Поиск Кабинет

Влияние трансплантации мононуклеаров пуповинной крови человека на регенерацию почки крысы после унилатеральной обструкции мочеточника

Гены & Клетки: Том VIII, №3, 2013 год, стр: 137-141

 

Авторы

Табанакова А.В., Йылмаз Т.С., Файрушина И.Ф., Гумерова А.А., Киясов А.П.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Клеточная терапия с использованием стволовых клеток может стать эффективным и патогенетически обоснованным методом лечения хронической болезни почек (ХБП) при развитии интерстициального фиброза, который является следствием повреждения канальцевого аппарата почки. Ранее было показано, что трансплантированные стволовые клетки костного мозга участвуют в восстановлении клеток канальцев[1]. В то же время потенциал гемопоэтических стволовых клеток в регенерации канальцевого аппарата почки не изучен. Целью исследования стало изучение участия мононуклеаров пуповинной крови человека в регенерации канальцевого аппарата почки крысы на модели унилатеральной обструкции мочеточника.

18 лабораторным крысам проводили унилатеральную обструкцию мочеточника слева. Экспериментальной группе (n = 9) сразу после операции вводили по 3×106 мононуклеаров пуповинной крови человека в хвостовую вену, контрольной группе (n = 9) – эквивалентный объём 0,9% NaCl. Эксплантацию органов производили через 3, 6, 14 сут. после операции. Парафиновые срезы почки окрашивали иммуногистохимически с антителами к C-kit (маркёру стволовых и прогениторных клеток), ядерному антигену пролиферирующих клеток (PCNA) для оценки их пролиферативной активности и α-гладкомышечному актину (α-SMA) для выявления миофибробластов. Сравнительный анализ оперированных почек экспериментальной и контрольной групп крыс показал, что на всех сроках в первой группе количество пролиферирующих клеток в канальцах и интерстиции было выше, чем в почках животных контрольной группы. К 14 сут. значительно возросло количество пролиферирующих клеток в клубочках почек после обструкции в экспериментальной группе. В то же время, на всех исследованных сроках количество α-SMA+-клеток в первой группе было значительно ниже, по сравнению с контрольной. В контралатеральных почках статистически значимых различий в экспрессии PCNA и α-SMA не было выявлено. Экспрессия C-kit в оперированных почках не отличалась от таковой в контралатеральных, а также в почках здоровых животных. Таким образом, введение мононуклеаров пуповинной крови человека при унилатеральной обструкции мочеточника стимулирует пролиферативную активность клеток клубочков, канальцев и интерстиция, уменьшая активацию миофибробластов и риск развития фиброза почки.

Одной из актуальных проблем современной нефрологии является поиск новых, патогенетически обоснованных и эффективных методов лечения интерстициального фиброза почки, развивающегося вследствие повреждения канальцевого аппарата. Интерстициальный фиброз почек – один из ведущих патогенетических механизмов в развитии хронической болезни почек (ХБП) при таких заболеваниях, как сахарный диабет, подагра, хронический гломерулонефрит, рефлюкс-уропатии, врождённая патология мочевыводящих путей. В то же время, исследователями ведётся интенсивное изучение участия стволовых клеток в регенерации органов и тканей и возможности применения этих клеток для патогенетической терапии различных заболеваний[1–4], в том числе заболеваний почек[4, 5]. Одна из основных моделей интерстициального фиброза почек, используемых для изыскания новых методов лечения ХПН – унилатеральная обструкция мочеточника (УОМ). Модель УОМ на крысах легко воспроизводима, развивающиеся при этом в почке морфологические изменения детально изучены морфометрическими и иммуногистохимическими методами, определено количество апоптозных клеток, установлены колебания сухого веса почки в течение 90 сут. от момента обструкции[6, 7]. При унилатеральной обструкции можно наблюдать развитие ХПН постадийно в течение первой недели после операции. Большинство современных данных позволяют полагать, что процессы, происходящие в почке крысы после УОМ, идентичны таковым при прогрессировании ХПН у человека[8].

В последнее время, как в эксперименте, так и в клинике, в качестве источника гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) наибольшее значение приобретает пуповинная кровь (ПК)[4, 8]. Это связано как с абсолютной безопасностью забора стволовых клеток и возможностью длительного их хранения[4, 9], так и с рядом качественных свойств самих стволовых клеток. Как известно, ГСК, выделенные из ПК, обладают значительно более высокой пролиферативной и клоногенной активностью[4, 8, 10] и меньшей иммуногенностью по сравнению с клетками, полученными из взрослого организма[4, 9]. В связи с этим целью нашего исследования стало изучение влияния внутривенного введения мононуклеаров пуповинной крови человека на регенерацию почки крысы на модели УОМ.

Материал и методы

Исследование проведено на 18 белых беспородных крысах-самцах весом 180–220 г, находящихся на стандартном рационе вивария и имеющих свободный доступ к воде. Крысам проводили УОМ под эфирным наркозом: после срединной лапаротомии производили перевязку левого мочеточника в его нижней трети шёлковой лигатурой с последующим ушиванием брюшной полости послойно[6–8, 12– 14]. Экспериментальной группе (n = 9) сразу после операции вводили в хвостовую вену по 3×106 мононуклеаров, ресуспензированных в 0,2 мл стерильного физиологического раствора, контрольной группе (n = 9) вводили эквивалентный объём 0,9% NaCl. Ксенотрансплантация проведена в связи с невозможностью сбора ПК у крыс.

Выделение мононуклеаров из ПК производили в пробирках объёмом 50 мл. В каждую пробирку наливали по 25 мл фиколла плотностью 1,077 г/мл, на который аккуратно при помощи автоматического дозатора наслаивали равный объём пуповинной крови с антикоагулянтом (соотношение крови и антикоагулянта колебалось в пределах 1:1–1:3)[4, 8]. Пробирки центрифугировали при 720g 20 мин, получали чёткое разделение крови на 3 фракции: эритроциты, лейкоциты и плазму. Лейкоцитарную фракцию забирали в отдельную пробирку, ресуспендировали раствором Версена в соотношении 1:2 и центрифугивали на 305g 15 мин. Полученный клеточный осадок ресуспендировали 10 мл раствора Версена и повторно центрифугировали при 305g 15 мин. Таким образом, клеточный осадок был отмыт от фиколла[4, 8].

Через 3, 6, 14 сут. после операции и введения клеток (по 3 крысы на каждый срок) животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом. Выбор экспериментальных сроков обусловлен стадиями патологического процесса в почке после УОМ. На 3 сут. развивается острая стадия почечной недостаточности, через 6 сут. отмечается максимальная пролиферация канальцевого эпителия на модели УОМ, к 14 сут. повышается число α-SMA+миофибробластов[9]. После выведения животных из эксперимента почки извлекали для морфологического исследования, фиксировали в формалине и заливали в парафин по стандартной методике. Парафиновые срезы почек крыс окрашивали антителами к C-kit (клон Т595, разведение 1:200, Novocastra, Великобритания;), PCNA (клон PC10, разведение 1:100, DAKO, Дания), α-SMA (клон 1A4, разведение 1:50, DAKO, Дания).

Подсчёт окрашенных клеток проводили «вслепую» три независимых морфолога. Число пролиферирующих РCNA+-клеток подсчитывали в 3 неперекрывающихся полях зрения (увеличение ×100) на трёх срезах каждой почки животных экспериментальной и контрольной групп отдельно в клубочках, канальцах, собирательных трубочках, интерстиции. Далее определяли число пролиферирующих клеток на 100 структурных элементов почки. Число α-SMA+миофибробластов оценивали полуколичественным методом («–» – окрашиваются только клетки стенки сосудов, «+» – окрашиваются 0–25% интерстициальных клеток, «++» – 25–50% клеток, «+++» – 50–75% клеток, «++++» – окрашиваются практически все клетки в интерстиции почки).

Результаты

На срезах почек крыс после УОМ морфологически выявлялись признаки, характерные для интерстициального фиброза: дилатация канальцев, атрофия канальцевого эпителия, увеличение содержания в органе интерстициальной ткани, прогрессирующие к поздним экспериментальным срокам, а также атрофия отдельных клубочков (к 14 сут. после УОМ). Сравнительный анализ оперированных почек экспериментальной и контрольной групп крыс показал, что на всех сроках в первой группе количество пролиферирующих клеток в канальцах и интерстиции было выше, чем в почках животных контрольной группы (табл., рис. 1А–Д).

К 14 сут. после УОМ значительно повышалось количество пролиферирующих клеток в клубочках почек экспериментальной группы (33,33 и 66,67 клеток на 100 клубочков в оперированной и контралатеральной почке, соответственно). В то же время, на всех исследованных сроках количество α-SMA+клеток в первой группе было значительно ниже по сравнению с контрольной. На раннем сроке (3 сут.) единичные α-SMA+-клетки в оперированных почках после введения мононуклеаров ПК выявлялись в сосудах и между канальцами (рис. 2Б), без введения на том же сроке – в сосудах и между канальцами отмечено до 50–75% позитивных клеток (рис. 2А), на 6 и 14 сут. после УОМ в оперированных почках экспериментальной группы α-SMA+-клетки являлись единичными на фоне прогрессирующей дилатации и атрофии канальцев (рис. 2Г, Е).

В оперированных почках группы крыс, которым введение мононуклеаров ПК не проводилось, количество α-SMA+-клеток возрастало на 6 сут. (между канальцами, клубочками и канальцами на «+++») и становилось максимальным на 14 сут. после УОМ (между канальцами, клубочками и канальцами на «++++») (рис. 2В, Д). В интактных почках статистически значимых различий в экспрессии PCNA и α-SMA выявлено не было. УОМ не повлияла также на экспрессию C-kit в ткани почки. Таким образом, введение мононуклеаров ПК человека при унилатеральной обструкции мочеточника стимулирует пролиферативную активность клеток клубочков, канальцев и интерстиция, уменьшая в то же время активность в ткани почки миофибробластов – основного клеточного типа, вырабатывающего макромолекулы соединительной ткани при развитии интерстициального фиброза. Аналогичные данные по снижению фиброзирования интерстиция почки были получены на модели УОМ, когда экспериментальным животным вводили мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) и эндотелиальные прогениторные клетки из красного костного мозга[1, 13]. Были показаны встраивание и дифференцировка эндотелиальных прогениторов костного мозга мышей в капиллярную сеть почки после их внутривенного введения мышам с УОМ. Клетки встраивались в стенку капилляров и начинали экспрессировать эндотелиальные маркеры (сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), CD31). Уровень фиброза в почке при этом был ниже, чем в контрольной группе[13]. Группой китайских учёных на данной модели было показано встраивание ММСК костного мозга крыс в канальцы коркового вещества почки после внутривенного введения. Клетки были обнаружены по наличию Y-хромосомы. Уровень фиброза в почках крыс после введения ММСК был значительно ниже по сравнению с контрольной группой[1].

На основании результатов проведенного исследования и работ, выполненных другими группами, можно сделать вывод, что различные прогениторные клетки, и, в том числе, мононуклеары ПК человека, трансплантированные в организм крысы после УОМ, способны индуцировать пролиферацию в повреждённой почке, а также значительно подавляют активность миофибробластов, что препятствует развитию фиброза в почке. Применение данных клеток, таким образом, может быть перспективным для разработки методов клеточной терапии заболеваний, сопровождающихся развитием интерстициального фиброза.

Подняться вверх сайта