Поиск Кабинет

Возможные направления дифференцировки мононуклеаров пуповинной крови человека в регенерирующей печени крыс

Гены & Клетки: Том VIII, №3, 2013 год, стр: 95-100

 

Авторы

Андреева Д.И., Газизов И.М., Йылмаз Т.С., Калигин М.С., Гумерова А.А., Киясов А.П.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Известно, что гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) пуповинной крови человека способны дифференцировать ся в гепатоциты. Эта способность может быть широко использована в лечении различных заболеваний печени. Однако трансплантация аутогенных стволовых клеток в слу чае наследственных заболеваний печени весьма ограниче на. В таком случае необходима разработка методов гене тической модификации, и при этом необходимо выяснить, влияет ли генетическая модификация на свойства ГСК. Белым беспородным крысам-самцам проводили опера цию частичной гепатэктомии и интраоперационно внутрисе лезеночно вводили мононуклеары пуповинной крови чело века, трансфицированные геном зелёного флуоресцентного белка (GFP). Парафиновые срезы печени окрашивали с ан тителами к рецептору фактора стволовых клеток, антигену лейкоцитов человека, α-гладкомышечному актину, усилен ному GFP, цитокератину 19, специфическому антигену ге патоцитов человека, α-фетопротеину. Также было проведено двойное иммуногистохимическое окрашивание для выявле ния возможности экспрессии в одной клетке рецептора фак тора стволовых клеток и десмина, GFP и цитокератина 19.

Было показано, что трансплантированные в селезенку мононуклеары пуповинной крови человека, трансфициро ванные геном gfp, мигрируют в печень крыс после частич ной гепатэктомии и приобретают фенотип гепатоцитов, си нусоидных клеток и холангиоцитов. При этом не происходит дифференцировка трансплантированных клеток в миофи бробласты. Гепатобласты и гепатоциты, обнаруженные в пе чени крыс после трансплантации, экспрессировали специ фический антиген гепатоцитов человека и α-фетопротеин, а значит являлись функционально активными клетками.

Трансплантация печени – единственный эффек тивный метод лечения в случаях, когда внутритка невые источники регенерации органа исчерпаны[1]. Однако доступность донорских органов не соответствует реальной потребности, к тому же существует риск отторжения трансплантированного органа и неизбежная необходимость пожизненного приёма иммуносупрессивных препаратов. В качестве альтернативы трансплантации печени могут быть разработаны и внедрены методы «регенеративной медицины» и, в частности, трансплантация стволовых/прогениторных клеток. Возможность образования гепатоцитов из стволовых клеток костного мозга впервые была показана в работе B.E. Petersen и соавт. еще в 1999 г.[2]. В то же время миграция, возможности дифференцировки клеток пуповинной крови (ПК) и их участие в восстановлении печени ещё не исследованы в полной мере. Безусловно, именно ПК может стать перспективным источником стволовых клеток для трансплантации, так как обладает такими преимуществами, как абсолютно нетравматичный и безопасный как для матери, так и для ребенка способ выделения клеток, а также высокая способность клеток к пролиферации и низкая иммуногенность[3].

Механизм образования гепатоцитов из гемопоэ тических стволовых клеток (ГСК) до сих пор являет ся предметом бурного обсуждения. Предполагается, что возможна как прямая дифференцировка стволо вых клеток[4], так и слияние зрелых клеток мие лоидной линии с резидентными гепатоцитами[5]. В результате слияния образуются гибридные клетки, которые экспрессируют специфические печёноч ные маркеры, но до конца не ясно, обладают ли они полным спектром функциональной активности гепа тоцитов.

В регенеративной медицине возможно приме нение как алло-, так и аутогенных клеток для ле чения ряда заболеваний печени. Однако существуют болезни печени, например наследственные метабо лические нарушения, такие как болезнь Вильсона – Коновалова, наследственные гликогенозы, в отно шении которых применение аутогенных стволовых клеток очень ограничено. В таком случае весьма перспективным направлением станет разработка методов генетической модификации стволовых и прогениторных клеток и трансплантация таким боль ным генетически «вылеченных» клеток. В ходе раз работки методов трансплантации генетически моди фицированных клеток, необходимо выяснить, влияет ли генетическая модификация на свойства ГСК и их способность мигрировать в орган-мишень и диффе ренцироваться в клетки печени.

Материал и методы

Пуповинная кровь была забрана специально об ученным персоналом роддома, по инструкции Банка стволовых клеток Казанского медицинского универ ситета (лицензия №99-01-001961 от 13.10.2005), после подписания матерями информированного со гласия. Выделение фракции мононуклеаров из пупо винной крови (МПК) человека проводили методом седиментации в градиенте плотности фиколла[6]. Подсчет количества и определение жизнеспособ ности ядросодержащих клеток осуществляли путем окрашивания трипановым синим. Во всех получен ных образцах количество жизнеспособных клеток было не менее 97%.

Генетическую модификацию мононуклеаров ПК человека проводили методом электропорации[7]. В качестве трейсерной метки был использован уси ленный зеленый флуоресцентный белок – ЕGFP. По лученные результаты выявили наилучший результат электропорации клеток пуповинной крови человека при вольтаже 300 В, ёмкости 1500 мкФ.

Эксперимент выполнен на крысах (n = 30). Опе рация частичной гепатэктомии (ЧГ) проведена по методике, описанной G.M. Higgins и R.M. Anderson [8]. Животным 1 группы (n = 9) проводили классиче скую гепатэктомию без последующей транспланта ции клеток. Крысам 2 группы (n = 9) после удаления долей печени в селезенку вводили 3 млн. МПК че ловека в 500 мкл среды RPMI. Животным 3 груп пы (n = 9) после ЧГ в селезенку вводили по 6×105 МПК человека, трансфицированных геном ЕGFP, в 500 мкл среды RPMI. Контрольной группе животных (n = 3) после ЧГ в селезенку вводили 500 мкл фи зиологического раствора. Объем удаленных долей составлял 68% от общей массы печени.

Животных выводили из эксперимента под эфир ным наркозом декапитацией через 2, 5, 7 сут. после операции. Ткань печени фиксировали в формалине и заливали в парафин по стандартной методике. Окрашивание проводили с аhttp://www.img.genescells.ru/files/article/0764bjerty435yn98cbt23tvy548435cmxr39uba64v84o3vijb/2013-8-3/iutca2bgs5g7.pdfнтителами к рецеп тору фактора стволовых клеток С-kit (клон T595, Novocastra, Великобритания), антигену лейкоци тов человека HLA-ABC (клон W6/32, Dako, Дания), a-гладкомышечному актину, a-ГМА (клон 1A4, DAKO, Дания), усиленному зеленому флуоресцентному белку, EGFP (клон GSN24, Sigma, США), цитокера тину 19 (клон BA17, Dako, Дания), специфическому антигену гепатоцитов человека, HSA (клон OCH1E5, Novokastra, Великобритания), α-фетопротеину, AFP (клон С3, Dako, Дания). Также было проведено двой ное иммуногистохимическое окрашивание для выяв ления экспрессии С-kit и десмина (клон D33, DAKO, Дания), EGFP и цитокератина 19.

Результаты

Многие исследователи, занимающиеся вопросом регенерации печени, считают, что активации стволо вых клеток после ЧГ не происходит[9]. Однако ис следование срезов печени крыс после классической ЧГ на экспрессию рецептора к фактору стволовых клеток C-kit, который считается наиболее удачным маркером для выявления стволовых клеток, пока зало, что через 2 сут. после операции экспрессия С-kit наблюдалась в синусоидных клетках, достигала максимума к 5 сут. и составляла 8-10 клеток в поле зрения (рис. 1А). Экспрессию C-kit, которая увели чивалась вплоть до 5 сут. и составляла 4–5 клеток в поле зрения, наблюдали и в гепатоцитах (рис. 1Б). При этом двойное иммуногистохимическое окраши вание срезов печени животных экспериментальных групп с антителами к С-kit и десмину показало, что на всех сроках после ЧГ экспрессирующие С-kit си нусоидные клетки относятся к популяции перисинусоидальных клеток (рис. 1В).

В образцах печени крыс после ЧГ и транспланта ции мононуклеаров ПК человека С-kit экспрессиро вался гепатоцитами и мелкими клетками с округлым ядром и узким ободком цитоплазмы уже на ранних экспериментальных сроках (рис. 2). Максимальное количество С-kit+-гепатоцитов, которое составляло 4–5 клеток в поле зрения, наблюдали через 5 сут. после операции, на 7 сут. происходило постепен ное снижение числа этих клеток. При этом С-kit+ синусоидных клеток мы практически не наблюдали. Очевидно, что трансплантация МПК после ЧГ ме няет характер активации стволового компартмента. Возможно, что в случае трансплантации МПК нет необходимости в паракринных влияниях со стороны перисинусоидальных клеток печени для активации регенераторного ответа гепатоцитов. Достижение печенью массы, необходимой для выполнения ее функции как органа, обеспечивается в этом случае не перисинусоидальными клетками, а трансплантированными МПК человека. Кроме того, МПК человека, мигрировавшие в регенерирующую печень крысы, могут сами дифференцироваться в гепатоциты. Маркер клеток человека HLA-ABC, который является антигеном главного комплекса гистосовместимости, определялся в синусоидных клетках (рис. 3А) и гепатоцитах (рис. 3Б) уже на 2 сут. эксперимента. На 5 сут. нами были обнаружены также небольшие HLA-позитивные клетки, находящиеся в структуре портальных трактов, вблизи желчных протоков. Более того, на 7 сут. HLA-ABC позитивные холангиоциты находились в структуре мелких новообразующихся протоков (рис. 3В). Обнаруженные нами клетки, экспрессирующие HLA-ABC и расположенные в синусоидах печени, имели веретенообразную форму и напоминали перисинусоидальные клетки. Ранее было показано образование миофибробластов после трансплантации клеток костного мозга, на основании чего авторами был сделан вывод о том, что такая трансплантация способствует развитию фиброза[10]. В результате нашего исследования экспрессия маркера миофибробластов α-SMA была обнаружена только в гладкомышечных клетках стенки сосудов на всех экспериментальных сроках, но не в синусоидах печени, что свидетельствует о безопасности проведенной трансплантации с точки зрения риска развития фиброза печени.

Эффективность трансфекции определяли по экс прессии трэйсерного гена – ЕGFP. При исследова нии образцов печени экспериментальной группы 3 методом флуоресцентной микроскопии уже на 2 сут. после операции было выявлено интенсивное све чение EGFP (рис. 4). На всех последующих иссле дованных сроках, т.е. на 5 и 7 сут., интенсивность свечения EGFP в печени не снижалась. По данным иммуногистохимического исследования в печени крыс после ЧГ и трансплантации МПК человека на всех исследованных сроках также были обнаружены ЕGFP+-клетки. На 2 сут. эти клетки имели фенотип гепатобластов и гепатоцитов и располагались вокруг портальных трактов (рис. 5А). В это же время были обнаружены и ЕGFP+-синусоидные клетки (рис. 5Б). Кроме того, на 5 сут. эксперимента в печени крыс после ЧГ и трансплантации генетически модифици рованных МПК человека появлялись холангиоциты, экспрессирующие ЕGFP (рис. 5В). Эти клетки на ходились в структуре мелких новообразующихся протоков. Полученные результаты распределения генетически модифицированных клеток человека в регенерирующей печени крыс напрямую коррелиру ют с результатами иммуногистохимического иссле дования с антителами к HLA-ABC.

Одними из открытых вопросов до сих пор оста ются механизмы восстановления поврежденного органа трансплантированными столовыми клетками: происходит это путем слияния или прямой трансдиф ференцировки? Обнаруженные нами уже на вторые сутки EGFP+-гепатобласты, находящиеся вокруг пор тальных трактов и желчных протоков, навели нас на мысль о том, что эти гепатобласты являются проме жуточной формой в дифференцировке гепатоцитов и холангиоцитов из ГСК. На более поздних сроках количество EGFP+-гепатобластов уменьшалось, но при этом увеличивалось число клеток с фенотипом гепатоцитов и появлялись EGFP+-холангиоциты. При этом были выявлены не только СК19+-холангиоциты (рис. 6А), но и мелкие СК19+-клетки с фенотипом гепатобластов (рис. 6Б). Известно, что зрелые ге патоциты не экспрессируют СК19, но была показана его экспрессия гепатобластами в ходе внутриутроб ного развития[11].

Более того, двойное окрашивание с антителами к СК19 и EGFP выявило холангиоциты и единичные гепатобласты (рис. 6В), экспрессирующие оба этих маркера, что свидетельствует о том, что окрашенные клетки являются потомками трансплантированных ГСК пуповинной крови человека. По-видимому, об наруженные нами СК19+/EGFP+-гепатобласты диф ференцируются в зрелые гепатоциты и холангиоциты и восстанавливают поврежденную структуру печени, повторяя процессы, происходящие в ходе внутриу тробного развития печени. В некоторых исследовани ях уже была продемонстрирована дифференцировка клеток костного мозга в гепатоциты через промежуточную форму незрелого гепатобласта[12].

Полученные нами данные не оставляют сомнений, что генетически модифицированные МПК человека, так же как и нативные клетки, мигрируют в печень крысы и дифференцируются в гепатобласты, гепато циты, синусоидные клетки и холангиоциты. Открытым остается вопрос, являются ли эти клетки функцио нально активными или они лишь фенотипически по добны тем или иным клеткам печени крыс? Установ ленная нами экспрессия α-фетопротеина человека (показателя секреторной активности гепатобластов) (рис. 7) и специфического антигена гепатоцитов че ловека (HSA) (рис. 8) в печени крыс эксперименталь ных групп 2 и 3 не только подтверждает их проис хождение из трансплантированных клеток пуповинной крови человека, но и говорит о зрелости этих клеток и сохранении их функциональной активности.

Таким образом, трансплантация генетически модифицированных МПК человека может стать перспективным методом лечения болезней пече ни, связанных с нарушением экспрессии генов, та ких как болезнь Вильсона – Коновалова, дефицит α1-антитрипсина, гемохроматоз, гликогенозы и т.д.

Подняться вверх сайта