Поиск Кабинет

Влияние сывороточных антител к ДНК на клетки почки собаки in vitro в зависимости от иммунореактивных регионов молекулы IgG

Гены & Клетки: Том VII, №3, 2012 год, стр.: 66-68

 

Авторы

Иванова В.В., Невзорова Т.А.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Данные, полученные на культуре клеток почки собаки MDCK, показали, что для осуществления биологической функции антител к ДНК как в норме, так и при патологии, необходимо участие как Fab-, так и Fc фрагментов молекулы IgG. Однако антигенсвязывающий регион, ответственный за проявление биологической функции антител к ДНК при СКВ (системная красная волчанка), более иммунореактивен, чем у антител в норме, а константный регион, вероятно, ответственен за активную конформацию молекулы антитела, при которой осуществляется патобиологическая функция антител к ДНК на клетку.

Актуальным вопросом в молекулярной биологии и иммунологии являются свойства антител (АТ) к ДНК, взаимодействующих с системой рецепторов клеток органов и тканей, способных проникать внутрь клеток и вызывать их функциональные и морфологические изменения. Однако происхождение и биологическая роль АТ к ДНК как в норме, так и при аутоиммунной патологии не выяснена. В связи с этим, изучение взаимодействия антител с различными антигенами, в том числе с клетками и их рецепторами, является логичным для исследования аутоиммунных патологий, таких как системная красная волчанка (СКВ), ревматоидный артрит и др., которые характеризуются высоким содержанием АТ к ДНК [1–3].

Вопрос о механизмах проникновения АТ к ДНК в клетку остается открытым. Исследования вклада структурных участков молекулы IgG, как Fab-, так и Fc-, во взаимодействие и проникновение в клетку проводились, в основном, на моноклональных АТ и полученные данные противоречивы [4–6]. Следовательно, для понимания биологической роли АТ к ДНК необходимо изучить функцию и вклад в патологический процесс каждого иммуннореактивного фрагмента поликлональных антител. Была поставлена цель: оценить влияние АТ к ДНК класса IgG в зависимости от структурных участков молекулы антитела на эукариотические клетки in vitro. Модель исследования – культура клеток почки собаки (МDСК), так как почки – это орган, наиболее часто поражающийся при СКВ.

Материал и методы

В работе использовались следующие реактивы: бромистый этидий (Merk, Германия), cреда RPMI1640 (GIBCO, Шотландия), ДНК из тимуса теленка (Serva, Германия), стафилококковый протеин А (PrA) (Serva, Германия), Madin-Darby Canine Kidney Epithelial Cells (ФЦТРБ-ВНИВИ, Россия), среда DMEM (GIBCO, Шотландия), набор антибиотиков для культивирования (Serva, Германия), трипановый синий (Lachema, Чехия).

Объекты исследования – антитела к ДНК класса IgG, выделенные из сывороток крови методами жидкостной хроматографии низкого давления, которые методами электрофореза и ИФА были охарактеризованы как АТ класса IgG с молекулярной массой 150 кДа, специфичные к ДНК [2]. В работе использовали сыворотки лиц женского пола по n = 3 в каждой группе: доноров и больных СКВ в активной стадии заболевания. Диагноз больных был установлен ревматологами ГБОУДПО Казанской государственной медицинской академии (Казань).

Для оценки влияния полученных высокоочищенных АТ класса IgG, преинкубированных при 56°С в течение 45 мин, на MDCK (10 тыс/мл в 200 мкл) проводили инкубацию (10% DMEM, 80% RPMI-1640, pH 7.4, 2 мМ глутамина, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 10% эмбриональной бычьей сыворотки) при 37°С, 5% СО2. Контрольные образцы, вместо АТ, содержали фосфатно солевой буфер (ФСБ). Для исследования вклада регионов IgG клетки инкубировали с комплексами «АТ–ДНК» (связывание антиген-связывающего Fab-фрагмента антигеном) и «АТ–PrA» St. aureus (связывание константного Fc-региона). Конечная концентрация АТ к ДНК во всех исследованиях подобрана экспериментально – 1 мкг/мл. После инкубации оценивали выживаемость клеток в камере Горяева методом исключения трипанового синего (микроскоп Carl Zeiss Jena, Германия); изменение конформации ДНК клеток методом флуорометрии (МРF-4 Hitachi, Япония).

Статистическую обработку проводили, используя Microsoft Excel (медиана, перцентили 5 и 95).

Результаты

Аффинно выделенные АТ к ДНК здоровых доноров и больных СКВ ингибировали рост и деление клеток, приводили к увеличению флуоресценции комплекса «этидий бромид–ДНК» клеток почки собаки (рис. 1, 2); комплекс АТ–PrA приводил к изменению влияния IgG и PrA на жизнеспособность и метаболизм клеток МДСК; взаимодействие АТ к ДНК с антигеном отменяло влияние IgG здоровых доноров и снижало биологическое действие АТ больных СКВ на клетки почки собаки in vitro.

Обсуждение

АТ клинически здоровых доноров и патологические антитела вмешиваются в метаболизм и жизнеспособность клеток почки собаки, но у патологических антител данный эффект выражен сильнее. Полученные результаты позволяют постулировать о функциональных, а возможно, и структурных различиях нормальных и патологических СКВ-антител и их биологическом влиянии на клетки почек.

Некоторые авторы предполагают, что для осуществления биологической роли антителам необходимо связаться с FcR клеточной поверхности [7]. Другими авторами показано, что F(ab)2’-фрагменты АТ при СКВ способны проникать в клетку и локализоваться в ядре [8]. К настоящему времени найдено много антигенов, с которыми связываются АТ к ДНК в различных типах клеток: FcR на Т-клетках, нуклеосомы в лейкоцитах, ДНК в мононуклеарных клетках, рибосомальный Р-белок в эндотелиальных и мезангиальных клетках и др. неидентифицированные белки. Посредством связывания с этими молекулами в различных клетках АТ могут влиять на апоптоз и клеточную пролиферацию [4, 5, 9].

Нами обнаружено изменение влияния АТ класса IgG на жизнеспособность и метаболизм клеток МDСК как при блокировании антигенсвязывающего Fab-региона АТ антигеном, который ответственен за функции АТ к ДНК, такие как, например, ДНКгидролизующая активность [2], так и Fc-региона молекулы PrА. Полученные результаты свидетельствуют, что комплексообразование АТ с лигандами отменяет воздействия свободных молекул на клетки [10, 11]. Таким образом, можно предположить, что для осуществления биологической функции АТ к ДНК как в норме, так и при патологии необходимо участие как Fab-, так и Fc- фрагментов молекулы IgG. Антигенсвязывающий регион, ответственный за проявление биологической функции СКВ АТ к ДНК более иммунореактивен, чем у АТ в норме, а константный регион, вероятно, ответственен за активную конформацию АТ, при которой осуществляется патобиологическая функция АТ к ДНК на клетку, опосредованная взаимодействием АТ с клеткой. Вероятно, взаимодействие АТ к ДНК как с антигеном, так и с клеточными рецепторами происходит по механизму индуцированного соответствия, что определяет дальнейшее действие АТ.

Подняться вверх сайта