Поиск Кабинет

Влияние пористых трехмерных имплантатов из нитинола на культуру мультипотентных мезенхимных стромальных клеток

Гены & Клетки: Том VIII, №1, 2013 год, стр.: 51-56

 

Авторы

Волчков С.Е., Шишковский И.В., Байриков И.М.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Представлены результаты исследования биосовместимости in vitro пористых трехмерных имплантатов из никелида титана (нитинола). Пористые материалы были получены методом послойного селективного лазерного спекания и инкубированы с культурой мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК). С помощью световой и электронной микроскопии были исследованы микроструктуры поверхности полученных имплантатов. Было показано, что полученные материалы не обладают токсическим или иным повреждающим действием, однако снижают пролиферативную активность ММСК и их способность к миграции.

В современной хирургической практике, особенно в травматологии и ортопедии, стоматологии и челюстно-лицевой хирургии большое значение имеют различные имплантаты, показанные при целом ряде заболеваний как для временного применения (пластины для накостного остеосинтеза, винты и т.п.), так и для постоянного (дентальные имплантаты, эндопротезы). Одним из основных требований к материалам, пригодным для изготовления подобных изделий, помимо оптимальных механических свойств, являются отсутствие токсичности и биологическая совместимость, которая в случае нерезорбируемых материалов состоит в инертности и оптимальной интеграции с тканями реципиентного ложа – без соединительнотканной капсулы[1]. Ведущим подходом для усиления биосовместимости имплантатов является модификация их поверхности и структуры. Известно, что микроструктурированная поверхность в сравнении с гладкой оказывает более выраженное влияние на морфологические особенности и «поведение» клеток, модулирует их пролиферацию. При этом наблюдается синергетическое влияние структур микронного и субмикронного масштабов[2, 3]. Также намечается тенденция к замене монолитных имплантационных материалов пористыми, позволяющими добиться большей интеграции с тканями реципиентного ложа за счет врастания регенерата в структуру имплантата. В последнее время появились работы по использованию нитерметаллидной фазы никелида титана (нитинол)[2, 4]. Интерес к этому материалу связан с тем, что в нем возможна реализация эффекта памяти формы.

Первые данные о биологических свойствах имплантатов могут быть получены in vitro – при инкубировании с культурами клеток, в частности, с мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками (ММСК)[5, 6]. Согласно современным данным, ММСК могут быть выделены из различных источников, прежде всего из красного костного мозга. Однако процедура получения этого материала достаточно травматична и может вызвать ряд нежелательных реакций[7]. Поэтому в качестве альтернативного источника ММСК с успехом используется жировая ткань, а также, как в настоящем исследовании, пуповинная кровь[5, 8]. Инкубирование имплантатов с культурами ММСК позволяет оценить биологические свойства материалов, как то: токсичность, мутагенность, влияние на пролиферативную активность клеток, дифференцировку, способность к миграции, а также пригодность поверхности для клеточной адгезии, что характеризует степень возможной интеграции имплантата in vivo[9]. Именно на оценку биологических свойств пористых трехмерных имплантатов из нитинола и было нацелено наше исследование.

Технология быстрого прототипирования имеет неоспоримый медицинский потенциал за счет возможности изготовления индивидуальных имплантатов с заранее определенной внутренней и(или) внешней формой поверхности. Преимуществом метода селективного лазерного спекания/плавления (СЛС/П), относящегося к данной технологии, является создание готовых к применению, т.е. функциональных имплантов по данным 3D компьютерной томографии и без лишних операций формирования литьевых форм[2–4, 10–14]. Контролирование дизайна внутренней структуры поровых каналов еще на стадии компьютерного моделирования позволяет интенсифицировать прорастание соединительных тканей в пористый матрикс, увеличить площадь соприкосновения (а, следовательно, и механическую прочность) между имплантом и костью. Пористые каналы могут быть насыщены лекарственными препаратами для активации вживления, предотвращая некроз клеток.

Материал и методы

Объект исследования

Процесс быстрого прототипирования методом СЛС 3D биоматрикса подробно описан ранее[2]. Внешний вид пористых матриксов из нитинола моделировался нами средствами CAD и далее синтезирован в Самарском филиале ФИАН на установке для послойного лазерного синтеза (рис. 1).

Перед лазерным спеканием порошки нитинола (Полема, Россия) предварительно просушивали в вакуумном шкафу в течение 2 ч при 300°С. Исходная дисперсность всех порошков составляла около 100 мкм, чтобы быть соизмеримой с диаметром пятна лазерного излучения, и контролировалась ситовым анализом. В результате лазерного спекания для формировались трехмерные плоские пористые матриксы размером около 10×10×d мм, где d – толщина монослоя, приблизительно 0,5–1 мм в зависимости от режима лазерного спекания (см. рис. 1). Матриксы имели в зависимости от режима СЛС развитую пористость до 40%, открытую пористость около 30–40%, размер пор при спекании был соизмерим с размером исходной фракции или меньше ее не более, чем в 1,5–2 раза, с плотность 3,5–4 г/см3 (около 6,5 г/см3 у литого нитинола), водопоглощение порядка 7–12 %[2].

Исследование биосовместимости с культурой ММСК

Исследуемые материалы отмывали стерильным фосфатно-солевым буфером (PBS), затем стерилизовали в автоклаве при 121°С, 20 мин. при давлении 120 кПа. Имплантаты из нитинола (n = 10) инкубировали с культурами ММСК. В качестве контроля использовали культуры ММСК без каких либо дополнительных материалов. ММСК получали из Вартонова студня пуповины новорожденных детей, после подписания матерями информированного согласия. Клетки выделяли методом эксплантов. Культивирование в исследуемых и контрольной группах продолжалось в течение 26 сут. в стандартных условиях: 37°C, 5% CO2 в инкубаторе MCO-20AIC (Sanyo, Япония). Питательную среду аМЕМ (Sigma, США) с добавлением 10% FBS (Gibco, США), 2 мМ l-alanyl-gluthamine (Invitrogen, США) меняли каждые 5 сут., или ранее при изменении индикатора среды. Для определения принадлежности полученных клеток к группе ММСК использовали протокол, согласно рекомендациям международного сообщества клеточной терапии. Иммунофенотипирование проводили по следующим антигенам: CD 90, CD 44, CD 106, CD 45, HLA-ABC, HLA-DR, CD 73, CD 34, CD 144, CD 105, CD 117, CD 62L, CD 133, CD 14 на проточном цитофлюориметре FACS Canto (Becton Dickinson, США). Индукция дифференцировки в остеогенном, хондрогенном и адипогенном направлении проводилась с с помощью специальных сред: NH Osteodiff, NH Chondrodiff, NH Adipodiff (Miltenyi Biotec, Германия), – по инструкции производителя. Оценка дифференцировочного потенциала проводилась по изменению морфологии клеток и подтверждалась цитохимическими реакциями с OilRed O (Sigma, США) для оценки адипогенеза, на щелочную фосфатазу FAST BCIP/NBT (Sigma, США) для оценки остеогенеза, а также иммуноцитохимической реакцией с антителами к аггрекану (Abcam, Англия) для оценки хондрогеннной дифференцировки. Оценка пролиферативной активности проводилась на клеточном анализаторе концентрации и жизнеспособности ViCell XR (Beckman Coulter, США). Скорость пролиферации определяли по формуле: x =[log10(NH) – log10(N1)]/log10(2), где NH – количество клеток при посеве культуры, N1 – количество клеток после экспансии.

Для оценки токсичности материала оценивали морфологию клеток с проведением морфометрического анализа, выполняли подсчет скорости удвоения, а также определяли способность клеток к миграции c использованием эксперимента «Time lapse» на микроскопе AxioObserver A1 (Carl Zeiss, Германия), с системой инкубации. Этот эксперимент включал в себя культивирование культуры клеток в течение 4 ч. со скоростью съемки видео 10 кадров в мин. Оценка видео, расчет дистанций движения клеток и морфологии проводились на программном обеспечении Image-Pro PLUS (Media Cybernetics, США) и AxioVision (Carl Zeiss, Германия). Кластерный анализ культур – выделение движущихся объектов (клеток), расчеты траекторий и дистанций перемещения – проводился на программном комплексе ImageJ и Image Pro Plus, деление клеток на группы оценивалось в программе по плотности пикселей на объект.

Результаты и обсуждение

Морфологический анализ

Как отмечалось выше, ранее нами проводилось тестирование синтезированного методом СЛС нитинола в сравнении с чистым титаном на культуре дермальных фибробластов 4–18 пассажей, в том числе с добавками гидроксиапатита (ГАП)[4]. В качестве положительного контроля (наряду с интактной группой) был использован литой стоматологический титан марки «Рема». Была показана хорошая биосовместимость нитинола даже без добавок ГАП. При этом с помощью электронной микроскопии было показано, что в отличие от литой поверхности титана, адгезия фибробластов к пористой поверхности проходила более активно.

Нами были получены культуры ММСК, отвечающие утвержденным критериям (иммунофенотип, дифференцировочный потенциал). Исследуемые клетки экспрессировали следующие антигены: CD 90, 44, HLA-ABC, 73,105, что является характерным признаком стромальных клеток. Наблюдалось отсутствие экспрессии следующих антигенов: CD 45, 106, 34, 144, 62L, HLA-DR, 133, 14, что также подтверждает принадлежность к стромальным клеткам. В ходе эксперимента была выявлена слабая положительная экспрессия CD 117 (c-kit), являющегося рецептором для SCF. Позитивная экспрессия этого маркера свидетельствует о «недифференцированности» исследуемых клеток. ММСК имели типичную морфологию в культуре: фибробластоподобную (веретеновидную) форму, одно ядро с несколькими ядрышками (рис. 2). При этом за 10 дней культивирования происходило увеличение плотности культуры с 35% до 100%.

Материалы из нитинола, помещенные в культуральную посуду уже на этапе адгезии первичной популяции, несколько уменьшали скорость экспансии ММСК: у края NiTi матрикса увеличение количества клеток наблюдалось в меньшей степени, чем в контроле. В течение 10 сут. в присутствии матрикса из нитинола плотность культуры увеличивалась значительно медленнее в сравнении с контрольной группой и не равномерно среди экспериментов данной группы (от 60 до 95%). На десятый день максимальная плотность ММСК (95, 85 и 60%) была достигнута только в трех из 10 случаев в экспериментальной группе. В дополнение наблюдались небольшие колонии в непосредственной близости от материала, с морфологией «старых» клеток (рис. 3). Первые клетки, адгезировавшиеся к поверхности материала, были обнаружены лишь на 13 сут. (рис. 4).

Таким образом, в контроле образование клеточного монослоя произошло за 16 сут., скорость пролиферации составила 0,03 уд/ч или 0,694 уд/сут., а общее количество удвоений за период культивирования составило 11,1 (рис. 5). Морфология клеток оставалась нормальной на протяжении всего культивирования. Естественное появление «стареющих» клеток в культуре составило не более 20% от всей популяции. Процессы старения характеризовались увеличением объема ядра и цитоплазмы, увеличением площадей клеток, а также изменением их формы на кубическую.

В группе NiTi скорость пролиферации составила 0,02 уд/ч или 0,532 уд/сут., а общее количество удвоений за период культивирования – 10,63. В результате исследования в серии «нитинол» был выявлен незначительный эффект угнетения пролиферативной активности клеточной культуры, что связано, возможно, с повышенной пористостью материала и его подвижностью в культуральной посуде, приводящей к повреждению монослоя.

Сортировка клеток по «площади», по «возрасту» и способности к миграции

В зависимости от интенсивности роста клеточной популяции по морфологическим признакам был проведен анализ и отдельная выборка клеток на разных этапах развития, характеризующая процесс старения (рис. 5А). Все клетки были условно разделены на три категории: молодые, взрослые и старые (табл.).

Морфологическая обработка фотографий культур ММСК проводилась в каждой группе и серии экспериментов на 3, 15 и 25 сут. культивирования (рис. 5). Первая категория ММСК – молодые, активно делящиеся и мигрирующие по поверхности культуральной посуды клетки, веретеновидной формы, площадью не более 5000 мкм2. Вторая категория – «взрослые» клетки, треугольной или неправильной формы, площадью от 5000 до 16 000 мкм2, способные к пролиферации и миграции. Третья категория – «гигантские клетки», неправильной формы, с заостренными краями, очень большой площадью поверхности: от 16 000 и до 40 000 мкм2, в редких случаях и выше; не участвуют в делении, практически не мигрируют.

На рис. 5 видно, что если в контроле преобладают «молодые» активно пролиферирующие клетки, то вблизи 3D матрикса большое количество «старых» – гигантских и малоподвижных клеток. Поэтому общая скорость удвоения культуры при наличии матрикса значительно ниже, чем в контроле.

Оценка способности к миграции (механотаксис) проводилась методом сравнения траекторий движения клеток между сериями «Контроль» и «Нитинол». В контрольной группе за время наблюдения клетки преодолевали дистанцию (в среднем) 350,4±187,0 мкм, а клетки из экспериментальной в схожих условиях «проходили» около 42,5±29,9 мкм.

По нашим данным, важна не просто пористость матрикса для оптимального совмещения с культурами клеток, а размеры пор, которые должны быть «сопоставимы» с размерами клеток. Клетки выстраиваются перпендикулярно матриксу и плотность их наиболее высока лишь у отдельных пор, что отмечалось нами ранее[4]. Возможно, что чрезмерная субмикронная пористость также вредна для ММСК, имеющих размеры 50–100 мкм, как и ее полное отсутствие.

Заключение

Таким образом не было выявлено токсических эффектов матриксов из нитинола. Однако исследуемый материал оказывал несколько негативное влияние на пролиферативную и миграционную активность ММСК. Заселение клетками матрикса начиналось только с 13 сут. культивирования. Другим принципиальным результатом является следующий обнаруженный нами факт, который еще требует объяснений и дальнейших исследований. Если в контроле (т.е. без матрикса) процент молодых, малых по площади, но активно делящихся ММСК был очень высок (более 50–60%), то при инкубировании с матриксом из нитинола ММСК вырастали до больших размеров – быстро старели (или «скатывались» в дифференцировку), а активность их деления резко снижалась.

Подняться вверх сайта