Поиск Кабинет

Влияние пониженного содержания кислорода на дифференцировку мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга человека in vitro

Гены & Клетки: Том IV, №3, 2009 год, стр.: 47-51

 

Авторы

Жамбалова А.П., Гершович Ю.Г., Буравкова Л.Б., Гальчук С.В., Романов Ю.А.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Исследовали дифференцировочный потенциал мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (мезенхимальных стволовых клеток, МСЮ костного мозга человека и экспрессию транскрипционного фактора, индуцируемого при гипоксии (Hypoxia Inducible Factor — FIIF-1 а), при культивировании в условиях пониженного содержания кислорода (1 и 5% Су. При индукции МСК в нормоксических (20% Су условиях и при пониженном содержании кислорода установлена, проявляющаяся в различной степени, способность МСК к дифференцировке в остеогенном, адипогенном, эндотелиальном направлениях. Методом проточной цитометрии выявлено, что уровень FIIF-1 а в цитоплазме монослойных культур МСК, инкубированных при 1 и 5% содержании кислорода в течение 24 ч и 7 сут., снижается по сравнению с нормоксическим контролем (20%)

Введение

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (мезенхимальные стволовые клетки, МСК) в культуре обладают способностью к активной пролиферации, поддержанию кроветворного микроокружения в течение длительного времени и дифференцировке в различные типы клеток мезодермального ряда в ответ на действие соответствующих стимулов [1, 2]. Накоплен большой опыт индукции МСК к дифференцировке in vitro в самых различных направлениях, однако механизмы включения тех или иных дифференциро-вочных путей изучены недостаточно. Кроме того, известно, что условия культивирования — состав среды, индукторы дифференцировки, характер субстрата и состав газовой смеси играют существенную роль в реализации функциональных возможностей клеток. В условиях пониженного содержания кислорода активируются многие важные физиологические процессы, например, эритропоэз, ангиогенез, которые тесно связаны с транскрипционной экспрессией индуцируемых гипоксией генов [3—7]. Ключевая роль в инициации такого системного ответа клетки принадлежит специфическому белковому фактору, индуцируемому при гипоксии — HIF-1 (Hypoxia Inducible Factor-1). HIF-1 представляет собой гетеродимерный белок, состоящий из двух субъединиц: индуцибельно экспрессируемой кислородчувствительной субъединицы HIF-1 — и конститутивно экпрессируемой в ядре (независимо от напряжения кислорода в клетке) субъединицы HIF-lp. Этот транскрипционный фактор активирует ряд генов, экспрессия которых необходима для поддержания клеточного гомеостаза [7—9].

Многие исследователи напрямую связывают диффе-ренцировочные процессы с регуляцией, опосредованной HIF-1 — [10—12]. Так, в исследованиях S. Provot и соавт. отмечают замедление хондрогенеза при нокаутировании HIF-1 — у эмбрионов мышей [13]. HIF-1 активирует гены, кодирующие синтез таких ростовых факторов, как фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF), ангио-поэтин 1 и 2 (ANGPT1, ANGPT2), которые регулируют ангиогенез [14—16].

Целью исследования явилось изучение экспрессии HIF-1 — и дифференцировочного потенциала МСК костного мозга человека при культивировании в условиях пониженного содержания кислорода.

Материал и методы

Культивирование клеток в условиях гипоксии

Для культивирования в условиях пониженного содержания кислорода (5% 02, 5% С02, 90% N2) и низкого содержания кислорода (1% 02, 5% С02, 94% l\l2) использовали мультигазовый инкубатор МС0-175М (Sanyo, Япония) или герметичные инкубационные камеры (Stem Cell Technologies, Канада), в которых воздух замещали газовой смесью (94% N2 или 90% N2, 5% С02) и помещали в термостат ( + 37°С). Содержание кислорода и давление в газовой среде камеры контролировали с помощью встроенных в камеру датчиков.

Оценка дифференцировочного потенциала МСК

Для подтверждения возможности дифференцировки, демонстрирующей остеогенный потенциал МСК костного мозга человека, клетки инкубировали в среде, содержащей остеогенные дифференцировочные стимулы: 1СНМ дексаметазона, 10 мМ р-глицерол-2-фосфата натрия (Sigma, США) и 0,2 мМ 2-фосфо-1--аскорбино-вой кислоты CFiuka, Германия) и без добавления индукторов, при различном содержании кислорода (1,5 и 20% 02). Способность к дифференцировке МСК в остеогенном направлении оценивали гистохимически по степени минерализации внеклеточного матрикса после культивирования МСК в течение 21 сут. в остеогенной среде. Гистохимическое окрашивание Са2+ внеклеточного матрикса проводили ализариновым красным S (40 тМ, pH 4,2) (Sigma, США).

Для анализа способности МСК к адипогеннной дифференцировке клетки культивировали до достижения монослоя. Монослойные культуры клеток далее культивировали в индукционной среде (200 /jM индометацин, 0,5 тМ З-изобутил-1 -метилксантин, 10 /jM инсулин, 10~8 М дексаметазон) (Sigma, США) и среде без адипо-генных стимулов при различном содержании кислорода (1,5 и 20% 02) в течение 21 сут. Адипогенную диффе-ренцировку оценивали визуально по образованию внут-риклеточно липидных капель. Клетки отмывали от среды буферным раствором, фиксировали 4% параформальдегидом и окрашивали с помощью 0,36% масляного красного О в изопропаноле (Sigma, США).

Для выявления способности МСК образовывать капилляроподобные структуры суспензию МСК, приготовленную для пассирования, инкубировали в матригеле (ECMatrix™, CHEMICON®, США), содержащем ламинин, коллаген IV типа, протеогликаны, энтактин, факторы роста — TGF-p, FGF, при различном содержании кислорода (1,5 и 20% 02) в течение 12 ч.

Визуальный анализ и фотографирование клеток проводили с помощью микроскопа, оборудованного цифровой фотокамерой (Leica DMIL, Германия).

Цитофлюориметрический анализ уровня HIF-1 — в цитоплазме

Экспрессию HIF-1 — анализировали с помощью проточной цитофлюориметрии (Epics XL, Beckman Coulter, США). При исследовании экспрессии HIF-1 — применяли в качестве первичных антител — мышиные моноклональные антитела против HIF-1 — (Н1-alpha-67, Abeam, Великобритания) в разведении 1:500; в качестве вторичных антител — соответствующие антивидовые антитела IgG, меченые ФИТЦ (флюоресцеинизотиоцианат) (Jackson Immunoresearch, США). Позитивным контролем служили моноклональные антитела против вимен-тина (Dako Cytomation, Дания), в негативном контроле — первичные антитела не вносили. Проведено 6 серийми в монослойных культурах МСК различных пассажей.

Результаты

При культивировании МСК при 1,5 и 20% 02 в течение 3 нед. в среде, не содержащей остеогенные стимулы, клетки не кальцифицировали матрикс, тогда как в остеогенной среде отмечалось накопление солей кальция в ходе остеогенной дифференцировки МСК. Добавление остеогенных стимулов в среду роста МСК приводило к активной прогрессии остеогенеза, сопровождающейся активацией роста, формированием многослойных пластов клеток, приобретением клетками полигональной формы. При культивировании МСК при 5 и 20% 02 в течение 3 нед. клетки формировали узелки, а также интенсивно синтезировали межклеточное вещество, которое выявляли гистохимически с помощью ализаринового красного как соли кальция (рис. 1). Качественных различий (приобретение морфологических признаков остеобластов, присутствие кальция во внеклеточном матриксе) между МСК, культивируемыми при 5 и 20% 02 выявлено не было, но соотношение количества минерализованного матрикса различалось. В нормоксических (20% 02) культурах МСК синтезированный матрикс с солями кальция полностью покрывал монослой клеток, в отличие от культур, инкубируемых при 5% 02. В гипоксических условиях (1% 02) в среде с остеогенными стимулами МСК не вырабатывали минерализованного межклеточного вещества.

После индукции в адипогенном направлении клетки приобретали сферическую или близкую к ней форму, в цитоплазме клеток происходило накопление липидных включений, которые при окрашивании липофиль-ным красителем приобретали оранжево-красный оттенок. Детальная микроскопия опытных образцов выявила сходную эффективность адипогенеза между культурами МСК, экспонированными при 1,5 и 20% 02 (рис. 2). В то же время в культурах, инкубируемых с адипогенными стимулами при 20% 02, клетки объединялись с близлежащими клетками в единые колонии или кластеры с липидными включениями во внутриклеточном пространстве, которые на поздних этапах диффе-ренцировки сливались в крупные конгломераты жировых капель и заполняли весь объем клетки. Размеры жировых капель в адипогенных культурах МСК, экспонированных при 5% 02, были меньше. При культивировании МСК в среде, содержащей 1% 02, количество клеток с липидными включениями было существенно ниже, чем при инкубации при 5% 02 и 20% 02 уменьшался и размер липидных капель. В культурах МСК, инкубированных в среде без индукторов при 1,5 и 20% 02, не было отмечено клеток с наличием липидных капель.

Исследования по выявлению возможности МСК образовывать капилляроподобные структуры показали, что МСК, инкубируемые в матригеле с факторами роста как при 5% 02, так и при 20% 02, способны к дифференци-ровке в эндотелиальном направлении. В экспериментальных образцах уже через 8 ч. инкубации отмечена организация клеток в сетевидные трехмерные структуры (рис. 3). Сетевидная структура генерировалась из клеток, которые представляли собой уплотненные шаровидной формы образования, соединенные друг с другом длинными узкими отростками. В процесс дифференци- ровки под действием специфических факторов, содержащихся в среде инкубирования, были вовлечены практически все клетки, экспонированные как при 5% 02, так и при 20% 02. При сопоставлении морфологических характеристик и временной динамики при инициализации дифференцировки МСК в капилляроподобные структуры не было отмечено существенных различий между культурами МСК, инкубируемыми при 5% 02 и 20% 02

Для сравнительного определения экспрессии цитоплазматического HIF-1 —, клетки инкубировали при различном содержании кислорода (1, 5 и 20%) в течение 24 ч. или 7 сут. В результате цитофлюориметрическо-го анализа исследуемых культур МСК, инкубированных в нормоксии и гипоксии в течение 24 ч., были выявлены различия в уровне экспрессии HIF-1—, зависящие от концентрации кислорода в среде. В нормоксических культурах число клеток с выявляемым в цитоплазме HIF-1 — сильно варьировало в зависимости от пассажа клеток и составляло от 13 до 75 % популяции. Экспозиция при 5% 02 в течение 24 ч. снижала число клеровали от 5 до 50% популяции (рис. 4). Снижение до 1% 02 в среде приводило к понижению доли клеток, экспрессирующих исследуемый транскрипционный фактор до критически низких значений.

Аналогичное уменьшение числа клеток, экспрессирующих HIF-1 — было установлено в 7-суточных культурах МСК, экспонированных при 1 и 5% 02 (рис. 5). В популяциях МСК, культивированных в течение 7 сут. при 20% 02 наблюдали высокий уровень числа клеток, экспрессирующих HIF-1—, сопоставимый с показателями 24-часовой экспозиции, который составлял от 24 до 85%, в зависимости от пассажа МСК. Понижение содержания кислорода в среде сопровождалось снижением числа клеток с экспрессией HIF-1—. Доля клеток, экспрессирующих HIF-1 — при культивировании в среде, содержащей 5% 02, варьировала от 16 до 77%. При инкубировании клеток в течение 7 сут. при 1 % 02 отмечали снижение доли клеток, экспрессирующих HIF-1 — до 4%.

Обсуждение

Дифференцировочный потенциал является одной из определяющих функциональных характеристик МСК.

Индуцированная остеогенная дифференцировка приводила к появлению клеток, обладающих полигональной формой, продуцирующих минерализованный матрикс. Свойства изученных клеток, одновременно направленных по пути дифференцировки, в разной степени соответствовали приведенным признакам. Свидетельствующие о функциональной активности МСК костного мозга человека признаки остеогенной и адипогенной дифференцировки в значительной степени варьировали в зависимости от концентрации кислорода. Если в среде, содержащей 5% 02 наблюдалось понижение способности МСК к минерализации внеклеточного матрикса и накоплению липидных капель, по сравнению с таковыми при 20% 02, то в условиях 1% 02 МСК практически полностью теряли способность к минерализации матрикса и не могли успешно дифференцироваться в адипо-цитарном направлении, что, вероятно, свидетельствует о невозможности завершить фенотипическую трансформацию в условиях «жесткой» гипоксии.

На культурах МСК, остеобластов человека и имморта-лизованных остеобластоподобных клетках было показано, что в условиях пониженного содержания кислорода (0,2^2% 02) происходит снижение экспрессии ключевого для остеогенной дифференцировки транскрипционного фактора — Runx2. Как следствие этого продемонстрировано снижение образования «нодул» и минерализованных участков в культуре исследуемых клеток[17]. Ранее нами показано, что культивирование МСК из костного мозга крыс в среде с остеогенными стимулами при пониженном содержании кислорода (5% 02) приводит к снижению активности раннего маркера остеогенной дифференцировки — щелочной фосфатазы[18].

Т. Fink и соавт. при изучении адипогенного фенотипа МСК человека в условиях низкого содержания кислорода (1—2% 02) установили, что, несмотря на накопление липидов во внутриклеточном пространстве, эти процессы, свидетельствующие о приобретении клетками адипогенного фенотипа, не сопровождались увеличенной транскрипцией специфичных для адипоцитов факторов, таких как ADD1/SREBP1 с, PPAR-y2, аР2. Авторы отмечают также, что при определенных гипокси-ческих условиях МСК способны приобрести морфологию адипоцитарных клеток в отсутствие истинного адипогенного преобразования [19].

Потенциал МСК костного мозга человека не ограничивается только дифференцировкой по ортодоксальным направлениям. Имеющиеся в литературе данные свидетельствуют о том, что действие определенных ростовых факторов и химических индукторов вызывает дифференцировку МСК в нейроноподобные клетки [20, 21], гепатоциты [22], эпителиоциты легких [23]. Согласно данным М. Majumdar, МСК не только сами подвергаются различным дифференцировкам, но и способны регулировать дифференцировку других стволовых клеток, в частности, кроветворных [24]. В нашей работе при оценке способности МСК образовывать капилляроподобные структуры была доказана возможность этих клеток дифференцироваться в эндотелиальном направлении, успешно реализуемая и при пониженном содержании кислорода в среде. Необходимо отметить, что наряду с изменениями дифференцировочных способностей МСК в остеогенном и адипогенном направлениях при культивировании в течение 3 нед. в условиях пониженного содержания кислорода, показанными в нашем исследовании, при дифференцировке МСК в эндотелиальном направлении отчетливых различий не установлено. По-видимому, короткие сроки экспонирования МСК при различном содержании кислорода не позволили выявить отличительные особенности при формировании капилляроподобных структур.

Продемонстрированные уже через 24 ч различия — условиях подтверждают, что транскрипционный факторного системного ответа индуцирующих адаптивную рецитоплазматического пространства в ядро и гетероди-меризации с конститутивно экспрессируемой субъединицей HIF-1 р, образования транскрипционного активного комплекса и последующей транскрипционной активацией генов-мишеней [5, 8, 25]. В исследованиях с культурами клеток, так и условиях in vivo описывают переходловиях [26, 27]. Таким образом, можно предположить, относительно нормоксических условий, указывает на активацию данного транскрипционного фактора при пониженном содержании кислорода. Кроме того, известся убиквитин-протеасомальной деградации в реакциях пролил-гидроксилирования [9]. Высокая активность постарата и аспартата, которые проявляют при этом анти-оксидантные свойства и ограничивают свободнорадикальную активность. Исходя из этого, целесообразно допустить, что широкая вариабельность содержания — при пониженном содержании кислорода тесно сопряжена с регуляторным взаимодействием пролил-гидро-ксилазных реакций и сигнальными субстратами.

Таким образом, признаки, свидетельствующие о реализации дифференцировочных потенций МСК, в существенной степени варьировали в зависимости от концентрации кислорода. Если в среде, содержащей 5% 02, наблюдалось небольшое понижение способности МСК к минерализации внеклеточного матрикса и накоплению липидных капель по сравнению с таковыми при 20% 02, то в условиях 1% 02 МСК практически полностью теряли способность к минерализации матрикса и не могли дифференцироваться в адипоцитарном направлении. Не исключено, что эти процессы могут регулироваться за счет активации гипоксией индуцибельлирует работу множества генов, активирующих синтез ростовых факторов, гликолитических ферментов, проапоптотических белков.

Подняться вверх сайта