Поиск Кабинет

Влияние метаболитов Trichoderma asperellum на регенерацию тканей на фоне пирена

Гены & Клетки: Том VII, №3, 2012 год, стр.: 159-163

 

Авторы

Тухбатова Р.И.,. Абдельрахман А.А, Мухаметзянова А.С., Нгуен Т.Т., Хоанг Т.Л., Фаттахова А.Н., Алимова Ф.К.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

В работе проведено изучение влияния культуральной жидкости грибов рода Trichoderma на мышей линии Swiss Webster CFW после воздействия пирена – полициклического ароматического углеводорода, способного вызывать патологические изменения в организме. Показано благоприятное влияние метаболитов Trichoderma на гематологические показатели, функционирование печени и почек, выявлена тенденция к восстановлению структуры кожи и печени после нарушений, вызванных введением пирена.

В настоящее время существует потребность в новых биологически активных веществах, которые способны обеспечивать восстанавление клеток и тканей, подвергшихся воздействию вредных факторов окружающей среды [1]. Данная проблема особенно актуальна в экологически опасных районах страны, где в окружающую среду поступает большое количество загрязнителей.

Одним из таких токсичных загрязнителей, по данным National Oceanic and Atmospheric Administration USA (NOAA), является пирен [2]. Он образуется в результате различных процессов горения. Попадая в организм из окружающей среды, пирен способен накапливаться в почках и печени. Ранее проведенные исследования показали, что пирен может вызывать нефропатию, изменения в крови, а также отрицательно влиять на воспроизводство животных.

Несмотря на то, что за счет работ различных авторов накоплено большое количество данных по разным аспектам жизнедеятельности и функционирования грибов Trichoderma, являющихся продуцентами метаболитов широкого спектра действия, вопрос об их использовании в качестве медицинских агентов остается открытым. Исследования в этой области ведутся достаточно активно; постоянно обнаруживаются новые метаболиты с полезными свойствами, тем не менее их влияние на регенерацию тканей остается недостаточно изученным [3].

Материал и методы

Объектами исследования послужили самки аутбредных мышей линии Swiss Webster CFW, которые были получены нами из питомника лабораторных животных «Пущино». Окраска шерсти – белая. Животные содержались согласно международным этическим нормам, получали воду и корм ad libitum.

Исследуемые штаммы Trichoderma asperellum выращивали на жидкой среде Чапека в течении 7 сут. при 28°С на качалке со скоростью 128 об./мин. Методы, использовавшиеся в работе, обеспечивали полное отсутствие пропагул гриба – культуральную жидкость освобождали от мицелия фильтрацией (фильтры Millipore диаметром 0,22 мкм).

Влияние метаболитов Trichoderma на организм мышей изучали на фоне введения пирена по комплексу гематологических, гистологических, иммунологических и биохимических показателей. Макрогруппа из 25 мышей по принципу аналогов была разделена на 5 групп, которым вводили кондиционированную среду Trichoderma (1,25 мл/100 г живой массы) и пирен (5 мг/100 г живой массы). В контрольной группе мышам внутрибрюшинно в течение 14 сут. через каждые 24 ч вводили воду для инъекций. Мышам второй экспериментальной группы вначале вводили в течение 7 сут. через каждые 24 ч кондиционированную среду Trichoderma, затем в течение 7 сут. через каждые 24 ч – пирен. Третьей экспериментальной группе – в течение 7 сут. через каждые 24 ч вводили пирен, затем в течение следующих 7 сут. – кондиционированную среду гриба. Четвертая группа мышей была подвергнута действию пирена в течение 14 сут. Пятой группе животных инъецировали только кондиционированную среду Trichoderma в течение 14 сут. До принятия пищи ежедневным взвешиванием в течение 14 сут. определяли массу мышей. После окончания эксперимента у мышей путем взвешивания определяли массу отдельных органов (печени, почек и др.), после чего вычисляли отношение массы органов к общей массе тела.

Гематологические показатели включали определение количества эритроцитов, уровня гемоглобина, гематокрита, среднего объёма эритроцитов (MCV), среднего содержания гемоглобина в эритроцитах (MCH) и средней концентрации гемоглобина в эритроцитах (MCHC).

Подсчёт эритроцитов осуществляли с помощью камеры Горяева в физиологическом растворе (0,9% NaCl) [4]. Уровень гемоглобина определяли в соответствии с рекомендациями Международного Комитета Стандартизации в Гематологии [5], используя коммерческий набор Randox Company (Великобритания). Гематокрит определяли центрифугированием клеток в гепаринизированных гематокритных пробирках в течение 5 мин при 15,000 rpm [4].

Иммунологические показатели оценивали путем подсчета лейкоцитов с помощью камеры Горяева, согласно рекомендациям Dacie и Lewis [4], используя специальный раствор Тюрка, а также дифференцировали лейкоциты и определяли их количество.

Оценка биохимических показателей включала в себя тесты на функционирование печени (активность трансаминаз и количество общего билирубина) и почек (содержание мочевины и креатинина). Активность аланинаминотрансферазы (АлАТ) в сыворотке крови мышей определяли согласно методике Reitman и Frankel [6]. Сыворотка крови была получена на 14 день эксперимента. Для определения активности ферментов использовали коммерческий набор BioMerieux Chemical Company (Франция). Калибровочная кривая была построена по аланину. Активность сывороточной АсАТ измеряли аналогично аланинаминотрансферазе (АлАТ), используя коммерческий набор Randox Company (Великобритания). Концентрацию общего билирубина определяли, используя коммерческий набор BioMerieux Chemical Company (Франция). Количество общего билирубина определяли в реакции конъюгации с диазотированной сульфаниловой кислотой в присутствии кофеина [7]. Концентрацию мочевины определяли по реакции с мочевиноглутаматдегидрогеназой по методике Eisenweiner [8]. Содержание общего креатинина измеряли в реакции с пикриновой кислотой в щелочной среде с образованием окрашенного комплекса, поглощающего при длине 510 нм [9, 10].

На 15-е сутки животные выводились из эксперимента, после чего образцы кожи и внутренних органов (печень, почки) забирались для гистологического анализа. Гистологические препараты изготовливали по стандартной схеме [11], окрашивали гематоксилином и эозином и исследовали при помощи световой микроскопии.

Статистическую обработку результатов осуществляли общепринятыми методами с использованием стандартного пакета программ Microsoft Excel. Результаты представлены как средние арифметические со стандартным отклонением. Достоверность результатов определяли с использованием t-критерия Стьюдента (уровень р < 0,05).

Результаты и обсуждение

Как средство оценки статуса здоровья животных, ВОЗ рекомендовано исследование гематологических параметров, отражающих состояние гомеостаза организма. Нами было выявлено, что введение пирена способствует достоверному уменьшению количества эритроцитов в крови мышей экспериментальных групп, по сравнению с контролем (рис. 1), что вероятно свидетельствует о разрушении эритроцитов. Введение кондиционированной среды Trichoderma после пирена нивелировала действие последнего.

Гематокрит и содержание гемоглобина являются важными показателями гематологического статуса организма. На рис. 2 показано, что под влиянием пирена уровень гемоглобина у мышей достоверно увеличивался относительно контроля. У мышей, получавших только кондиционированную среду Trichoderma, уровень гемоглобина оставался на уровне контроля. Введение кондиционированной среды Trichoderma до введения пирена снижало его негативное влияние на уровень гемоглобина. Значения гематокрита у мышей всех опытных групп были ниже контрольных значений (рис. 3).

Было изучено действие пирена и метаболитов в КЖ Trichoderma на основные показатели функционирования печени, а именно: активность АсАТ (рис. 4А) и АлАТ (рис. 4Б), а также концентрацию билирубина (рис. 4В) в сыворотке крови. Отмечено, что введение мышам кондиционированной среды Trichoderma в течении 14 сут. не приводит к достоверным изменениям по этим показателям по сравнению с контрольными животными. Введение пирена вызывает достоверное увеличение в сыворотке крови активности АсАТ и АлАТ, а также концентрации билирубина, что может свидетельствовать о токсическом действии на печень. Следует отметить, что применение кондиционированной среды Trichoderma до пирена оказывает более благоприятное действие на морфофункциональное состояние печени по сравнению с вариантом введения мышам метаболитов Trichoderma после введения пирена. Это может указывать на то, что метаболиты Trichoderma, содержащиеся в кондиционированной среде, обладают гепатопротекторными свойствами.

Уровень креатинина в сыворотке крови и мочевины помогают оценить функционирование почек [12]. На рис. 5 представлено влияние пирена и кондиционированной среды Trichoderma на концентрацию мочевины и креатинина в сыворотке крови. При обработке мышей пиреном отмечено достоверное увеличение концентрации мочевины, что может служить подтверждением почечной недостаточности. После введения мышам кондиционированной среды происходила нормализация функции почек. Введение пирена и метаболитов Trichoderma не оказывало достоверного влияния на уровень креатинина в сыворотке крови.

В доступной нам научной литературе имеется мало данных относительно иммунных механизмов, запускаемых биологическими агентами после взаимодействия их с компонентами врождённого и адаптивного иммунных ответов. Так, введение пирена по сравнению с контролем достоверно увеличивало в организме мышей содержание лейкоцитов с одновременным изменением лейкоцитарной формулы: возрастала доля лимфоцитов, базофилов, эозинофилов и уменьшалась – нейтрофилов (рис. 6).

Безусловно, исследованных показателей недостаточно для объективной оценки воздействия пирена на иммунную систему, однако сделать вывод о наличии такого влияния они позволяют. После введения кондиционированной среды Trichoderma численность моноцитов и нейтрофилов в крови снижалась до уровня контрольных значений, т.е. действие пирена на организм было нивелировано.

На следующем этапе мы проводили гистологический анализ структуры кожи в области инъекций пирена, а также исследовали печень мышей. Под воздействием пирена толщина эпидермиса, по сравнению с контролем, уменьшалась примерно в 3 раза. Количество волосяных фолликулов на условную единицу площади среза также было значительно ниже (рис. 7А). У мышей, получавших кондиционированную среду Trichoderma до или после введения пирена, наблюдалось увеличение толщины эпидермиса, а также количества волосяных фолликулов (рис. 7Б), что может свидетельствовать о том, что происходит восстановление структуры эпидермиса кожи.

Через 7 сут. после введения пирена балочное строение долек печени было слабо выражено, на препаратах обнаруживались дольки в состоянии деструкции. Гепатоциты отличались небольшими размерами. Большая часть цитоплазмы была светло окрашена. Ядра в клетках мелкие, располагались экcцентрично, в них выявлялись мелкие ядрышки. Среди клеточных элементов долек отмечалось небольшое содержание двухъядерных гепатоцитов (22,2%). Клетки Купфера были малочисленны и имели мелкие ядра. Также в сосудистой системе печени были выявлены признаки застойной венозной гиперемии, которая характеризуется переполнением центральных вен, а также расширением и полнокровием синусоидальных капилляров преимущественно вокруг центральных вен (рис. 8А).

В печени мышей, получавших кондиционированную среду Trichoderma, отмечалось сохранение балочного строения. Гепатоциты, формирующие печеночные балки, различались по объему и форме, , многие из них имели более интенсивно окрашенную цитоплазму, чем у контрольных мышей. Гепатоциты имели средние размеры и ядро овальной формы с умеренным количеством хроматина, с одним, реже двумя мелкими ядрышками вблизи кариолеммы. Большинство гепатоцитов – двухядерные метатические активированные клетки (30,22%) (рис. 8Б). Также было отмечено увеличение размеров клеток Купфера и их численности. Заметно ослабевали признаки расстройства кровообращения в виде застойного полнокровия центральных вен и отека перисинусоидального пространства в дольках печени.

Таким образом, введение кондиционированной среды Trichoderma мышам до или после воздействия на организм пирена по ряду исследованных нами показателей способствует усилению защитных функций организма, нормализации морфофункционального состояния печени и почек, снижению выраженности патологических изменений в различных тканях организма.

Подняться вверх сайта