Поиск Кабинет

Влияние рекомбинантного гистона Н1.3 на эффективность лентивирусной трансдукции клеток человека in vitro

Гены & Клетки: Том VII, №3, 2012 год, стр.: 151-154

 

Авторы

Соловьева В.В., Исаев А.А., ГенкинД.Д., Ризванов А.А.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Лентивирусные векторы широко применяют в генетической модификации клеток человека и животных (лентивирусная трансдукция) для повышения их терапевтического потенциала за счёт экспрессии рекомбинантных протекторных и трофических факторов. Генетическая модификация клеток in vitro или ex vivo позволяет достичь специфичности вирусной трансдукции, так как модифицированными оказываются лишь клетки, с которыми проводят манипуляции в лабораторных условиях. Кроме того, введение генетически модифицированных клеток, а не чистого вируса, позволяет исключить попадание свободных вирусных частиц в организм реципиента. Такой подход позволяет контролировать продукцию терапевтических генов, иммуногенность вирусных векторов и вирусную трансдукцию. На сегодняшний день используют различные подходы для повышения эффективности лентивирусной трансдукции (поликатионы, протамин сульфат и др.), однако эти методы имеют низкую эффективность или высокую токсичность. В работе впервые показано, что рекомбинантный гистон Н1.3 повышает эффективность лентивирусной трансдукции более чем в 2 раза и не оказывает токсического действия на клеткимишени в широком диапазоне исследуемых концентраций.

Новым подходом, потенциально способным повысить эффективность генной и клеточной терапии, может стать использование генетических векторов на основе вирусов. Широкое применение в генной терапии нашли векторные системы на основе ретровирусов, разрешенные для клинического применения [1–4]. В настоящее время активно исследуются лентивирусы (сложные ретровирусы), которые способны инфицировать как делящиеся, так и не делящиеся клетки. Несмотря на это, применение вирусов ограничено в связи с их потенциальной онкогенностью и иммуногенностью. Комбинирование генной и клеточной терапии повышает эффективность переноса генетического материала, позволяет избежать иммунного ответа, ограничивающего введение вирусных векторов напрямую в ткани реципиента, а также способствует продлению терапевтического эффекта. Однако большинство существующих методов генетической модификации клеток in vitro имеют низкую эффективность или высокую токсичность.

На сегодняшний день используют различные подходы для повышения эффективности вирусной трансдукции (применение поликатион декстрана [5], поликатион полибрена [6], протамин сульфата [7] и др.), однако эти методы обладают рядом недостатков, препятствующих их применению в клинике. В связи с этим, остро стоит вопрос поиска новых эффективных и биологически безопасных методов генетической модификации клеток.

Гистоновые и другие ядерные белки могут служить эффективными векторами для переноса генов в клетки. Трансфекция эукариотических клеток комплексами нуклеиновых кислот с гистонами (гистонофекция) эффективно проходит с различными представителями семейства гистонных белков [8–16]. Механизм гистонофекции рассмотрен ранее в обзоре [17]. Рекомбинантный гистон Н1.3 в составе препарата «Онкохист» уже прошел в Европе I стадию клинических испытаний, доказавших его безопасность, а также косвенно подтвердивших эффективность при лечении острого миелоидного лейкоза и неходжкинской лимфомы. Гистон H1.3 имеет выраженный положительный заряд, как и поликатион полибрена и протамин сульфат, что, предположительно, может приводить к повышению вирусной трансдукции по схожему механизму действия. Таким образом, биологически безопасный рекомбинантный гистон Н1.3 может стать эффективным заменителем известных ранее катионных препаратов для повышения эффективности вирусной трансдукции.

Целью работы явилось исследование влияние рекомбинантного гистона Н1.3 на эффективность инфицирования (трансдукции) клеток рекомбинантным лентивирусом.

Материал и методы

Культуры клеток. Все работы с культурами клеток проводили в стерильном ламинарном боксе с соблюдением общепринятых правил работы в лаборатории II класса биобезопасности. Эмбриональные клетки почки человека HEK-293T (ATCC, CRL-11268) и клетки линии HeLa (ATCC, CCL-2) культивировали в среде Игла, модифицированной по методу Дульбекко (Sigma, США), с добавлением 10% сыворотки крови плодов коровы (Sigma, США), 2 мM L-глутамина и 1% смеси антибиотиков пенициллина и стрептомицина (Sigma, США). Клетки инкубировали при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2. Пересев клеток проводили при плотности клеточного монослоя 90% с применением 0,25% раствора 1х трипсина-ЭДТА (Sigma, США).

Определение цитотоксичности гистона Н1.3. Цитотоксичность гистона Н1.3 определяли колориметрически MTS-тестом [18, 19] с помощью реагента CellTiter 96® AQueous MTS Reagent Powder (Promega, США) на планшетном анализаторе CERES 900HDi (Bio-TekInstruments Inc., США) через 24, 48 и 72 ч. после добавления гистона H1.3 в концентрации 50, 250 и 1000 мкг/мл к клеткам линии HeLa (в 4-х повторностях). Оптическую плотность измеряли при длине волны 490 нм. Статистический анализ проводили с помощью программы Microsoft Excel 2007, используя t-критерий Стьюдента.

Получение рекомбинантного лентивируса. Рекомбинантный лентивирус (GFP-LV), экспрессирующий зеленый флуоресцентный белок (green fluorescent protein, GFP), получали с помощью котрансфекции клеток НЕК-293Т плазмидами, кодирующими разные компоненты рекомбинантного вируса: оболочечная плазмида pCMV-VSV-G (AddGene № 8454), упаковочная плазмида psPAX2 (AddGene № 12260) и векторная плазмида pWPT-GFP (AddGene № 12255). Трансфекцию осуществляли стандартным кальцийфосфатным методом [20].

Трансдукция клеток линии HeLa рекомбинантным лентивирусом. Клетки линии HeLa культивировали в 24-луночном планшете до плотности клеточного монослоя 50%. Далее клетки инфицировали рекомбинантным лентивирусом GFP-LV, экспрессирующим GFP. Для этого к клеткам HeLa добавляли рекомбинантный лентивирус, или смесь лентивируса с гистоном Н1.3, или смесь лентивируса с протамин сульфатом. Гистон Н1.3 «Онкогист» добавляли в лунку в количестве 125 мкг на 500 мкл среды (конечная концентрация 250 мкг/мл). Протамин сульфат добавляли в лунку в количестве 5 мкг на 500 мкл среды (конечная концентрация 10 мкг/мл). Клетки инкубировали в течение 48 ч, после чего определяли степень инфицирования клеток рекомбинантным лентивирусом по экспрессии и флуоресценции GFP на проточном цитометре Guava easyCyte 8HT (Millipore, США) и на инвертированном флуоресцентном микроскопе AxioOberver.Z1 (Carl Zeiss, Германия).

Результаты и обсуждение

Эксперименты по исследованию цитотоксичности гистона Н1.3 на клетки линии HeLa показали, что в широком диапазоне исследуемых концентраций гистон Н1.3 не оказывает токсического действия на культуру клеток HeLa. Гистон Н1.3 в концентрациях 50 мкг/мл и 250 мкг/мл не оказывал токсического действия на жизнеспособность клеток линии HeLa на протяжении 72 ч. инкубации. Добавление 1000 мкг/мл гистона Н1.3 оказывало токсический эффект на клетки, начиная с 24 ч инкубации. Их жизнеспособность была статистически значимо ниже по сравнению с контролем без добавления гистона Н1.3 (рис. 1). Для дальнейшего исследования влияния гистона Н1.3 на лентивирусную трансдукцию была выбрана нетоксичная концентрация – 250 мкг/мл.

В работе использовали рекомбинантный лентивирус GFP-LV на основе ВИЧ-1, экспрессирующий GFP. На рис. 2 приведены данные проточной цитофлуориметрии клеток, трансдуцированных рекомбинантным лентивирусом GFP-LV. Культуру клеток или раствор лентивируса обрабатывали рекомбинантным гистоном Н1.3 в различных комбинациях. Эффективность вирусной трансдукции определяли по экспрессии репортерного гена gfp. Ген gfp входит в состав генома рекомбинантного лентивируса и, в данном случае, ведёт себя как типичный вирусный ген. Для экспрессии лентивирусных генов необходимо, чтобы провирус встроился (интегрировался) в геном клетки хозяина. После встраивания в геном клетки хозяина начинается экспрессия вирусных генов – транскрипция мРНК и трансляция белка. Таким образом, наличие зеленой флуоресценции клеток свидетельствует об успешной вирусной трансдукции.

В связи с тем, что популяция клеток обладает естественной гетерогенностью по уровню автофлуоресценции, пороговое значение флуоресценции было выбрано таким образом, что 99,5% клеток считались не флуоресцирующими, а 0,5% клеток, соответственно, считались ложно-положительными по флуоресценции (рис. 2А). После лентивирусной трансдукции без добавления гистона H1.3 или протамин сульфата 9,21% клеток HeLa обладали флуоресценцией (рис. 2Б). При лентивирусной трансдукции с добавлением протамин сульфата 12,73% клеток обладали зеленой флуоресценцией (рис. 2В). Таким образом, добавление протамин сульфата повысило эффективность вирусной трансдукции на 38,22% по сравнению с GFP-LV без добавок. Обработка клеток рекомбинантным гистоном Н1.3 перед лентивирусной трансдукцией не привела к увеличению эффективности трансдукции, при этом только 8,16% клеток обладали флуоресценцией (рис. 2Г). Обработка клеток рекомбинантным гистоном Н1.3 после лентивирусной трансдукции повысила эффективность вирусной трансдукции на 213,59% по отношению с GFP-LV без добавок. При этом 27,19% клеток обладали флуоресценцией (рис. 2Д). При трансдукции смесью рекомбинантного лентивируса GFP-LV и рекомбинантного гистона Н1.3 23,75% клеток обладали флуоресценцией. Таким образом, смесь GFP-LV с Н1.3 повысила эффективность вирусной трансдукции на 186,57% по сравнению с GFP-LV без добавок (рис. 2Е).

Таким образом, показано, что рекомбинантный гистон Н1.3 повышает эффективность лентивирусной трансдукции более чем в 2 раза и не оказывает токсического действия на клетки-мишени в широком диапазоне исследуемых концентраций.

Подняться вверх сайта