Поиск Кабинет

Влияние парциального давления кислорода на эффективность колониеобразования и дифференцировки мезенхимальных стромальных клеток человека, полученных из различных источников

Гены & Клетки: Том V, №4, 2010 год, стр.: 24-30

 

Авторы

Бурнаевский Н.С., Вишнякова Х.С., Сафенина А.В., Рыбалко Д.В., Попов К.В., Егоров Е.Е.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Изучали колониеобразование и дифференцировку культур мезенхимальных стромальных клеток, полученных из материала надкостницы (п=10), из губчатой кости (п=8) и из периодонтальной связки (п=3) человека в зависимости от парциального давления кислорода. Показано, что во всех случаях колониеобразование в условиях сниженного парциального давления кислорода (3%) идет более эффективно, чем в условиях атмосферного кислорода (21%). Из трех вариантов мезенхимальных стромальных клеток, колонии наибольшего размера давали клетки надкостницы. Остеогенная дифференцировка клеток, напротив, шла более интенсивно в условиях атмосферного кислорода. Интенсивность остеогенной дифференцировки наблюдали в монослое на пластике и в трехмерной культуре на коллагеновых каплях. Показано, что эффект снижения парциального давления кислорода на колониеобразование частично обусловлен изменением редокс-потенциала среды культивирования. В условиях сниженного количества кислорода редокс-потенциал среды снижается примерно на 20 мВ и его искусственная коррекция позволяет увеличить эффективность колониеобразования в условиях атмосферного кислорода.

В настоящее время во всем мире ведется много работ, направленных на изучение возможности использования клеточных технологий в медицине. В клиниках уже проводятся операции по лечению кожных повреждений при помощи культур аутологичных фиб-робластов и мезенхимальных стволовых клеток[1—3].

Многие исследователи предполагают, что с помощью культур стволовых клеток можно будет лечить заболевания самого различного происхождения, связанные с деградацией или повреждением той или иной ткани, — инфаркт миокарда, остеохондроз, нейроде-генеративные заболевания, ишемические состояния[4-7].

К сожалению, получение клеточных культур из первичного материала и ведение их in vitro сопряжено с различными трудностями, связанными не только с подбором питательных сред и субстратов. Содержание кислорода в атмосфере[21%] много больше, чем его содержание в тканях организма. Уровень кислорода в артериальной крови составляет примерно 15%, в венозной крови — 5%, в ткани хряща может составлять около 1%[8, 9].

Повышенное количество кислорода в условиях in vitro может весьма разнообразно сказываться на поведении клеток. Это действие может проявляться в избыточном повреждении клеток активными формами кислорода, в изменении работы ряда генов, которые зависят от концентрации растворенного кислорода, изменении конформации и, следовательно, активности ряда белков, изменении энергетического обмена и т. д. Особо стоит отметить роль окислительно-восстановительного (редокс) потенциала культуральной среды, который активно изменяется самими клетками и на который влияет концентрация растворенного кислорода.

В представленной работе показано, что снижение концентрации кислорода в газовой среде с 21 % (уровня кислорода в воздухе) до 3% усиливает колоние-образование, но тормозит остеогенную дифференци-ровку всех изученных (п=21) культур мезенхимальных стромальных клеток, полученных из тканей ротовой полости человека. Обсуждается возможная роль изменения редокс-потенциала среды культивирования, как одного из механизмов реализации действия низких концентраций кислорода.

Материал и методы

Клетки. Первичные культуры мезенхимальных стромальных клеток (МСК) человека, полученные по стандартной методике с применением коллагеназы[10], были любезно предоставлены А.А. Докторовым (НИЦБМТ ВИЛАР). Культуры были получены из фрагментов кости (КО) (п = 8) (стенка альвеол верхней или нижней челюсти), надкостницы (НК) (п=10) и из периодонтальной связки (ПС) (п = 3) человека. Исходным материалом послужили фрагменты тканей, удаляемых в ходе стоматологических операций, не связанных с инфекционно-воспалительными процессами. Клетки культивировали в среде DMEM (ПанЗко, Россия), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) (HyClone) и 40 ед/мл гентамицина при 37°С, в атмосфере, содержащей 5% С02 и различные концентрации кислорода (3% или 21%). Для изменения концентрации кислорода клетки культивировали в специализированном термостате (Thermo Forma, model 3131, США). По достижении клетками монослоя их рассеивали в два раза с помощью растворов трипсина и Версена (ПанЗко, Россия).

Фибробласты 1608hTERT были получены ранее[11] и представляют собой результат введения гена каталитического компонента теломеразы (hTERT) в штамм диплоидных фибробластов 1608, полученных из кожи взрослого донора. Эти клетки бессмертны, обладают теломеразной активностью и имеют удлиненные теломеры. Культивировали их в тех же условиях, что и МСК.

Колониеобразование. Осуществляли, как описано Егоровым и соавт. в[12]. Работали с клетками от четвертого до шестого пассажа. В пластиковые 10 см чашки Петри (Costar, США) высевали по 150 клеток (подсчет производили в камере Горяева) и культивировали в среде DMEM («ПанЗко»), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки («Hyclone») и 40 ед./мл гентамицина, при 37°С, в атмосфере, содержащей 5% С02, 3 или 21% кислорода. Через 7 дней клетки фиксировали и окрашивали (70% этанол, 0,1% метиленовый синий).

Производили подсчет колоний и количества клеток в колониях. Под термином «колония» мы понимаем любое количество клеток, идентичных одной исходной предшественнице, в том числе и всего одну клетку, которая в общепринятой номенклатуре является лишь колониеобразующей единицей. Каждую чашку закрепляли на листе бумаги с нарисованной сеткой. Изображения анализировали с помощью стереомикроскопа МБС-9 (СССР). На листе бумаги с увеличенным изображением сетки отмечали положение колоний и количество клеток в них. Количество клеток считали округленно по разрядам двоичной системы. Например, если группа клеток состояла из трех или четырех клеток, то записывали 4, если в группе было от 5 до 8 клеток — 8, если от 128 до 256, то записывали 256. Из полученных таким образом данных вычисляли суммарное количество клеток, выросших в одной чашке. На одну экспериментальную кривую распределения колоний по размерам подсчитывали от трех до шести чашек, после чего данные усредняли.

Индукция остеогенной дифференцировки. Для индукции дифференцировки к монослою клеток добавляли ростовую среду, содержащую: дексаметазон (0,1 мкМ), бета-глицерофосфат (10 мМ) и фосфат L-аскорбиновой кислоты (100 мкМ). Среду меняли каждые три дня. Через 2 или 3 недели клетки фиксировали раствором 4% формальдегида в фосфатном солевом буфере 10 мин при комнатной температуре.

Формирование гелевых капель. Раствор коллагена (из хвостов крыс) в уксусной кислоте был любезно предоставлен З.Б. Дашинимаевым (ИБР РАН). Полимеризацию геля вели парами NH40H. Капли геля по 10^20 мкл наносили в 6-луночные планшеты (Costar, США). После этого планшеты помещали на 100^120 мин в эксикатор емкостью 4 л с парами аммиака. Для этого 5 мл 25% NH40H наливали на бумажную салфетку, которую клали в эксикатор. Контроль полимеризации геля проводили визуально. Гель не должен перетекать при наклонах планшета. После полимеризации в лунки планшетов добавляли по 2 мл среды DMEM и инкубировали в течение 24 ч при температуре 37°С. После еще одной смены среды лунки были готовы для посева клеток.

Измерение редокс-потенциала. Измерения проводили с помощью редокс электрода модели 96-78 (Orion Research Inc., США), подключенного к цифровому мультиметру OP-211/1 (Radelkis, Венгрия). Электрод в специальном держателе постоянно находился внутри термостата. Его опускали на несколько миллиметров в культуральную среду в чашке Петри (Costar, США), расположенную в термостате. Редокс-потенциал фиксировали через 15 мин, чтобы исключить изменения, вносимые процедурой открывания дверцы термостата. Для искусственного изменения редокс-потенциала среды использовали дитиотреи-тол (Sigma, США).

Гистологическая окраска. Для выявления минерализованного матрикса клетки окрашивали при комнатной температуре в течение 10 мин 2% раствором Ализаринового красного pH 4,1—4,3. Клетки фотографировали в «мокром» состоянии сразу после окрашивания с помощью инвертированного фазовоконтрастного микроскопа Diaphot (Nikon, Япония) и цифровой камеры Nikon D70.

Результаты

Колониеобразование. Как видно из рис.1, во всех исследованных случаях (п = 21) снижение содержания кислорода в атмосфере до 3% усиливает колониеобразование. Во всех случаях мода распределения сдвигается вправо на одно-три удвоения, при снижении концентрации кислорода уменьшается доля неделящихся клеток. Практически всегда (в 20 случаях из 21) увеличивается максимальный размер колоний (рис. 1). Эффект проявляется в равной степени для всех трех типов клеток — мезенхимальных стро-мальных клеток (МСК) из надкостницы, кости и периодонтальной связки.

В среднем МСК из надкостницы обладали наибольшей способностью к колониеобразованию, по сравнению с МСК из кости и периодонтальной связки (рис. 2). Клетки, полученные из разных тканей одного пациента, различались достаточно сильно. Например, НК-10 давали колонии с количеством клеток почти в два раза большим, чем К0-10, которые, в свою очередь, правосходили ПС-1 Он и ПС-10в (рис. 2). При этом клетки пациента 7 (ПС-7 и НК-7) давали колонии сходного размера.

Остеогенная дифференцировка. Опыты показали, что все исследованные культуры МСК обладают способностью к остеогенной дифференцировке. Обнаруженные различия в интенсивности дифференцировки не позволили выявить закономерную разницу в зависимости от источника ткани. Хорошо выраженные костные узелки, видимые невооруженным глазом и массовое накопление минерализованного матрикса наблюдали начиная со второй недели (рис. ЗВ). Костная дифференцировка в условиях 3% кислорода во всех исследованных случаях (п = 21) происходила медленнее, чем в условиях атмосферного кислорода и к контрольному сроку достигала меньшей интенсивности (рис. ЗА, Б).

Была предпринята попытка ускорить процесс выявления дифференцировки. Для этого клетки высевали на предварительно сформированные капли коллагенового геля. В этом случае, уже через две недели можно было наблюдать выраженное накопление минерализованного внеклеточного матрикса, свидетельствующего о дифференцировке Срис. ЗП. Как и при дифференцировке на пластике, дифферен-цировка на гелевых каплях шла более интенсивно в условиях атмосферного кислорода Срис. ЗП. Сравнение верхнего и нижнего ряда лунок на рис. ЗГ ясно показывает, что дифференцировка на гелевых каплях идет существенно быстрее.

Редокс-потенциал и колониеобразование. Одним из механизмов влияния кислорода на поведение клеток могут служить опосредованные кислородом изменения редокс-потециала среды. Прямое измерение редокс-потенциала среды показало его снижение примерно на 20 мВ в условиях 3% кислорода по сравнению с атмосферными условиями. Было решено снизить редокс-потенциал в условиях атмосферного кислорода с помощью восстанавливающего агента дитиотреитола СДТП и провести опыты по колоние-образованию.

Из рис. 4 видно, что добавление ДТТ в концентрации 10 мкг/мл сдвигает редокс-потенциал более чем на 25 мВ. Однако уже через 24 ч после добавления ДТТ редокс-потенциал восстанавливается почти до исходного уровня. В связи с этим, мы решили провести опыты по колониеобразованию с повышенной до 30 мкг/мл концентрацией ДТТ, что сдвигает редокс-потенциал до 100 мВ.

На рис. 5 представлены результаты этого эксперимента. ДТТ очень сильно стимулировал колониеобразование клеток 1608hTERT. Максимальный размер колоний увеличился в 8 раз Сс 128 до 1024], доля одиночных клеток упала с 42% до 16%, суммарное количество клеток возросло примерно в 19 раз Сс 453 до 8576]. Более того, возросло общее количество колоний: в контроле оно составило 106±14, в присутствии ДТТ 147±11 (достоверность различия 1,64ст или 90%).

Обсуждение

Традиционные методы культивирования клеток не учитывают того, что в организме кислорода значительно меньше, чем в окружающем воздухе, который содержит около 21% кислорода. В альвеолах концентрация кислорода падает до 15%, в венозной крови его концентрация составляет примерно 5%, а в тканях и того меньше — всего несколько процентов. Известно, что в костном мозге концентрация кислорода варьирует от 1 до 7%[13]. Культивирование в условиях газовой смеси, содержащей 3% кислорода было выбрано нами как модель, соответствующая некоторому среднетканевому уровню кислорода.

Полученные результаты по усилению колониеобразования соответствуют данным литературы и нашим собственным. Ранее нами было показано усиление колониеобразования различных клеток в условиях 3— 5% кислорода[13—18].

Механизм влияния сниженного содержания кислорода на клетки остается не совсем ясным. С одной стороны существует известный кислородо-зависимый регулятор активности многих генов — HIF-1[19, 20]. Авторы по большей части приписывают обнаруженные явления изменению транскрипции многих генов, имеющих в своем составе специфическую последовательность HRE (HIF-response element). Однако диапазон концентраций кислорода, в котором активируется HIF-1, лежит значительно ниже использованных в работе. Максимальную активность HIF-1 приобретает при концентрации кислорода около 0,5%[21].

По самому названию HIF-1 (фактор, индуцируемый гипоксией) активируется при гипоксии, т.е. когда концентрация кислорода резко падает до уровней ниже 1%. Мы же проводили работу в условиях среднетканевого содержания кислорода, в нормальных, с точки зрения физиологии, условиях, а не изучали гипоксический ответ.

Одним из возможных объяснений улучшения роста клеток при сниженной концентрации кислорода может считаться уменьшение окислительного повреждения клеток. Давно известно, что повышение концентрации кислорода (гипероксия) приводит к развитию окислительного стресса, увеличению количества разрывов в ДНК, в том числе и особенно в теломерной ДНК[22]. Аналогично можно предположить, что снижение концентрации кислорода должно уменьшать окислительное повреждение. Известно, что некоторые линии клеток, в том числе известный штамм фибробластов человека WI-38, способны к иммортализации только в условиях сниженного кислорода[23]. В условиях 3—5% кислорода экспрессия теломеразы приводит к иммортализации этих клеток, в то время как в условиях атмосферного кислорода экспрессия теломеразы лишь незначительно увеличивает их пролиферативный потенциал. Аналогичные данные были получены нами при иммортализации мезенхимальных стромальных клеток человека, выделенных из материала ли-посакции[16]. Клетки становились иммортальными только в условиях сниженного содержания кислорода.

Однако прямое измерение продукции активных форм кислорода в клетках указывает, что при снижении концентрации кислорода в клетках увеличивается продукция супероксид-аниона и перекиси водорода. Вопрос крайне запутан и нуждается в дальнейших исследованиях[24, 25], которые должны показать, каким образом повышенная продукция различных окислителей (активных форм кислорода, азота, радикалов) может сочетаться с уменьшением повреждения клеток. Одним из объяснений, базирующихся на последних данных является то, что количество активных форм кислорода при снижении уровня кислорода является отражением усиления общего уровня клеточного сигналинга, сопряженного с продукцией супероксид-аниона НАДФН-оксидазами и поэтому не является достаточным признаком окислительного стресса[26, 27]. Косвенно на такую возможность указывает работа, показавшая, что снижение уровня кислорода не изменяет скорость укорачивания тело-мер. Клетки при этом вступают в репликативное старение имея более короткие теломеры. Возможно этот эффект связан с усилением положительного для пролиферации сигналинга[28].

Одним из факторов, которые в подавляющем большинстве случаев не принимаются во внимание, является окислительно-восстановительный потенциал (редокс-потенциал) среды культивирования. Этот потенциал отражает доступность (недоступность) электронов в среде для разнообразных, в том числе полностью обратимых окислительно-восстановительных реакций. В данном случае особый интерес представляют реакции с участием цистеина и метионина. Окисление-восстановление цистеина в большинстве случаев проявляется как образование-разрушение дисуль-фидных связей. Цистеиновые остатки входят в состав активных центров многих ферментов, они обеспечивают связывание различных белковых субъединиц друг с другом. В общем виде возникновение-разрушение дисульфидных связей меняет конформации белков, что неизбежно ведет к изменению их функций[29].

Логично предположить, что для прохождения определенных клеточных процессов (пролиферация, дифференцировка, апоптоз) требуются вполне определенные окислительно-восстановительные условия[30], способствующие или препятствующие взаимодействию чувствительных цитокинов с рецепторами.

Поскольку кислород является окислителем, то снижение его уровня, безусловно, должно сдвигать редокс-потенциал среды в сторону восстановления. Прямое измерение показало, что редокс-потенциал среды снижается примерно на 20мВ. Мы решили химически (с помощью восстановителя) понизить ре-докс-потенциал среды культивирования и изучить, как это влияет на колониеобразование. Снижение редокс-потенциала на 20 мВ обеспечивается добавлением в среду ДТТ в концентрации около 10 мкг/мл. Однако при инкубации этой восстановленной среды в течение суток (без клеток) мы наблюдали медленное окисление среды (данные не приведены). Поэтому для опыта, длящегося неделю, была выбрана повышенная концентрация ДТТ (30 мкг/мл). Ранее нами было показано, что ключевыми при колониеобразовании являются условия первых дней. Колонии, достигая определенного размера (примерно 16 клеток), имеют тенденцию в дальнейшем к устойчивому росту[18]. Таким образом, концентрация в 30 мкг/мл ДТТ обеспечивает восстановление среды культивирования в первые критические дни опыта.

В результате проведенных экспериментов мы убедились, что колониеобразование при добавлении ДТТ усилилось даже в большей степени, чем при действии пониженной концентрации кислорода. Помимо усиления колониеобразования мы зафиксировали повышенную выживаемость клеток (Р=90%). Это соответствует положению о том, что окисление среды повышает вероятность апоптоза[30, 31].

Подбор редокс-потенциала среды особенно важен именно при клонировании клеток. Клетки способны эффективно регулировать редокс-потенциал среды, поглощая и секретируя цистеин или цистин[32]. При очень редком посеве мощности биосинтетических процессов не хватает для подобной модификации среды, которая остается непермиссивной для пролиферации, несмотря на формальное наличие в ней разнообразных факторов роста.

Таким образом, одним из механизмов влияния сниженного содержания кислорода на клетки, является снижение редокс-потенциала среды. Ранее исследователи часто вводили в состав культуральной среды цистеин, p-меркаптоэтанол или ДТТ и наблюдали улучшение колониеобразования[33].

С современных позиций подобные эффекты объясняются изменением редокс-регуляции. Подобные эффекты могут играть ключевую роль в чувствительности клеток к уже имеющимся факторам роста, которые, находясь в неправильной конформации, неспособны к индукции сигналинга. Полагают, что регуляция пролиферации различных иммунных клеток в организме опосредуется локальными, индуцированными клетками-регуляторами, изменениями редокс-потенциала среды[34, 35]. Для ознакомления с основами ре-докс-регуляции можно рекомендовать следующие обзоры[29, 36—38].

Влияние кислорода на дифференцировку также, возможно, опосредовано редокс-регуляцией, однако у нас нет данных это подтверждающих. Из общих соображений ясно, что остеогенная дифференцировка, поскольку является одним из компонентов чрезвычайной реакции организма на перелом кости, должна происходить в местах с богатым кровоснабжением, с относительно высоким уровнем кислорода. Эти же соображения позволяют объяснить факт того, что клетки, полученные из надкостницы, обладают самой высокой способностью к колониеобразованию (см. рис. 2). Известно, что клетки надкостницы вносят существенный вклад в заживление переломов[39]. Этими доводами можно объяснить наши результаты показавшие, что остеогенная дифференцировка тормозится при низком содержании кислорода.

Полученные данные вполне коррелируют с литературными. Было показано, что условия трех процентов кислорода тормозят остеогенную дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток человека[13, 40— 42]. Известно, что даже кратковременная глубокая гипоксия способна на длительный срок снижать экспрессию остеогенных факторов в таких клетках[43].

Таким образом, культивирование разнообразных клеток при сниженном уровне кислорода (3%) ускоряет их пролиферацию. Другими словами, в таких условиях можно получить во много раз больше клеток из одинакового начального количества, но главное можно получить значительное количество более молодых, способных к пролиферации клеток, которые безусловно способны оказать более значительный терапевтический эффект при введении в организм. Вторым практическим выводом из данной работы может быть использование химических соединений для восстановления редокс-потенциала среды культивирования. Особую важность этот вопрос имеет в случаях клонирования клеток.

Работа поддержана грантом Российского фонда фундаментальных исследований 09-04-01071 а и государственным контрактом П1293 Федерального Агентства по Образованию. Авторы выражают благодарность А.А. Докторову за предоставление культур клеток и Э.Б. Дашинимаеву за предоставление коллагенового геля.

Подняться вверх сайта