Поиск Кабинет

Влияние мезенхимальных стромальных клеток и мобилизации стволовых клеток костного мозга на развитие нефросклероза

Гены & Клетки: Том V, №2, 2010 год, стр.: 68-74

 

Авторы

Белогородцев С.Н., Шварц Я.Ш., Филимонов П.Н., Селедцова Г.В.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

В экспериментах на мышах в модели хронического рабдо-миолизного поражения почек исследовалось влияние трансплантации сингенных мультипатентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) и мобилизации гемопоэтических клеток костного мозга (КМ] на течение нефропатии. Показано, что оба этих воздействия улучшают экскреторную функцию почек и препятствуют фибросклеротической трансформации почечной ткани. В то же время, трансплантация ММСК практически не влияет на выраженность мононуклеарной инфильтрации почек и на цилиндрообразование, но супрессирует системные провоспалительные реакции. Мобилизация КМ значительно увеличивает моноцитарную инфильтрацию и образование цилиндров, но практически не влияет на провоспа-лительную реактивность иммунной системы. Сделан вывод о высокой перспективности обоих подходов для разработки новых методов лечения хронических прогрессивных нефропатий.

Нефросклероз (НС) является универсальным и необратимым морфологическим признаком разнообразных хронических поражений почек, во многом определяющим прогноз и исход заболевания[1, 2]. Участие в развитии НС большого количества этиологических и патогенетических факторов, разнообразие молекулярных механизмов, часто на фоне продолжающегося воздействия патогена, приводит к низкой эффективности лекарственной терапии[2—5]. В связи с этим, продолжаются исследования, направленные на разработку качественно новых подходов к лечению склеро-зирующих заболеваний почек, в том числе с использованием методов клеточных биотехнологий.

Трансплантация мультипатентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) костного мозга оказывает положительное воздействие на функцию и морфологию почек в экспериментальных моделях острой почечной недостаточности[6—10]. В отношении хронического поражения почек мнения об эффектах трансплантации ММСК не столь однозначны. Некоторые авторы полагают, что за счет выработки гепатоцитарного фактора роста, инсулиноподобного фактора роста 1, эпидермального фактора роста и пр.[8—10], а также, возможно, непосредственного хоуминга и трансдифференцировки в тубулярные эпителиоциты[7, 11, 12], можно объяснить благоприятное действие ММСК на регенерацию почки. Другие исследователи подчеркивают возможность ММСК трансдифференцироваться в миофибробласты, вырабатывать профиброзные факторы роста и потенцировать склеротические процессы в почке[3, 13].

Многочисленными исследованиями роли неспецифического иммуновоспалительного ответа в остром поражении почек показана способность рекрутированных в орган клеток иммунной системы генерировать активные формы кислорода и азота, секретировать провоспалительные медиаторы и цитокины, лизосо-мальные гидролазы и пр., тем самым вызывая вторичную альтерацию и деструкцию почечной паренхимы[14—17]. Однако на фоне текущего склеротического процесса выход в межклеточный матрикс активных металлопротеиназ может замедлять депонирование коллагена в интерстиции[3, 18]. В этих условиях влияние ММСК, обладающих иммуномодулирющими свойствами[19, 20], остается в значительной степени невыясненным.

Мобилизация костного мозга (КМ) приводит к выходу в периферическую кровь, кроме стволовых клеток, большого количества клеток-предшественниц лимфоцитарного и миелоидного ростков[21—23]. Поступая в очаг «хронического воспаления», клетки специфической и неспецифической иммунной системы способствуют альтерации и могут препятствовать развитию фиброза.

Но все эти теоретические соображения нуждаются в экспериментальном подтверждении. В связи с этим, в настоящем исследовании мы изучили влияние трансплантации аутогенных МСК и мобилизации КМ на функцию почек и развитие склеротических процессов на модели хронического поражения почек.

Материал и методы

Исследование было проведено на 36 линейных мышах C57BI/6 возрастом 3^4 мес. и весом 18^20 г. Хроническое поражение почек индуцировали трехкратным внутримышечным введением 50% глицерола в дозе 4,6 мг/кг с интервалом в 7 сут. Получаемый при этом рабдомиолиз оказывает смешанное (ишемическое, токсическое, ретенционное) воздействие на почки, с преимущественным поражением эпителия проксимальных канальцев[24—26]. В предварительных экспериментах мы показали, что подобное воздействие вызывает стойкое, хотя и незначительное, повышение уровня мочевины в сыворотке крови и разрастание соединительной ткани, преимущественно в интерсти-ции. Все эксперименты на животных проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу М3 СССР № 755 от 1977 года).

ММСК получали из костного мозга сингенных мышей путем адгезии к культуральному пластику[6—8]. Костный мозг, полученный из бедренных и большеберцовых костей, суспендировали в RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, США) с 10% инактивированной сыворотки плодов коров (HyClone, Н. Зеландия). Строму костного мозга разрушали механическим способом стеклянным гомогенизатором, дважды отмывали и помещали в культуральные чашки (Corning, USA) в полной среде на основе RPMI 1640. Неприлипающую фракцию клеток костного мозга удаляли при сменах культуральной среды, начиная с 3-х сут. МСК имели классический фибробластоподобный фенотип и образовывали сплошной монослой к 4 нед. культивирования. Снятие ММСК проводили 0,25% раствором версен-трипсина (БиолотТ, Россия), дважды отмывали от культуральной среды и ресуспендировали в физиологическом растворе. Внутривенное введение клеток осуществляли в ретроорбитальный синус в количестве 1 млн на мышь в 200 мкл физиологического раствора на 26 сут. эксперимента (через 12 сут. после последней инъекции глицерола).

Мобилизацию клеток костного мозга осуществляли с 26-х сут. эксперимента в течение 7 сут. В первые 5 сут. ежедневно подкожно вводили 20 ЕД GM-CSF и 2 ЕД эритропоэтина (Sigma-Aldrich, USA), затем 2 сут. — 2 ЕД эритропоэтина[21, 22].

В качестве контроля использовали группу мышей, которым вместо глицерола аналогичным образом вводили физиологический раствор.

Выведение мышей всех групп проводили путем дислокации шейных позвонков на 38-е сут. эксперимента. Функцию почек оценивали по уровню мочевины сыворотки крови.

Морфологические изменения почечной ткани оценивали полуколичественно, преимущественно в кортикальной зоне. Для этого на гистологических срезах толщиной 5^7 мкм, окрашенных гематоксилином и эозином, определяли выраженность мононуклеарной инфильтрации (по 4-балльной шкале: 0 — отсутствует, 1 — слабая, 2 — умеренная, 3 — значительная) и образование цилиндров (по 3-балльной шкале: 0 — отсутствуют, 1 — умеренное количество, 2 — большое количество). Выраженность фиброзирования в гломерулярном и интерстициальном компартментах оценивали на срезах, окрашенных сириусом красным, с использованием 4-балльной шкалы (0 — количество коллагена визуально соответствует нормальной почке, 1 — в склеротическую трансформацию вовлечено до 10 % почечной ткани/клубочков, 2 — до 25%, 3 — до 50% и более). Препараты исследовали двойным слепым методом (при морфологической оценке и статистической обработке не имели информации о группе животных и способе воздействия), оценивали не менее 10 полей зрения, выбранных случайным образом, при увеличении х400. Результаты подсчитывали как среднее значение исследуемого показателя в каждой экспериментальной группе.

Провоспалительную коммитированность иммунной системы оценивали по продукции окиси азота (N0) перитонеальными макрофагами[26, 27]. Для этого использовали клетки перитонеального лаважа. Макрофаги выделяли путем прилипания к пластику при культивировании в 24-луночном планшете в бессы-вороточной среде RPMI 1640 в течение 24 ч. После удаления неадгезировавшихся клеток, макрофаги дополнительно культивировали еще 48 ч в присутствии или без добавления 100 нг/мл ЛПС. Продукцию N0 оценивали по аккумуляции нитритов в культуральной среде колориметрическим методом с использованием реактива Гриеса. Последний готовили ex temporo, смешивая равные объемы 1 % сульфаниламида в 30% уксусной кислоте и 0,1% N-(1-нафтил)этилендиамид дигидрохлорида в 60% уксусной кислоте. Культуральную среду от каждого образца смешивали в равных объемах с реактивом Гриеса в 96-луночном планшете, светопоглощение при длине волны 570 нм оценивали с помощью микропланшетного ридера LB 941 TriStar. Концентрацию нитритов вычисляли с использованием стандартной калибровочной кривой.

Результаты представлены в виде среднего арифметического и его стандартного отклонения. В связи с отсутствием нормального распределения (тест Колмогорова — Смирнова), различия в группах определяли с использованием критерия Манна — Уитни, и считали статистически значимыми при р<0,05.

Результаты

В группе с глицерол-индуцированным рабдомиоли-зом на 38-е сут. эксперимента отмечалось повышение уровня мочевины сыворотки крови (7,86+0,6 против 6,1+1,0 мМоль/л у интактных мышей, р<0,05). В группах животных, которым выполняли трансплантацию МСК (Гл + ММСК), либо мобилизацию КМ (Гл + КМ), содержание мочевины сыворотки было на мМоль/л соответственно) и отличалось (р<0,05) от этого показателя группы с глицеролом (Гл) (рис. 1).

Полученные результаты по исследованию нарушений функции почек подтвердились данными гистологического исследования. Трехкратное внутримышечное введение глицерола вызывало выраженные фиброзные измененияв межканальцевом интерстиции и в пери-васкулярных зонах. Отмечены также признаки гломе-рулосклероза (рис. 2Б) в части клубочков. В группах животных, которым выполняли трансплантацию ММСК, либо мобилизацию КМ, наблюдали качественно иную картину (рис. 2В и 2Г): избыточный коллагеногенез был слабо выражен и локализовался преимущественно в перитубулярной зоне; в целом гистологическая картина была сходна с таковой у интактных мышей (рис. 2А).

При изучении характера распределения и клеточного состава инфильтратов почечной ткани, а также канальцевых повреждений выявлено следующее (рис. 3). В группе с трехкратным внутримышечным введением глицерола на 38-е сут. отмечалась умеренная диффузная и очаговая мононуклеарная инфильтрация интерстиция почек. Гранулоцитов на этом сроке эксперимента практически не наблюдалось. Канальцевые повреждения у животных всех групп были представлены практически исключительно плотными цилиндрами в просветах части собирательных трубочек, дистрофические изменения эпителия были минимальными и не различались между группами. Трансплантация ММСК не влияла на инфильтрацию и цилиндрообразование: их выраженность была выше, чем у интактных мышей, но не отличалась от группы рабдомиолизного контроля. В то же время в группе с мобилизацией КМ обнаружена значительная очаговая инфильтрация, преимущественно в интерстиции коркового слоя почки. Соответственно, больше было и количество цилиндров.

О функциональном состоянии иммунной системы судили по спонтанной и ЛПС-стимулированной продукции окиси азота перитонеальными макрофагами (рис. 4). Было установлено, что в контрольной (бес-клеточной) инкубационной среде уровень нитритов был недетектируемым, а уровень спонтанной генерации N0 перитонеальными макрофагами во всех группах животных был на низком уровне (от 4,9 до 10,5) и статистически не различался между группами.

Стимуляция макрофагов ЛПС приводила к росту продукции N0 в группах интактных мышей и мышей с рабдомиолизом до 79,6 мкг/5х10s клеток и 87,3 мкг/ 5x10s клеток соответственно, причем разница между этими группами не значима. Трансплантация ММСК вызывала снижение ЛПС-стимулированной продукции N0 в 2,5 раза по сравнению с интактным контролем и в 2,7 раза по сравнению с рабдомиолиз-контролем (р<0,05).

В то же время ЛПС-стимулированная генерация N0 в группе с мобилизацией КМ не отличалась от таковой в обеих контрольных группах.

Обсуждение

В настоящей работе продемонстрировано, что и трансплантация ММСК, и мобилизации КМ в модели хронической глицерол-идуцированной рабдомиолизной нефропатии вызывают улучшение функции почек и отчетливое уменьшение фиброзных изменений. Принципиально данное явление можно объяснить двумя различными механизмами — хоумингом и трансдиффе-ренцировкой введенных клеток, либо цитокин-опосре-дованным влиянием на микроокружение в ткани почки. В отношении хоуминга ММСК в поврежденные ткани и их последующей трансдифференцировки в последнее время высказывается много сомнений[6, 8—10]. Но именно на модели рабдомиолизного поражения с использованием различных меток были получены отчетливые доказательства возможности такого явления[11]. В моделях ишемии-реперфузии и токсического воздействия на почку трансплантированные ММСК появлялись в почке только транзиторно в первые часы после введения[6, 10]. Тем не менее, трансплантация ММСК оказывала отчетливое положительное влияние как на морфологию, так и на функцию почек. При более детальном изучении в этих исследованиях было обнаружено усиление пролиферативной активности и уменьшение апоптоза резидентных тубулярных эпите-лиоцитов, что нашло свое объяснение в активной продукции ММСК факторов роста и цитокинов с пролиферативным, антиапоптотическим и ангио-васкулоген-ным действием.

Мы предполагаем, что в наших экспериментах действуют оба этих механизма, однако для проверки данного предположения необходимы дальнейшие исследования. Следует отметить, что показанные в настоящей работе антифиброзные эффекты ММСК свидетельствуют против мнения ряда авторов[3, 13] о возможной серьезной роли трансдифференцировки ММСК в ми-офибробласты при нефропатиях. В этом случае мы бы наблюдали усиление процессов фиброгенеза в почке.

Мнения об эффектах мобилизации КМ еще более противоречивы. В некоторых публикациях обсуждают потенциально благоприятное влияние выхода в кровеносное русло стволовых гемопоэтических клеток и их хоуминга[21, 23]. В других публикациях вероятность трансдифференцировки гемопоэтических клеток в почечные эпителиоциты вызывает еще больше сомнений, чем этот процесс в отношении ММСК. В то же время выход в циркуляцию большого количества гранулоци-тарных и моноцитарных клеток системы кроветворения вызывает потенцирование повреждающего воздействия на почки, что показано на различных моделях острой почечной недостаточности[22]. Изменения цитокинового спектра в ткани почки при мобилизации КМ изучены мало и только в моделях острого поражения. В модели хронического рабдомиолизного поражения почек нами обнаружено благоприятное воздействие мобилизации КМ на функцию и морфологию. Мы склонны объяснять этот феномен не хоумингом и трансдифференцировкой, а скорее усилением локальных провоспалительных реакций и выходом в почечное микроокружение протеолитических ферментов, в том числе металлопротеиназ, деградирующих депозиты коллагена.

Участие иммунной системы в патогенезе хронического поражения почек, с нашей точки зрения, заслуживает особого рассмотрения. Глицерол-индуцированная, а также, в меньшей степени, другие модели острого поражения почек, характеризуются местной неспецифической воспалительной реакцией и системным про-воспалительным ответом[26]. В предварительных экспериментах после однократного внутримышечного введения глицерола и заборе материала в ранние сроки мы обнаруживали выраженную гранулоцитарную инфильтрацию интерстиция почек, вплоть до формирования микроабсцессов. Между тем, участие клеток иммунной системы в патогенезе почечной патологии имеет фазовый характер. В модели, использованной в данной работе, на 38-е сут. эксперимента инфильтрация была выражена умеренно и состояла исключительно из мононуклеаров. На этом фоне трансплантация ММСК не влияла на инфильтрацию, а мобилизация КМ ее значительно усиливала. В то же время, оценка ЛПС-стимулированной продукции N0 перитонеальными макрофагами показала, что трансплантация ММСК снижает системную провоспалительную реактивность. Это согласуется с литературными данными об имму-носу-прессивном эффекте ММСК[19, 20].

Результаты данной работы позволяют утверждать, что и трансплантация ММСК, и мобилизация КМ — это крайне перспективные подходы к лечению хронических поражений почек, сопровождающихся нефрос-клерозом. Вместе с тем, очевидно, что необходимы дальнейшие исследования по изучению межклеточных взаимодействий и молекулярных механизмов, лежащих в основе этих эффектов.

Подняться вверх сайта