Поиск Кабинет

Возможные молекулярные механизмы функционирования плазмидных конструкций, содержащих ген VEGF

Гены & Клетки: Том VI, №3, 2011 год, стр.: 24-28

 

Авторы

Григорян А.С., Шевченко К.Г.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Гентерапевтические подходы к восстановлению перфузии ишемизированной ткани считаются весьма перспективными, однако до настоящего времени неизвестны все молекулярные механизмы, позволяющие плазмиде со встроенным терапевтическим геном проникнуть в клеткумишень, и лежащие в основе положительных клинических эффектов терапии. В данном обзоре обсуждаются возможные молекулярные механизмы проникновения плазмидных конструкций, несущих ген ангиогенного фактора VEGF (vascular endothelial growth factor), в цитоплазму и ядро клетки-мишени, а также предлагаются способы повышения эффективности трансфекции клеток и экспрессии интересующего гена.

Введение. Гентерапевтические подходы к восстановлению перфузии ишемизированных тканей.

Клинический опыт

Генная терапия сердечно-сосудистых заболеваний в настоящее время одно из наиболее востребованных направлений исследований в области разработки новых систем лечения. Прежде всего это обусловлено большой социальной значимостью и широким распространением этой группы заболеваний. Как и в случае с онкологическими заболеваниями, генная терапия зачастую оказывается единственной альтернативой хирургическому вмешательству и (или) средством, существенно улучшающим результаты хирургического лечения. Различные клинико-анатомические формы атеросклероза, проявляющиеся такими состояниями как поражение миокарда в случае коронарной недостаточности, или мышц конечностей при хронической ишемии нижних конечностей, являются одной из самых важных мишеней при разработке гентерапевтических препаратов. Один из наиболее перспективных подходов к восстановлению кровоснабжения ишемизированной мышечной ткани – генная терапия, направленная на обеспечение роста новых кровеносных сосудов.

Как известно, ангиогенез начинается с миграции клеток эндотелия в межклеточное пространство в направлении закладывающегося сосуда. Основными молекулярными факторами, инициирующими и контролирующими данный процесс, являются в большей степени различные виды сосудистых эндотелиальных факторов роста (vascular endothelial growth factor – VEGF), в меньшей степени – фибробластические факторы роста (fibroblast growth factor – FGF). Таким образом, перенос генов данных факторов в клетки сосудов ишемизированной ткани может инициировать их рост и развитие [1, 2]. К настоящему времени несколько вариантов этих генов (VEGF165 и VEGF121; FGF1 и FGF4) прошли I и II фазы клинических испытаний в качестве терапевтических агентов [3, 4], причем убедительно показано, что как при ишемии конечностей, так и при ишемии миокарда препараты на основе VEGF165 безусловно лидируют как по критериям безопасности, так и по эффективности [5].

Основная проблема современной генной терапии, препятствующей ее внедрению в клиническую практику, – достижение оптимального баланса между безопасностью гентерапевтического вектора и его эффективностью. Кратко перечислим наиболее перспективные типы векторов с точки зрения безопасности и эффективности их широкого использования в клинической практике.

Все использующиеся на данный момент гентерапевтические векторы можно разделить на вирусные и невирусные. Вирусные векторы – наиболее распространённое средство доставки терапевтической ДНК в клетки. Более чем в 60% одобренных протоколов генной терапии в период с 1989 по 2010 гг. в качестве средства доставки использовались вирусные векторы (по данным Wiley Interscience Gene Therapy Trials Database [6]). Их основные преимущества: высокая эффективность и специфичность переноса трансгена. Общий недостаток вирусных систем доставки – высокий риск возникновения побочных эффектов, связанный со сравнительно высокой иммуногенностью самого вектора, а также с малой предсказуемостью индивидуальной реакции иммунной системы пациента на вирус. Вследствие этого в последние годы наметилась тенденция к отходу от использования вирусных систем доставки.

Наиболее часто в настоящее время (протоколы клинических испытаний 2007–2010 гг.) в качестве вектора используются следующие типы вирусов: аденовирусы (в 20% протоколов), MVA (модифицированный вирус натуральной оспы, первоначально применявшийся для вакцинации, – 12%), ретровирусы (11%) и аденоассоциированные вирусы (8%) (Wiley Interscience Gene Therapy Trials Worldwide Database [6].

Основные преимущества аденовирусных векторов: высокая эффективность переноса ДНК в различные типы как делящихся, так и неделящихся клеток, а также сравнительно низкая иммуногенность и невозможность возникновения инсерционного мутагенеза, т.е. данные вирусные конструкции не встраиваются в геном [7]. Вход вируса в клетку осуществляется путем рецептор-опосредованного эндоцитоза. Далее вирусная ДНК высвобождается и выходит из эндосомы и проникает в ядро клетки благодаря собственным инфекционным механизмам. В ядре вирусная ДНК существует в форме эписомы, т.е. не интегрирует в геном клетки-хозяина. Однако, несмотря на высокую эффективность аденовирусов как вектора для доставки генетического материала в клетки, существует высокий риск развития воспалительных реакций и токсического поражения различных органов [4, 8–10].

Применительно к проблемам терапевтического ангиогенеза следует учитывать, что немодифицированные аденовирусы не способны инфицировать мышечные волокна и эндотелиальные клетки [11]. В настоящее время наблюдается постепенное угасание интереса к аденовирусам, как к перспективным векторам для генной терапии сердечно-сосудистых заболеваний.

Наибольшей эффективностью доставки трансгена обладают ретровирусные векторы, так как они способны встраивать терапевтический ген в геном клетки-хозяина и таким образом обеспечивать его долгосрочную и стабильную экспрессию. Это свойство наиболее востребовано в генной терапии моногенных заболеваний. Однако использование данного типа носителей сопряжено с высоким риском возникновения побочных эффектов, связанных со случайным встраиванием вирусных генов в геном клетки-хозяина и возможной активацией протоонкогенов [12]. Кроме того, ретровирусы способны инфицировать только активно делящиеся клетки, а потому крайне неудобны и небезопасны для генной терапии сердечно-сосудистых заболеваний.

Основные преимущества MVA перед остальными вирусными векторами: возможность переноса ДНК большого размера, низкая иммуногенность вируса. Основой недостаток состоит в низкой эффективности трансфекции: время экспрессии трансгена составляет всего 24 ч после введения [13]. По этой причине, в основном MVA используется в качестве носителя при ДНК-вакцинации.

Наиболее безопасной и эффективной стратегией переноса нужного гена в клетки-мишени является использование невирусных систем, в частности, плазмид.

Плазмиды – небольшие экстрахромосомные кольцевые двуцепочечные молекулы ДНК, обнаруживаемые в клетках бактерий и давно ставшие одним из самых распространённых инструментов генной инженерии [14]. Плазмидный вектор содержит несколько компонентов: ориджин репликации, необходимый для репликации плазмиды в бактериальной клетке, маркерный ген устойчивости к одному или нескольким антибиотикам (канамицину, ампициллину и проч.), искусственно вносимый в плазмиду для селекции содержащих её клонов бактерий, а также один или более трансгенов, которые должны экспрессироваться в трансфецируемой клетке-мишени (трансгены включают нуклеотидные последовательности интересующих генов, а также все генетические элементы, необходимые для их успешной репликации – энхансеры, промотеры и проч.).

ДНК обладает большим молекулярным весом и несёт отрицательный электрический заряд, а потому не способна спонтанно проникать сквозь фосфолипидные мембраны клеток, и эффективность трансфекции так называемой «голой», ничем не защищенной ДНК, крайне низка. Исследователи постоянно ищут новые методы повышения эффективности трансфекции, разрабатывая различные «катионные» способы доставки ДНК в клетки в комплексе с такими агентами, как фосфат кальция и диэтиламиноэтил целлюлоза, создавая липофильные/гидрофобные комплексы, эндоцитируемые клетками [15–19], а также воздействуя на трансфецируемые клетки различными физическими и химическими факторами, повышающими проницаемость мембран [20, 21]. Большинство этих экспериментальных подходов применимо лишь для трансфекции клеток в культурах in vitro, либо они слишком сложны, чтобы войти в рутинную клиническую практику, однако часть из них все же нашла применение и при доставке генов в клетки ишемизированной ткани [2, 22, 23].

В клинической практике в большинстве случаев суспензия плазмиды вводится пациентам либо внутримышечно [24, 25], либо интраартериально [26–28]. В обоих случаях у пациентов отмечается экспрессия трансгена в мышечных волокнах поражённой ткани, повышение концентрации продуцируемого белка, в частности – VEGF, и улучшение перфузии ткани за счёт развития новых капилляров. Внутримышечная инъекция считается более предпочтительной, поскольку не требует катетеризации крупных сосудов [29].

Впервые данный подход был назван «многообещающим» еще в 1981 г. [30], а первые клинические испытания гентерапевтического подхода к восстановлению перфузии мышечной ткани были начаты в 1994 г. [27, 31]. Позднее плазмида, несущая ген VEGF165, вводилась пациентам с незаживающими трофическими язвами на ногах, не поддающимися хирургическому лечению. Результаты показались авторам весьма обнадёживающими: у пациентов был отмечен ангиогенез в ишемизированных областях, а также резкое снижение частоты болей в покое [32, 33]. Однако за истекшие два десятилетия ни один ангиогенный гентерапевтический препарат до сих пор не был введён в широкую клиническую практику. Важная причина этого – недостаточная изученность механизмов действия эффективных плазмидных конструкций*.

Проникновение плазмидных гентерапевтических конструкций в клетки−мишени

Первое препятствие, которое преодолевает плазмида с встроенным терапевтическим геном, – плазматическая мембрана трансфецируемой клетки. Считается, что плазмиды проникают в клетки посредством эндоцитоза [34]. Существует несколько разновидностей эндоцитоза: клатрин-опосредованный эндоцитоз (адсорбционный или рецептор-опосредованный), эндоцитоз в области липидных рафтов мембраны (связанный либо не связанный с формированием кавеол), фагоцитоз и макропиноцитоз. Однако во всех случаях после поглощения материала из внеклеточного пространства он подвергается последующей деградации в лизосомах (подробный анализ различных механизмов эндоцитоза и методик, направленных на защиту терапевтических генов от лизосомальной деградации, см. в обзоре 34).

В случае плазмид следует предполагать, что они накапливаются преимущественно в многочисленных клетках мышечного окружения, поскольку сами мышечные волокна, как считается, не способны к эндоцитозу [35]. В некоторых клинических исследованиях суспензия плазмиды вводилась в кровеносное русло, значит можно предположить, что захват плазмид осуществляется клетками эндотелия сосудов, которые способны к трансцитозу: при нём не происходит лизосомальной деградации поглощённого материала, и эндоцитозные пузырьки служат для транспортировки веществ с одной поверхности клетки на другую [36]. Однако при трансцитозе не происходит высвобождения поглощённого материала в цитоплазму клетки, а потому его нельзя рассматривать как возможный механизм трансфекции.

Как альтернативный вариант проникновения плазмиды через плазматическую мембрану клеток можно предположить механизм так называемой гидродинамической трансфекции [37]. В общем случае гидродинамическая трансфекция – это метод доставки интересующих генетических конструкций, а также различных белков и искусственных соединений в клетки тканей живого организма путём контролируемого повышения давления в капиллярах и межклеточной жидкости, что вызывает кратковременное повышение проницаемости клеточных мембран и образование в них временных пор. Этот механизм получил название гидропорации [38].

Впервые гидродинамическая трансфекция была описана в экспериментах по доставке ДНК в ткани животных в 90-х гг. XX в. Исследователи из группы V. Budker et al. (1998) продемонстрировали успешную доставку плазмид в клетки скелетной мускулатуры крыс путём быстрого введения суспензии плазмидной ДНК в бедренную артерию животных [39]. Позже была разработана гидродинамическая система доставки «голой» ДНК в скелетную мускулатуру мышей [40, 41]. С тех пор гидродинамическая трансфекция применяется в фундаментальных и доклинических исследованиях на животных для доставки в ткани молекул ДНК и РНК, а первое сообщение о клиническом тесте гидродинамической трансфекции появилось в 2006 г. [42].

Гидродинамическая доставка генного материала в клетку – неспецифический процесс, не зависящий от используемого носителя терапевтического гена. С равным успехом в клетку может быть доставлен плазмидный или же, например, аденовирусный вектор [43–45]. Единственное условие, необходимое для успешной гидродинамической трансфекции – быстрое введение суспензии в организм, что необходимо для образования пор в мембранах клеток. Эффективность трансфекции зависит от нескольких физических параметров: от характеристик мембран того или иного типа клеток и от скорости введения суспензии [38]. При медленном введении препарата, осуществлявшемся в проведённых на сегодняшний день клинических испытаниях доставки в мышцы плазмид, содержащих ген фактора VEGF, также могла происходить гидродинамическая трансфекция отдельных клеток, однако с низкой эффективностью, о которой и сообщали авторы исследований [46].

Было проведено несколько экспериментальных работ, в которых была показана эффективная и безопасная доставка плазмидной ДНК в скелетную мускулатуру [39, 46–51] и в миокард [52, 53] путём быстрого введения плазмид в кровоток либо непосредственно в мышечную ткань. При этом эффективность трансфекции мышечных волокон, например, при введении суспензии плазмиды в скелетную мускулатуру крупных животных (свиней), составила от 22 до 60% (т.е. в 22–60% мышечных волокон мышцы, в которую производилась инъекция, была зарегистрирована экспрессия трансгена) [48]. Это очень высокая эффективность в сравнении с обычной инъекцией суспензии плазмид.

Если гипотеза о гидродинамическом проникновении плазмид, несущих ген фактора VEGF в мышечные волокна, верна, то метод гидродинамической трансфекции может стать идеальным для клинической практики. Во всех экспериментальных работах было показано, что он безопасен и пригоден для неоднократного применения.

Проникновение плазмид, несущих терапевтический ген, в ядро клетки

Ядерная мембрана клетки является вторым препятствием, которое должна преодолеть плазмида с встроенным в неё терапевтическим геном. В экспериментах in vitro было показано, что экспрессия генов, встроенных в плазмиды, происходит гораздо активнее при микроинъекции плазмид непосредственно в ядро клетки, нежели чем при микроинъекции в цитоплазму [54]. Слабая экспрессия плазмид, внесённых в цитоплазму клетки, показывает, что часть их проникает в ядро, однако механизм, лежащий в основе этого процесса, остаётся неясным.

Ядерная мембрана, состоящая, как и плазмолемма, из двух фосфолипидных слоёв, содержит большое количество ядерных поровых комплексов, состоящих из белков нуклеопоринов и имеющих диаметр от 60 до 120 нм, в зависимости от типа клеток. Нуклеопорины и ассоциированные с ними белки транспортируют ионы, белки, РНК и рибонуклеопротеины как из ядра в цитоплазму, так и из цитоплазмы в ядро. Некрупные молекулы весом до 30–35 кДа свободно диффундируют через ядерные поры, однако крупные молекулы весом свыше 40 кДа транспортируются с затратами энергии АТФ; также для эффективного транспорта из цитоплазмы в ядро молекула должна нести так называемый сигнал ядерной локализации (или NLS-сигнал, от nuclear localisation sequence) [55].

Молекулярный вес плазмид слишком велик, чтобы они могли свободно диффундировать через ядерные поры [56]. К настоящему времени был проведён ряд экспериментальных работ, в которых была показана эффективная транспортировка экзогенного генетического материала в ядро клетки благодаря присоединению к плазмиде различных NLS-сигналов (подробный обзор работ в данном направлении и механизмов присоединения NLS-сингалов к плазмидной ДНК см. в обзоре 55).

Существует вероятность проникновения плазмиды в ядро при нарушении целостности ядерной мембраны в процессе митотического деления. Относительно терапевтического ангиогенеза подобное объяснение применимо лишь к клеткам эндотелия капилляров, фибробластам, присутствующим в соединительнотканных оболочках мышечных волокон и миосателлитам [35]. В то же время, в ряде экспериментов было показано проникновение плазмидной ДНК из цитоплазмы в ядра мышечных волокон экспериментальных животных [57], однако механизм этого процесса остаётся неясным.

Экспрессия плазмиды в трансфицированной клетке

Плазмиды, в отличие от ретровирусов, не интегрируются в геном клетки-реципиента и существуют в ядре в виде экстрахромосомной ДНК, а экспрессия терапевтического гена происходит за счёт собственных транскрипционных и трансляционных механизмов клетки. Данный механизм лежит в основе подходов, использующихся для регуляции экспрессии терапевтических трансгенов, в том числе и ангиогенных. Во взрослом организме ангиогенез происходит лишь в редких случаях, и его основным индуктором является нехватка кислорода в тканях. Основной молекулой, задействованной в этом процессе, является транскрипционный фактор HIF-1 (hypoxia inducible factor-1 или индуцируемый при гипоксии фактор-1).

В случае кислородного голодания в клетке происходит накопление фактора HIF-1, который, связываясь с последовательностями HRE (hypoxia response elements), содержащимися в энхансерах генов ангиогенных факторов, индуцирует продукцию соответствующих белков, в том числе и VEGF [58–60].

Существуют экспериментальные работы, в которых для усиления экспрессии терапевтического гена в ишемизированной ткани в плазмидную конструкцию было встроено несколько копий последовательности HRE в комбинации со слабым тканеспецифичным промотором [61–63]. Таким образом были достигнуты две цели: во-первых, терапевтический ген экспрессировался строго в ишемизированной ткани, что исключало его нежелательную экспрессию в неповрежденных гипоксией тканях [64], и, во-вторых, терапевтический ген экспрессировался в ишемизированной ткани достаточно активно.

Заключение

Понимание молекулярных механизмов ангиогенеза при помощи генной терапии необходимо для успешного внедрения этого метода в клиническую практику. Именно с продуктивным синтезом фундаментальных и клинических исследований связан прогресс в развитии генной терапии.

Активная проверка и внедрение высокоэффективной гидродинамической трансфекции позволит отказаться от разработки таких систем доставки, как, например, полиплексы и липоплексы, существенно усложняющих процедуру получения препарата и до сих пор не применявшихся в клинических исследованиях [34]. Небезынтересным подходом может стать разработка эффективного метода доставки плазмидной ДНК в ядро клетки, в частности, обеспеченная присоединением к плазмиде сигналов ядерной локализации [55].

Несмотря на имеющиеся пробелы в изучении механизмов действия безопасных плазмидных конструкций, они на сегодняшний день являются наиболее востребованными в генной терапии соматических заболеваний, тем более, что несут существенный потенциал к модификациям и сочетанию с иными методиками, повышающими эффективность патогенетического лечения.

Подняться вверх сайта