позитивная флю оресценция появлялась в области эпителиальных клеток протоков ПЖ [44].риоде путем их репликации и неогенеза, очевидно, функцио нируют у всех животных, однако они могут иметь различный вклад у разных видов. У человека компенсаторное увеличе сокой инсулиновой резистентности в ответ на ожирение, а также при беременности [19, 45]. Полагают, что в механиз играет более важную роль, чем репликация [46, 47], так как на гистологических срезах ткани ПЖ людей, страдавших ожирением, очень редко наблюдаются увеличенные в раз мерах ОЛ, при этом описываются множественные внутри дольковые выводные протоки, в составе выстилки которых были обнаружены инсулин содержащие клетки [43].

На сегодняшний день существует ряд косвенных дока зательств того, что в ПЖ взрослого человека может проистолько у больных СД I типа, но и у здоровых людей [45, 47]. В связи с этим, логично утверждать, что параллельно с про цессами разрушения эндокринных клеток в норме в ПЖ человека должны протекать процессы регенерации, направ уровне. Основные терапевтические подходы, основанные на быть направлены на стимуляцию регенерации и восстановление пула p клеток, а также на ингибирование р клеточного апоп тоза и/или коррекцию иммунных нарушений [1, 4].

В многочисленных экспериментальных работах на живот ных было показано, что некоторые белки и гастроинтестиналь ные гормоны могут выступать в качестве терапевтических vivo. Среди них выделяют: INGAP (протеин гена неогенеза островков) [48], глюкагоноподобный полипептид 1 (GLP 1) и exendin 4 (Ex 4, агонист рецептора GLP 1) [49], сочета ние бетацеллюлина (ВТС, член семейства EGF) и активина А p

мальный фактор роста) [51]. Применение INGAP, пептидного фрагмента Reg белка ПЖ, приводит к кратному увеличению ОК у мышей с СД I типа [48]. GLP 1/Ех4 обладают спо собностью повышать секрецию инсулина, стимулировать их апоптоз [49]. В опыте ВТС стимулирует пролиферацию Возможность и эффективность применения гормонов и белков для стимуляции увеличения массы р-клеток при СД I типа у человека пока мало изучена. Не так давно были опи саны результаты клинического применения INGAP при СД I типа [53]. Несмотря на то, что на фоне проводимой терапии у больных наблюдалось незначительное повышение уровня С пептида, в целом исследователи не отмечали выражен ного клинического эффекта.

Показано, что некоторые факторы роста способны сти мулировать in vitro процессы новообразования инсулин про дуцирующих клеток путем запуска процессов репликации р клеток и дифференцировки дуктальных, ацинарных и про гениторных/стволовых клеток ПЖ. Среди них выделяют: HGF (фактор роста гепатоцитов) [54], EGF (эпидермальный фак тор роста) [52], IGF 1 или 2 (инсулиноподобный фактор роста 1, 2) [55], TGF а (трансформирующий фактор рос та альфа) [56]. Несмотря на то, что результаты экспери ментальных работ демонстрируют высокую эффективность этого направления, остается много вопросов, которые ог раничивают применение рекомбинантных факторов роста споследующей клеточной трансплантации. В частности, от сутствуют четкие указания, какой фактор роста, в каких ко личествах и на каких этапах культивирования клеток ПЖ необходимо использовать. Кроме того, современные мето ды получения рекомбинатных факторов роста являются крайне дорогостоящей процедурой. шенную чувствительность к апоптозу [57, 58]. Следова тельно, несмотря на возможность активации процессов реп фоне повышенного апоптоза будет происходить постояннаяной массы. С этой точки зрения регенерационная терапия СД I типа должна быть комплексной и сочетаться с методами, направленными на ингибирование апоптоза и иммунных дизрегуляций [59]. Недавние экспериментальные исследо вания показали [60], что сочетанное применение лизофилли на - для подавления аутоиммунитета и Ех4 - для усиления NOD мышей, что проявлялось снижением гипергликемии до нормальных цифр, повышением секреции инсулина, улуч апоптоза. Согласно полученным результатам, эугликемия наблюдалась у животных в течение 5 мес. В другом иссле довании [61] мышам линии NOD с аутоиммунным СД под кожно вводили адъювант Фрейнда, после чего проводили внутривенную инфузию донорских сингенных спленоцитов. Для контроля уровня гликемии проводили трансплантацию аллогенных ОК под капсулу почки. На 40 й день после уда ления почки с графтом ОК в экспериментальной группе жи вотных с одновременным введением живых спленоцитов уровень глюкозы оставался на уровне нормогликемии, в отли чие от контрольной группы животных с введением облученных спленоцитов, у которых отмечалось нарастание гликемии. При мечательно, что при удалении почки с графтом ОК на 120 й день у животных как в контрольной, так и в эксперименталь ной группе авторы отмечали длительную реверсию СД на фоне продолжительной нормогликемии, а в ПЖ наблюдалась реге но, что живые донорские спленоциты мигрируют в область ОЛ, эпителий протоков и экзокринную часть ПЖ, где, по мнению

Вместе с тем, в аналогичных работах трех независимых групп исследователей [62 64] было доказано, что регене ровки мезенхимальных спленоцитов, как считалось ранее. Несмотря на то, что исследователям не удалось найти источ животных, ими было высказано мнение, что введение адъю ванта приводит к подавлению аутоиммунитета, направлен в почке. При этом на фоне снижения иммунной дизрегуляциипролиферации инсулин продуцирующих клеток и/или диф ференцировки прогениторных/стволовых клеток ПЖ [65].

Таким образом, имеющиеся наблюдения свидетельству ют о том, что развитие и прогрессирование СД I типа часто происходит на фоне сохраняющихся в ПЖ потенциальных ревовлеченными в процесс репаративной регенерации этих клеток.

Основные подходы к осуществлению регенерационной терапии СД I типа и его осложнений Успехи в лечении СД I типа и его осложнений, достигну тые при трансплантации аллогенных и ксеногенных ОК ПЖ, вновь подчеркнули актуальность проблем дефицита до норского материала и поиска новых источников получения доток для трансплантации.

В связи с этим, в последние годы стали активно разра батываться и изучаться новые методы регенерационной клеточной терапии, предусматривающие выделение и ex vivo предифференцировку эмбриональных и прогениторных/ стволовых клеток ПЖ. Эти клетки обладают более высоким пролиферативным потенциалом, чем зрелые дифференциро ванные ОК ПЖ и поэтому могут оказаться более пригодным материалом для получения достаточных количеств функцио р

пуповинной крови также являются материалом, пригодным для более выраженной активизации в сохранившихся клет ках ПЖ собственного резерва регенерации и пролиферации, а также коррекции аутоиммунных нарушений, лежащих в основе патогенеза СД I типа.

Трансплантация островковых клеток поджелудочной железы

Терапия СД I типа путем пересадки ОК, выделенных из ПЖ взрослых доноров, разрабатывается уже более 30 лет. По данным Международного регистра трансплантаций ОК ПЖ, за период с 1974 по 2000 г. в мире было выполнено 445 аллогенных трансплантаций ОК [66]. По сравнению с органной аллотрансплантацией ПЖ, полученные результаты

были весьма неутешительными, так как из 267 переса док аллогенных ОК, выполненных с 1990 по 1998 г., пе риод инсулиновой независимости больше 1 года наблюдался лишь у 8% больных с СДI типа [67].

В 2000 году группой A. Shapiro et al. [68] был разрабо тан протокол (the Edmonton protocol) трансплантации OK, выделенных из ПЖ двух и более трупных доноров, с приме нением щадящей схемы иммуносупрессии и без использова ния глюкокортикостероидов. Согласно данному протоколу, больным СД I типа была выполнена интрапортальная пере садка изолированных ОК в количестве 110ОО IEQ/кг. Под держивающая терапия включала малые дозы такролимуса с сиролимусом. Индукционная терапия проводилась весь 10 недельный трансплантационный период с помощью блокатора рецептора IL 2 (даклизумаб). Все 7 пациентов (100%) оставались инсулин независимыми в период на блюдения (в среднем около 14 мес.) и при этом имели нор мальный уровень гликированного гемоглобина. По данным других зарубежных клинических центров, зарегистрирован ных в Международном регистре трансплантаций ОК ПЖ, процент успешно проведенных операций с достижением инсулин независимости до 1 года составил 50 80% [69]. За последние 5 лет более чем 471 больному с СД I типа была выполнена аллотрансплантация ОК по Эдмонтонскому про токолу в 43 клиниках по всему миру [70].

Последующее наблюдение за пациентами показало постепенное снижение функции трансплантанта ОК ПЖ. У половины из успешно пролеченных больных с СД I типа пе риод инсулин независимости наблюдался до 2 лет и только у 7,5% до 5 лет [71].

Несмотря на положительные моменты в плане поддер жания инсулин независимости у больных СД I типа в течение 1 года и более, следует отметить и отрицательные стороны аллогенной трансплантации изолированных ОК ПЖ: по жизненная необходимость приема иммунодепрессантов, обладающих токсическим действием не только на почки реципиента, но и на трансплантат ОК; отсутствие необходи мого числа пригодных донорских органов, что не позволяет выполнить значительное количество таких пересадок. Отсут ствие реальной возможности проведения повторных трансплантаций, в том числе из за их высокой стоимости и возникновения нового хирургического риска, не дает шанса оценить результаты длительного влияния ретрансплантаций изолированных ОК на вторичные осложнения СД I типа [72]. В недавно выполненном клиническом исследовании [73] приведены четкие доказательства возникновения очагового стеатоза печени после интрапортальной трансплантации аллогенных ОК ПЖ.

Показано [74], что графты аллогенных ОК, применяемые у больных СД I типа согласно Эдмонтонскому протоколу, во всех случаях содержали незначительное количество донор ских экзокринных клеток и эпителиальных клеток протоков ПЖ. Начиная с 1999 г. авторами этого исследования про водилась оценка клеточного состава трансплантатов алло генных человеческих ОК, введенных 83 больным СД I типа. Наблюдалась положительная корреляция между количе ством пересаженных эпителиальных клеток протоков ПЖ и длительным метаболическим улучшением, которое отслежи вали у пациентов путем проведения глюкозо толерантного теста в течение 2 лет после аллотрансплантации ОК. Было высказано мнение, что эпителиальные дуктальные клетки (прогениторы), находящиеся в аллогенном графте ОК, иг рают важную роль в увеличении пула р клеток ПЖ, а также в длительности выживания трансплантанта ОК.

Трудности терапии СД I типа, связанные с отсутствием необходимого числа доноров, пытаются разрешить с помо щью ксеногенной трансплантации ОК ПЖ [75]. Большой и многолетний клинический опыт применения гормонально активных культур ксеногенных ОК ПЖ имеется в ФГУ НИИТ и ИО Росздрава [72, 76]. В качестве донорского материала для клинических трансплантаций используются ОК, выделен ные из ПЖ новорожденных кроликов. Согласно полученным результатам, возможность регулярного (каждые 6 12 ме сяцев) и многолетнего введения пациентам, страдающим СД I типа, культур ОК ПЖ новорожденных кроликов позволяет на многие годы отодвинуть наступление терминальных стадий диабетических ангиопатий, а также снизить гипергликемию и стабилизировать течение лабильных форм СД. По мнению авторов [77], под влиянием пересадки ксеногенных неона тальных ОК может происходить мобилизация пролифератив ного пула эпителиальных (прогениторных) клеток протоков собственной ПЖ больных СД I типа и последующая их диф натальные ОК могут продуцировать не только инсулин, но и тканеспецифические пептиды и факторы роста, которыеток в ПЖ реципиента, тем самым регулируя метаболические процессы в организме [78].

Однако будучи эффективным способом коррекции ги пергликемии и вторичных диабетических осложнений, трансплантация ксеногенных ОК ПЖ сталкивается с необ ходимостью решения ряда дополнительных проблем, таких как несовместимость пары донор реципиент, которая сокра щает сроки терапевтического эффекта, и риск для больного подвергнуться зоонозной инфекции при использование ксе ногенного материала [79].

Предварительное получение in vitro инсулин продуцирующих клеток -производных эмбриональных стволовых клеток

Известно, что эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) человека плюрипотентны и обладают высоким пролифера тивным потенциалом. Получают ЭСК из внутренней клеточной массы (эмбриобласта) донорских эмбрионов на стадии ран ней бластоцисты [80].

Ряд экспериментальных работ сообщает об успешных опытах по направленной дифференцировке человеческих и животных ЭСК in vitro в функционально активные инсулин продуцирующие клетки [81 83]. Авторы используют раз личные подходы для получения необходимой популяции ЭСК, способной дифференцироваться в инсулин продуцирующие клетки: подбор условий культивирования [83 86]; сверхэк спрессию основных транскрипционных факторов, таких как Рах 4 и Pdx 1 [87 89]; отбор клеток путем трансфекции гена резистентности к антибиотикам, запускаемого под кон тролем промотора инсулина или Nkx 6.1 [81, 90].

Было показано, что более эффективным способом по лучения инсулин продуцирующих клеток является селекция ЭСК, экспрессирующих нестин - промежуточный филамен тный маркерный белок нервных стволовых клеток [83, 84, 88, 89]. Данный метод отбора ЭСК был получен в результате модификации протокола, первоначально предназначенно го для нейрональной дифференцировки [91], который осэмбрионального развития могут происходить от общей попу ляции нестин экспрессирующих клеток предшественников. В некоторых исследованиях было показано [84, 87], что введение мышам с СД I типа островковоподобных клас теров клеток, полученных путем дифференцировки ЭСК, экспрессирующих нестин, приводило к снижению у них гипергликемии.

Позже было показано, что большинство инсулин пози тивных клеток, полученных согласно данному протоколу, не синтезировали инсулин de novo и в большинстве случаев экзогенный инсулин концентрировался клетками из куль туральной питательной среды, который затем выделялся апоптотическими клетками [92, 93]. Более того, было по казано, что полученные инсулин экспрессирующие клетки имели нейрональные характеристики. Несмотря на то, что дифференцированные клетки были инсулин позитивны ми, в них слабо определялась инсулиновая мРНК, а С пептид, побочный продукт синтеза инсулина, и секреторные гра нулы не определялись. В связи с этим стало очевидно, что иммуногистохимическое исследование только инсулина (без демонстрации С пептида) не является надежным методом определения панкреатической дифференцировки in vitro и лишь применение методов оценки de novo синтеза инсули на с использованием маркировки С пептида демонстриру р

Принимая во внимание, что в проведенных исследова ниях была показана селекция нестин позитивных прогени торных клеток, а также тот факт, что нервные стволовые клетки человека в норме способны продуцировать малые количества инсулина [94], возможно, что инсулин в остро вковоподобных кластерах клеток появлялся в результате аберрантной нейрональной дифференцировки. Тем не менее, эти клетки имеют очень малое внутриклеточное содержа ние инсулина по сравнению с нормальными инсулин про дуцирующими клетками ПЖ и характеризуются неполной нованные на селекции нестин позитивных ЭСК, являются невоспроизводимыми (в связи с тем, что полученные клет ки уже коммитированны к дальнейшей дифференцировке в нервном направлении) и не подходят для дальнейшего Более естественный подход к получению in vitro панкре этических клеток предшественников и, в конечном итоге,основан на начальной коммитированности ЭСК к дефини тивной эндодерме, имитирующей дифференцировку инсу лин продуцирующих клеток in vivo. Данный подход является сложным, так как спонтанная дифференцировка ЭСК in vitro направлена по нейроэктодермальному пути чаще, чем по мезодермальному или эндодермальному пути. С этой точки зрения, потенциально важным является недавнее сообще ние о том, что в эмбриональных тельцах возможна активация эндодермального пути дифференцировки при культивиро вании их в бессывороточных средах с добавлением активина А [95]. Было показано, что культивирование эмбриональных телец, выделенных из ЭСК, в присутствии стадийно специфи ческой концентрации монотиоглицерола в бессывороточных условиях, приводит к развитию популяции клеток, экспрес сирующей инсулин I, инсулин II, Pdx 1 и Sox 17 [эндодермаль ный маркер) [96]. Иммуногистохимическое исследование по казало низкое внутриклеточное содержание инсулина, а его de novo продукция была подтверждена визуально путем С пептид маркировки. Добавление в культуру факторов дифференцировки: активина А, никотинамида и Ех 4, при вело к увеличению количества инсулин позитивных клеток до 2,73% от общей популяции, по сравнению с контрольной культурой, где количество инсулин позитивных клеток уве личилось за тот же период менее чем на 1 %.

В настоящее время ЭСК не применяются в регенера ционной терапии СД I типа в связи с проблемами, возни кающими при их трансплантации: с тератогенностью ЭСК, необходимостью использования иммуносупрессии, но главное с нерешенностью этических и правовых проблем получения и использования ЭСК в клинике. Получение in vitro инсулин продуцирующих клеток - производных прогениторных/стволовых клеток ПЖ

На сегодняшний день существует множество прямых и непрямых доказательств существования прогениторных/ стволовых клеток в области протоков и ОК ПЖ взрослого человека.

Известно, что во время эмбриогенеза ОЛ развиваются из прогениторных/стволовых клеток, ассоциированных с дуктальным эпителием ПЖ. Следуя этой гипотезе, исследо вательская группа V. Ramiya et al. (2000) впервые обнару жила в культуре эпителиальных клеток протоков ПЖ NOD/Uf мышей полипотентные прогениторные/стволовые клетки, которые в процессе длительного культивирования образо вывали островковоподобные кластеры, характеризующиеся экспрессией глюкагона, инсулина и содержащие — р, 8 клетки [97]. Последующая трансплантация полученных функцио нальных ОК диабетическим NOD мышам приводила к дли тельному снижению у них гипергликемии и регрессу СД I типа. Несмотря на это, уровень экспрессии инсулина в опытных ОК был очень низким.

В ряде работ [98, 99] неогенез ОК также был показан в культуре ткани протоков, выделенных из ПЖ человека. Данный метод основан на культивировании остаточной фракции смешанных клеток ПЖ, полученной после выде ления ОК. На первом этапе клетки наращивали в культуре, что приводило к формированию клеточного монослоя, со держащего большей частью цитокератин (СК) 19 пози тивные эпителиальные клетки протоков, а также некоторое количество мезенхимоподобных и эндокринных клеток ПЖ. В дальнейшем полученную клеточную культуру подвер гали дифференцировке путем нанесения на ее поверхность тонкого слоя внеклеточного матрикса (Matrigel) и добавле ния бессывороточной среды с никотинамидом. Такое сочета ние условий приводило к формированию островково подоб ных трехмерных кластеров, от которых «отпочковывались» ОК. Культивированные человеческие островковые «почки» [the cultivated human islet buds CHIBs) содержали преиму щественно инсулин и глюкагон позитивные эндокринные клетки, а также СК 19 позитивные эпителиальные клетки. Несмотря на то, что уровень экспрессии гена инсулина в CHIBs составлял около 5% (по сравнению с нормальными ОК ПЖ), они были способны секретировать инсулин в зави симости от уровня глюкозы в культуре. Помимо этого CHIBs обладали ограниченным репликативным потенциалом.

В экспериментальных исследованиях in vivo показано, что комбинированное применение EGF и гастрина стимулирует пролиферацию эпителиальных клеток протоков и их диффе ренцировку в ОК [100]. Показано, что добавление данной комбинации гормона и фактора роста в культуру ОК челове ка, частично содержащую клетки экзокринных протоков, приклеточной популяции и ее пролиферации в данном экспе рименте подтвердил, что увеличение числа инсулин про дуцирующих клеток в культуре возникало в результате дифференцировки клеток протоков чаще, чем путем реп р

эндокринной дифференцировки также может быть акти вирован in vitro в клетках протоков ПЖ человека путем эктопической экспрессии нейрогенина 3 (Ngn 3) - одного из главных транскрипционных факторов развития эндокрин ной части ПЖ [101 ].

В настоящее время исследования, касающиеся культи вирования клеток экзокринных протоков ПЖ человека с цев связи с тем, что имеется множество вопросов, требующих предварительного решения. Так например, неизвестно, существуют ли в ткани экзокринных протоков ПЖ взросло го человека истинные прогениторные/стволовые клетки, способные дифференцироваться в эндокринные клетки и способны ли эпителиальные клетки протоков утрачивать свойческие маркеры, по которым возможно идентифицировать прогениторные/стволовые клетки ПЖ, пока не установле ны. По мнению R. Gao et al. (2003), в качестве возможных прогениторных/стволовых клеток ПЖ могут выступать СК 19 позитивные эпителиальные клетки экзокринных протоков, а использование бессывороточной среды, нико тинамида и внеклеточного матрикса должно быть обяза тельным компонентом при культивировании клеток для их дальнейшей дифференцировки (99). В другом исследова нии A. Suzuki et al. (2004), используя методы проточной ци тометрии и клонального анализа, показали, что возможные кандидаты на роль прогениторных/стволовых клеток ПЖ не несут маркеров гемопоэтических клеток, таких как CD45, TER119, с kit и Flk 1 (102). Но они имеют специфический маркер с met - рецептор для фактора роста гепатоцитов (HGF). Тем не менее, идентификация и изоляция прогени торных/стволовых клеток ПЖ остается пока не изученной.

Согласно некоторым данным, прогениторные/стволовые клетки ПЖ могут находиться в ОК ПЖ. Согласно ряду экс периментальных работ, в качестве возможных кандидатов могут рассматриваться нестин позитивные [103], а также малые клетки [104].

Исследовательская группа Н. Zulewski et al. (2001) вы делили нестин позитивные клетки из крысиных и челове ческих ОК ПЖ, которые могли пролиферировать in vitro и дифференцироваться во множественные клеточные линии, экспрессирующие маркеры клеток экзокринной и эндокрин ной части ПЖ, а также клеток печени [103]. Согласно мнению авторов, нестин позитивные мультипотентные прогениторные клетки могут участвовать в процессах неогенеза эндокрин ных клеток ПЖ. Также показано, что нестин позитивные клетки предшественники, выделенные из ПЖ взрослой мыши, способны давать начало линиям клеток ПЖ и нервной ткани [105]. В противоположность данным исследованиям, детально проведенный анализ ранних стадий развития че ловеческой ПЖ показал, что эндокринные клетки предше ственники не экспрессируют нестин [106]. В ряде экспери ментов [107,108], проведенных на трансгенных мышах с применением генетической конструкции, отслеживающей клеточное происхождение, было показано, что нестин по зитивные прогениторные клетки не участвуют в развитии эндокринных клеток в ОЛ. Известно, что в ПЖ нестин экспрессируется в клетках протоков и ацинусов, в ОК, звез дчатых клетках, а также в эндотелии сосудов. С этой точки зрения нестин не является подходящим маркером для про гениторных/стволовых клеток ПЖ. Между тем, вопрос о том, можно ли считать нестин маркером прогениторных/ство ловых клеток ПЖ, остается по сей день предметом многих дискуссий.

М. Petropavlovskaya et al. (2002) описали в культуре ОК ПЖ человека и лошадей новый клеточный тип, названный ими «малыми» клетками [104]. Эти клетки обладали спо собностью формировать малые кластеры и при иммуно гистохимическом исследовании позитивно окрашивались антителами на эндокринные гормоны ПЖ и Pdx 1, но были негативными при окраске на СК 19 и нестин. Несмотря на то, что в работе не было указаний на пролиферативный и дифференцировочный потенциал «малых» клеток, скорее всего, их способность к росту и пролиферации недостаточ на для необходимой клеточной экспансии in vitro.

В ряде экспериментальных работ в качестве одного из воз пластичность экзокринных и эндокринных клеток ткани ПЖ. Ацинарные клетки не рассматриваются в качестве стволо вых/прогениторных клеток ПЖ. Однако, как показано на модели перевязки протоков ПЖ у крыс, ацинарные клетки обладают способностью к дифференцировке в эпителиаль ные клетки, формирующие дуктально подобные структуры,[109]. Исследовательская группа I. Rooman et al. (2000), также наблюдала прямую ацинарно дуктальную трансдиф ференцировку in vitro, в результате чего в процессе культиви рования ацинарные клетки теряли свой фенотип и начинали экспрессировать СК 7, СК 20, Flk 1, а также Pdx 1 - мар керы эпителиальных клеток протоков ПЖ [110]. Эти дан ные позволяют предположить, что эпителиальные клетки, полученные в процессе трансдифференцировки ацинарных клеток, могут рассматриваться в качестве возможных про гениторных/стволовых клеток ПЖ. Исследования К. Song et al. (2004) подтвердили эти результаты [111]. Более того, при культивировании ацинарных клеток ПЖ крыс ими были обнаружены инсулин продуцирующие клетки, коэкспресси рующие СК.

М. Gershengorn et al. (2004) выдвинули концепцию эпи телиально мезенхимальной трансформации в качестветок в ПЖ человека [112]. Как показано этими авторами, человеческие ОК в процессе их культивирования могут де дифференцироваться путем эпителиально мезенхимальной трансформации в фибробластоподобные клетки с мезенхи мальным фенотипом, которые в процессе экспансии спо собны к последующей редифференцировке в островково подобные структуры, представленные эпителиальными клетками, экспрессирующими инсулин.

В настоящее время основным препятствием клинического применения взрослых прогениторных/стволовых клеток ПЖ является малочисленность их популяции в ткани, трудность выделения, а также отсутствие эффективных методов вы ращивания в культуре в связи с их низким пролиферативным потенциалом.

Трансплантация клеток костного мозга и пуповинной крови

В последние годы появилось большое количество экс периментальных работ, в которых было изучено влияние трансплантации мезенхимальных стволовых/ прогенитор ных клеток костного мозга (КМ) на процессы регенерации довались механизмы регенераторного действия клеток КМ (ККМ): обсуждалась возможность трансдифференцировкиОЛ, а также способность ККМ запускать процессы регене васкулогенеза в ПЖ, наряду с продукцией этими клетками регуляторных пептидов (ростовых факторов, цитокинов) -регуляторов морфогенеза органов и тканей.

Так, A. lanus et al. (2003) на модели аутоиммунного СД у мышей самок трансплантировали мезенхимальные ство ловые/прогениторные ККМ от мышей самцов (доноров), экспрессирующих GFP (green fluorescent protein), причем GFP белок экспрессировался в ККМ доноров самцов толь ко при условии активации в них транскрипции гена инсули на [113]. Используя метод FACS (fluorescence activated cells sorter) и цитогенетический метод FISH (fluorescence in situ hybridization), через 4 6 недель после трансплантации до норского КМ авторы обнаружили в ОК мышей самок (реци пиентов) GFP^ клетки с Y позитивной хромосомой, которые составляли 1,7 3% от общего числа эндокринных клеток ПЖ. Кроме того, выявленные в пределах ОК мышей реципиентов GFP* клетки экспрессировали инсулин, GLUT 2 и ряд дру гих генетических маркеров, характерных для в клеток ПЖ. В культуральных условиях in vitro изолированные GFP* клетки донорского происхождения секретировали инсулин в ответ на физиологическую стимуляцию глюкозой. Авторы по лагали, что в этих опытах ими была доказана способность мезенхимальных стволовых/ прогениторных ККМ к транс Однако в ряде других исследований [114 116] данные A. lanus et al. (2003) не были подтверждены. Авторами этих работ было высказано предположение, что стволовые/ прогениторные ККМ участвуют в процессах регенерации инсулин продуцирующие клетки, а преимущественно пуго органа.

В ряде исследований in vitro было показано, что мезен химальные стромальные клетки (МОК) (117], выделенные согласно их пластик адгезивным свойствам из КМ или жи ровой ткани, обладают способностью к трансдифференци ровке в инсулин продуцирующие клетки при культивирова нии в соответствующих средах (118 120]. Так, L. Chen et al. (2004), нашли, что полученная культура МСК КМ обладала глюкозо зависимой секрецией инсулина in vitro, а при ее трансплантации крысам с STZ СД I типа происходило сни жение гипергликемии у животных (118]. При этом авторы наблюдали экспрессию нестина на одной из промежуточ ных стадий дифференцировки ККМ. В другой эксперимен тальной работе человеческие МСК КМ трансфецировали генами Foxa2, НЬ9 и Pdx1, ранними транскрипционными факторами в клеток, с помощью ретровирусного вектора и кокультивировали с ОК. Такая процедура также способство вала дифференцировке МСК в инсулин продуцирующие клетки (120]. Несмотря на описанные наблюдения, вопрос о том, является ли трансдифференцировка МСК в функци ональные инсулин продуцирующие клетки нормальным и физиологическим явлением в условиях живого организма, остается дискуссионным, так как к настоящему времени пластичность МСК продемонстрирована лишь в условиях эксперимента. Доказательства возможности слияния кле ток разных фенотипов in vivo свидетельствуют против кон цепции пластичности мезенхимальных стволовых/прогени торных ККМ и ставят под сомнение терапевтическую стратегию применения ККМ, основанную на этой концеп ции (121].

Известно, что в основе СД I типа лежит глубокая дизре гуляция гуморального и клеточного иммунитета на фоне прогрессирующего аутоиммунного процесса. В условиях на блюдаемого иммунного дисбаланса возникает нарушение информационного межклеточного взаимодействия и угне тение воспринимающей, индукционной и пролиферативной активности прогениторных/стволовых клеток ПЖ, что про является торможением миграционной активности и нару шением запуска процессов восстановительной регенера р

С этой точки зрения, использование ККМ для коррекции СД I типа и его осложнений является перспективным и обо снованным методом. Улучшение эндокринной функции и р

введения стволовых/прогениторных ККМ ряд авторов свя зывают с секрецией ими противовоспалительных и имму номодулирующих цитокинов с антиапоптотическим и анги огенетическим действием, обладающих адаптивными и регуляторными эффектами на различные функциональные системы, в том числе и на иммунную систему - важнейшую интегративную систему организма. Известно, что стволовые/ прогениторные ККМ, будучи клетками иммунной системы, секретируют in vitro обширный спектр регуляторных пепти дов - цитокинов, хемокинов и факторов роста, с помощью которых регулируется репаративный и физиологический морфогенез органов и тканей (122].

Y. Izumida et al. (2005) показали, что при транспланта ции ККМ происходит активация с met/HGF сигнального(123]. Начиная с 7х суток после изотрансплантации све жевыделенных мононуклеарных ККМ крысам с STZ СД I типа, было отмечено более чем 8 кратное увеличение со держания HGF в сыворотке крови животных по сравнению с группой контроля на протяжение всего эксперимента. На фоне трансплантации ККМ у диабетических крыс наблюда лось увеличение концентрации инсулина в плазме крови, снижение гипергликемии, а также увеличение числа инсулин продуцирующих клеток в ПЖ. Используя метод мечения ККМ витальным красителем РКН 26 и последующее иммуноги стохимическое исследование криосрезов ПЖ с применением DAPI метода окраски ядер ККМ и антител к HGF, с met, ин сулину, BrdU, Pdx 1, СК 20, было показано, что все новооб р

ных протоков ПЖ. Основываясь на полученных результатах, авторы предположили, что ККМ могут играть роль в синтезе эндогенного HGF в организме и способны путем прямого взаимодействия с гепатоцитами и/или паракринного вза имодействия с помощью неизвестных пока факторов по вышать секрецию HGF, который способен стимулировать дифференцировку с met* эпителиальных клеток протоков ПЖ в инсулин продуцирующие клетки. Известно, что взаи модействие между рецептором с met и HGF, которое проис ходит в организме опосредованно путем обмена сигналами между мезенхимальными (124] и эпителиальными клетка ми, играет важную роль на эмбриональном этапе развития ПЖ [125,126].

В работе М. Banerjee et al. (2005) была показана прямая зависимость между эффектом от проводимой клеточной терапии и кратностью введения ККМ [127]. Изотрансплан тацию клеток свежевыделенного нефракционированного КМ проводили облученным мышам линии Swiss albino с мо делью STZ СД I типа путем однократного или многократного (минимум - трехкратно) внутривенного введения в хвостовую вену с регулярным интервалом в 6 дней. Было установлено, что на фоне многократного введения ККМ в течение одного месяца происходило постепенное и достоверное снижение показателей высокого уровня глюкозы в крови до нормогли кемии, которая сохранялась в течение всего эксперимента (длительностью до 1 месяца), в отличие от группы животных с однократным введением ККМ, где отмечалось незначи тельное снижение гипергликемии. Нормализация показа телей гликемии у диабетических мышей с многократным введением ККМ была подтверждена положительными ре зультатами при проведении глюкозо толерантного теста. На гистологических срезах ПЖ этих мышей было обнаружено увеличение количества новообразованных ОК с малым ди аметром (менее 50 мкм по сравнению с нормальными ОК), которые локализовались в области протоков и ацинусов ПЖ.

Аналогичные результаты были получены группой R. Lee et al. (2006) [128]. Культивированные в течение 7 9 дней до 70% монослоя человеческие мультипотентные МСК КМ вводились двукратно с интервалом 7 дней в полость левого желудочка иммунодефицитным NOD/scid мышам с моде лью STZ СД I типа. Начиная с 14 го дня от момента первого введения МСК, в группе диабетических животных с транс плантацией ККМ происходило достоверное снижение гипер гликемии и полиурии, а также повышение уровня мышиного инсулина, при этом человеческий инсулин в образцах кро ви не определялся. Результаты, полученные под контролем молекулярно генетического метода - RT PCR, позволили заключить, что около 3% введенных МСК обнаруживаются в ткани ПЖ и 11% в ткани почек диабетических мышей. На срезах ткани ПЖ мышей с трансплантацией МСК, в отличие от группы диабетического контроля, авторы наблю дали достоверное увеличение количества новообразован ных ОК с высокой иммунореактивностью инсулина, которые визуально «отпочковывались» от эпителия протоков ПЖ. На фоне введения МСК в ткани почек мышей с СД I типа было отмечено улучшение морфологии гломерулярного аппара та, уменьшение мезангиального утолщения и инфильтрации ткани макрофагами. При иммуногистохимическом исследо вании криосрезов ткани почек было показано, что часть МСК экспрессировали CD31 (platelet endothelial cell adhesion molecule 1 (PECAM 1)) и имели морфологию эндотелиаль ных клеток.

Имеются все основания признать, что ККМ участвуют не только в регенерации паренхимы органов, но также в реге нерации и новообразовании сосудов. С этими эффекта ми связывают прежде всего активацию гемангиобластов, которые, как полагают, представляют самостоятельную популяцию ККМ, а также активацию мезенхимальных про гениторных клеток, которые содержатся как во фракции МСК КМ (128], так и во фракции гемопоэтических ККМ (129], и могут дифференцироваться в эндотелиоциты.

У больных СД I типа в условиях повышенного апоптоза клеток, на фоне окислительного стресса и других многочис ленных метаболических нарушений, количество циркулиру ющих в крови предшественников эндотелиальных клеток (ПЭК) резко снижено, что проявляется снижением процессов неоваскуляризации в организме. Дисфункция ПЭК приво дит к снижению сосудистого регенеративного потенциала, замедляет регенерацию ОЛ и способствует развитию сосу дистых осложнений при СД I типа (130].

Показано, что клетки мононуклеарной фракции КМ мо гут мигрировать в ткань ПЖ в ответ на ее повреждение и стимулировать неоангиогенез, тем самым запуская проновлено (129], что при внутривенном введении с kit (CD117) фракции мононуклеарных ККМ от GFP трансген ных мышей, иммунодефицитным NOD/scid мышам с моде лью STZ СД I типа, происходило снижение гипергликемии и повышение уровня инсулина в крови. На гистологических срезах ткани ПЖ мышей реципиентов авторы наблюдалиОК, где также были найдены GFP^ ККМ мышей доноров, причем 2,5% этих клеток позитивно окрашивались анти телами к инсулину, однако не экспрессировали Pdx 1 -р

ференцировки в инсулин продуцирующие клетки. Одновре менно было показано, что донорские ККМ при введении в организм мышей реципиентов способны дифференциро ваться в эндотелиальные клетки (ЭК) ПЖ. Процесс диф ференцировки в ЭК подтверждался позитивным иммуно гистохимическим окрашиванием донорских GFP^ ККМ на эндотелиальный белок РЕСАМ 1 (CD31). Несмотря на то, что в данной работе не были установлены возможные исческих мышей реципиентов, авторами было высказано предположение, что ККМ способны мигрировать в область поврежденных ОК ПЖ, где они и дифференцируются в ЭК. В свою очередь новообразованные ЭК костномозгового происхождения начинают стимулировать пролиферацию локальных стволовых/прогениторных клеток ПЖ посред ством выделения ими трофических факторов или благодаря какому то другому механизму, индуцирующему дифферен рв период эмбрионального развития ПЖ (132].

Аналогичные результаты также были получены группой V. Mathews et al. (2004), которые на модели STZ СД I типа у мышей проводили трансплантацию мононуклеарной фрак ции сингенного КМ, полученного от GFP трансгенных до норов (131]. Непосредственно перед трансплантацией ККМ мышам реципиентам с СД I типа вживляли подкожно мик рокапсулы с инсулином для снижения изначально высокого уровня гликемии и последующего поддержания ее на суб нормальном уровне. После трансплантации донорские GFP* ККМ, экспрессирующие CD45^ и vWF^ (von Willebrand factor), обнаруживали повсеместно в ОК ПЖ мышей реци пиентов. В то время как общее количество донорских GFP^ ККМ постепенно снижалось в ткани ПЖ, количество эндоте лиальных клеток собственного и донорского происхождения увеличивалось в зависимости от степени повреждения ОК. Наблюдались признаки неоангиогенеза в ткани ПЖ. В от личие от результатов, полученных D. Hess et al. (2003), ав торы в данном исследовании не смогли показать положи тельное влияние введения ККМ на течение гликемии у мышей реципиентов с СД I типа, т.к. при удалении микро капсул с инсулином, показатели глюкозы в крови возвра щались на изначально высокий уровень (129]. Возможно, что отсутствие репаративной регенерации в клеток в дан ной работе могло быть связанно с изначальной коррекцией высокого уровня гликемии у мышей с СД I типа путем вве дения в организм экзогенного инсулина (микрокапсул), что в итоге могло привести к подавлению сигналов, направлен ных на активацию процессов пролиферации и неогенеза инсулин продуцирующих клеток ПЖ.

Основываясь на данных экспериментальных исследо ваний, несколько групп в разных странах приступили к кли ническим испытаниям метода клеточной терапии СД I типа у человека с использованием ККМ. Показано, что систем ное [133], а также местное (артериальным катетером в чревный ствол) [134] введение аутогенных ККМ приводит к улучшению функции ПЖ, коррекции метаболических на рушений, снижению суточных доз экзогенного инсулина,тел к инсулину, аутоантител к глутаматдекарбоксилазе (GAD), повышению резистентности к сахарной нагрузке, а также увеличению синтеза С пептида, что косвенно ука

ПЖ у больных СД I типа.

Активное изучение и возможность применения стволо вых/прогениторных клеток пуповинной крови (ПК) челове ка в клеточной терапии СД I типа обусловлены тем, что этот источник рассматривается как альтернатива КМ.

Показано [135], что на фоне ксенотрансплантации кле ток ПК человека значительно снижалась вероятность и ин тенсивность развития аутоиммунного инсулина в ОК ПЖ NOD мышей с моделью аутоиммунного СД. Оказалось, что поддержание нормогликемии, выживаемость животных иток ПЖ находятся в прямой зависимости от дозы вводимых клеток. Так, при введении мышам с СД I типа 200 млн моно нуклеарных клеток ПК человека положительные эффекты были выражены более значимо, чем при трансплантации 100 млн клеток.

Полагая, что стволовые/прогениторные клетки ПК способны к миграции в область поврежденных ОК ПЖ и что коррекция аутоиммунных процессов активирует запилотные клинические испытания метода трансплантации аутогенных клеток ПК у 9 пациентов с СД I типа. У этих больных был достигнут положительный результат [136]

Заключение

Анализ современных концепций развития СД I типа по казывает, что стойкая инсулиновая недостаточность при СД I типа является результатом неэффективной репаративной регенерации поврежденных ОЛ. Недостаточность репара тивных процессов в ОЛ в значительной мере обусловлена и поддерживается глубокими нарушениями функций иммун ной системы (аутоиммунный процесс), которая более других интегративных систем организма ответственна за регуля цию морфогенеза и поддержание структурного гомеостаза.

Клеточная терапия - ОК ПЖ или ККМ и ПК позволяет в наиболее полном объеме обеспечить доставку в организм дефицитных пептидов и факторов межклеточного взаи модействия, которые способствуют активизации репаратив ных процессов в ОЛ и восстановлению их функции. При трансплантации ОК в большей степени восполняется де фицит тканеспецифических регуляторных пептидов реге нерации ОЛ. При трансплантации ККМ и ПК регенерация ОЛ и сосудов достигается через устранение дизрегуляции иммунной системы и восстановление адаптационных функ ций всех интегративных систем организма, которые повыи нормализуют собственную инсулин продуцирующую функцию ПЖ.

Подняться вверх сайта