Поиск Кабинет

Влияние ксенотрансплантации нейральных стволовых/прогениторных клеток из «обонятельного эпителия» на функциональную активность сетчатки после моделирования ишемии

Гены & Клетки: Том II, №4, 2007 год, стр.: 47-53

 

Авторы

Немцова Е.В., Купрашвили ИЛ., Зуева М.В., Цапенко И.В., Сабурина И.Н., Репин B.C., Ревищин А.В.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Нейральные стволовые/прогениторные клетки [НСПК], выделяемые из обонятельной области слизистой оболочки носа человека [OECs} в клеточной терапии и тканевой инженерии рассматривают как один из наиболее перспективных видов аутогенного материала среди различных потенциальных источников клеток для пересадки. В работе проводилась ксенотрансплантация НСПК в супрахориоидальное пространство кроликам на модели ишемии сетчатки, вызванной лазеркоагуляцией ретинальных сосудов 1-11 порядка. С целью объективной оценки степени и характера изменений функциональной активности сетчатки и функциональных репаративных эффектов трансплантации НСПК проводили элект-роретинографические исследования.

По данным электроретинографии однократная трансплантация НСПК способствует лучшей сохранности и восстановлению ретинальной функции при моделировании острой ишемии сетчатки, что коррелирует с результатами офтальмоскопических исследований.

Показано, что трансплантация НСПК в супрахориоидальное пространство является безопасным и эффективным способом введения клеток с целью лечения заболеваний сетчатки, вызванных ишемией.

Введение

Травма органа зрения занимает одно из ведущих мест среди причин инвалидности по зрению. При этом более по ловины случаев потери зрения связано с травматической патологией глазного дна, такой как отек и ишемия сетчатки, разрывы и отрывы сетчатки от зубчатой линии, отслоение сетчатки, токсические и посттравматические дистрофичес кие изменения сетчатки. Несмотря на использование со временных хирургических и медикаментозных методов лечения, возвращения утраченных функций сетчатки дос тигнуть не удается.

До 80 х годов XX века торможение восстановительных процессов в нервной ткани при травме связывали с глиаль ным рубцом, который препятствует прорастанию аксонов. Позднее, с совершенствованием техники исследования в данной области, блокирование регенеративных процессов стали объяснять ранним развитием в зоне травмы дисба ланса тканевых пептидов — дефицитом белковых ростсти мулирующих нейротрофических факторов и опережающим появлением белков — ингибиторов роста [1 3]. В начальный период — от момента травмы до первых суток — вслед за механическим первичным повреждением ткани сетчатки уже через несколько минут начинается этап вторичного метаболического повреждения. Здесь играют роль механизмы ишемического повреждения вследствие нарушения кровообращения, спазма и нарушения прони цаемости капилляров вокруг очага первичной травмы с последующим вазогенным и позднее цитотоксическим отеком ткани сетчатки. Высвобождение метаболитов ара хидоновой кислоты, простагландинов, а также нейтрофиль ная инфильтрация, сопровождающаяся выбросом в ткань миелопероксидазы и эластазы, расширяют ареал повреж дения с формированием в соседних с первичной травмой участках сетчатки новых очагов некроза. Позднее зона некроза очищается макрофагами и нейтрофилами. В при легающей к месту травмы сетчатке продолжается гибель отдельных нейронов за счет апоптоза. Завершающим эта пом является организация дефекта путём формирования глиального рубца за счет гиперплазии микроглии и аст роцитов.

В конце XX века стали появляться предположения о возможности восстановления структурной целостности сетчатки с помощью клеточных технологий. Одним из наи более перспективных видов клеточного материала для трансплантации с целью лечения заболеваний сетчатки яв ляются нейральные стволовые/прогениторные клетки (НСПК), выделенные из обонятельной области слизистой оболочки носа взрослого человека.

НСПК из обонятельной области слизистой оболочки носа человека впервые выделили в 2001 году. Отдельную суб популяцию в обонятельной части слизистой оболочки носа человека образуют так называемые обкладочные нейроэпи телиальные клетки, обладающие свойствами нейральных стволовых клеток. «Обонятельный эпителий» и гломеруляр ный слой обонятельных луковиц млекопитающих содержат специализированные глиальные клетки, обладающие спо собностью стимулировать аксональную регенерацию нейро нов центральной и периферической нервной системы [4 6]. В англоязычной литературе эти клетки получили название «olfactory ensheathing cells» (OECs), «обкладочные» («оболо чечные») клетки «обонятельного эпителия». В отечествен ной гистологической терминологии аналога этому понятию не существует. Известно, что OECs выделяют различные нейротрофические факторы: фактор роста нервов (NGF) [7], нейротрофический фактор, синтезируемый в головном моз re (BDNF) [8] и реснитчатый нейротрофический фактор [9]. Эти факторы, так же как внеклеточные матричные молеку лы [10] могут играть значительную роль в регенерации сет чатки после повреждения. Имеются также сведения, что клетки базального слоя «обонятельного эпителия» мыши могут дифференцироваться и в экстранейрональном на правлении.

Учитывая значительную роль электроретинографии в дифференциальной и топической диагностике тонких из менений функциональной ретинальной активности, целью настоящего исследования явилось изучение влияния ксе нотрансплантации нейральных стволовых/прогениторных клеток из обонятельной области слизистой оболочки носа человека на сохранность и динамику восстановления био электрической активности сетчатки кролика при моделиро вании ретинальной ишемии.

Материал и методы

Исследования проводились на 15 кроликах (30 глаз) породы Шиншилла весом 2,5-3,0 кг. С целью создания ос трой ишемии сетчатки выполняли транспупиллярную лазер коагуляцию ретинальных сосудов III порядка. Процедура выполнялась с помощью аргоновой лазерной установки Visulas Argon II (Karl Zeiss, Германия) под местной анесте зией (1% раствор дикаина) и под контролем фундус линзы (лазеркоагуляцию производил дм.н. Иванов А.Н.) Средняя мощность излучения составляла 600 800 мВт, длительность экспозиции — 0,1с, диаметр пятна — 300 мкм, количество коагулятов — 100. Проводилась коагуляция видимых сосу дов на всем их протяжении, на 1/2 РД от диска зрительного нерва. На следующий день после лазеркоагуляции в супра хориоидальное пространство глаз опытной группы животных вводили 500 тыс. НСПК в 0,02 мл сбалансированного фи зиологического раствора (СФР), в контрольной группе вводили 0,02 мл СФР.

НСПК выделяли из обонятельной области слизистой обо лочки носа человека по стандартной методике. Диссоции рованные клетки рассевали в чашки Петри в концентрации 100 200 тыс. клеток в 1 мл ростовой среды DMEM/F12, содержащей фактор роста фибробластов, эпидермальный фактор роста, гепарин, ИТС (инсулин, трансферрин, селенит) и 3 5% эмбриональной телячьей сывороткиё. Культивировали до монослоя. Первичные культуры пересевали через 10 15 сут. Пассированные культуры НСПК представляли собой активно пролиферирующие прикрепленные колонии мелких эпителиальных клеток, в которых содержание нестин/ви ментин положительных клеток составляло не менее 60%. Другие клетки экспрессировали GFAP и р тубулин. При пе реводе культур на бессывороточную среду наблюдалось образование характерных нейросфер, которые продолжали пролиферировать в суспензионной культуре. Для трансплан таций использовали клетки после 6 8 пассажей.

Клиническое наблюдение осуществлялось с помощью биомикроскопии, офтальмоскопии и фоторегистрации.

Всем кроликам выполняли регистрацию электрорети нограммы (ЭРГ) при расширении зрачка 1% раствором мидриацила и анестезии роговицы 0,5% раствором дика ина. Исследования проведены с помощью диагностичес кой электрофизиологической мини системы «Mjolner» (Ephios АВ, Швеция). Интенсивность вспышек составляла 1,7 кдхс/ма. С помощью активного электрода - контактной линзы «ERG Jet» с кольцевым золотым напылением — реги стрировали ЭРГ на одиночные стимулы света и на мелька ния частотой 30 Гц (ритмическая ЭРГ - РЭРГ). Игольчатые электроды (референтный и земляной) располагались под кожно в области лба кроликов. Исследования проводили после предварительной 20 минутной темновой адаптации до и через 1 сут. после лазерной фотокоагуляции сосудов (через 15 минут после введения НСПК и СФР), а также через 7, 14 и 30 дней после моделирования ишемии сетчатки.

Результаты и обсуждение

При биомикроскопии как в контроле, так и в опыте отме чались умеренная гиперемия и отек конъюнктивы преиму щественно в зоне вмешательства, постепенно проходящие на 5 й день после трансплантации. За время наблюдения со стороны переднего отрезка воспалительных явлений не наблюдалось. Оптические среды глаза сохраняли про зрачность. При офтальмоскопии после лазеркоагуляции отмечалось сужение всех сосудов с полной или почти пол ной остановкой кровотока, сохраняющееся на протяжение 2 5 минут, после чего кровоток несколько восстанавливался, но сосуды оставались резко сужеными.

На следующий день после коагуляции на глазном дне у некоторых кроликов наблюдалась незначительная гипере мия, стушеванность границ диска зрительного нерва из за отека окружающей сетчатки, сужение артерий с полным пре кращением кровотока в некоторых из них. Отмечались ам пулообразное расширение вен, застои, отек сетчатки по ходу сосудов (рис. 1 А). На периферии патологические измене ния не выявлены.

За последующие 7 суток кровоток в сосудах сетчатки постепенно улучшался. Сохранялся неравномерный калибр артерий с участками их полной окклюзии (рис. 1 Б). В венах увеличился застой, они становились более широкими, по явилась патологическая извитость. Сетчатка по ходу сосу дов стала менее отечная. В местах лазеркоагуляции по ходу сосудистого пучка появились дистрофические хориорети нальные очаги разной величины. На периферии также об наруживались участки очагового некроза сетчатки.

На более поздних сроках наблюдения (14 20 дней) отмечалось медленное восстановление кровотока в рети нальных сосудах, развитие коллатералей. Просвет сосудов становился более равномерным на всем протяжении, но восстановления их калибра до исходного уровня не отме чалось. В венах сохранялись застойные явления, на сет чатке — прежние дистрофические очаги. В опытной груп пе при офтальмоскопии выявлялось меньшее количество дистрофических очагов сетчатки, чем в контрольной группе (рис. 2 А, Б), однако провести количественное их сравнение не представлялось возможным из за вариабельности раз меров и форм очагов.

При электроретинографии через сутки после лазерной коагуляции сосудов сетчатки (I - III порядка) на глазах у жи вотных как в опытной группе, так и в контрольной отмечалась гиперреакция сетчатки. В среднем по группе амплитуда а волны ЭРГ (корнео негативного потенциала, источником генерации которого являются фоторецепторные клетки) че рез сутки составляла 133% и 129% от исходных значений для глаз опытной и контрольной групп животных соответ ственно. Гиперреакция сетчатки в первые сутки после лазеркоагуляции вызвана раздражением фоторецепторов в ответ на острую ишемию.

Корнео позитивный компонент ЭРГ — волна Ь, которая генерируется клеточными элементами внутреннего ядерного слоя сетчатки (при доминирующем вкладе ON биполярных клеток, а также глиальных клеток Мюллера), через сутки после лазеркоагуляции практически не отличалась от ис ходных значений в контроле (в среднем, 96%), но в глазах с НСПК она резко возрастала (до 138%).

Через 1 неделю после моделирования ретинальной ише мии амплитуды всех биопотенциалов в контрольной группе достоверно снижались, причем наибольшему угнетению подвергалась а волна ЭРГ. В глазах контрольной группы животных амплитуды а и b волн ЭРГ и РЭРГ с частотой 30 Гц составляли в среднем 47, 53 и 43% от индивидуальной нормы. В течение последующих 2 х недель при введении СФР на фоне ретинальной ишемии происходило медленное восстановление биоэлектрической активности сетчатки, что соответствовало наблюдаемой при офтальмоскопическом обследовании тенденции к нормализации кровотока. Одна ко неравномерный калибр сосудов, сохранение застойных явлений в ретинальных венах и наличие дистрофических очагов коррелировало с динамикой ЭРГ, и даже в конце пе риода наблюдения амплитуды а, b волн ЭРГ и РЭРГ в гла зах контрольной группы животных составляли только 80, 96 и 70% соответственно (рис. 3 А).

В глазах животных опытной группы после моделирова ния ретинальной ишемии и введения НСПК через 7 дней у 2/3 животных амплитуды а и Ьволн ЭРГ резко превыша ли свои исходные значения, а у 1/3 — оставались в преде лах нормальных или умеренно сниженных значений. В сред нем, значения а , b волн ЭРГ и РЭРГ через неделю достигали 90, 118 и 82% от индивидуальной исходной нор мы. Через 14 дней амплитуды волн ЭРГ в глазах животных опытной группы умеренно превышали норму, и выраженная гиперреакция сетчатки сохранялась до конца срока наблю дения. Наиболее резко возрастала b волна ЭРГ, значения которой достигали 153%, что может отражать активизацию глиальных клеток Мюллера, возможно компенсаторно при способительного характера. Через месяц наблюдения сред няя по группе амплитуда а и b волн ЭРГ составляла 133 и 140% от нормы. Амплитуда РЭРГ соответствовала нормаль ным значениям и составляла в среднем 108% от исходных величин (рис. 3 Б).

Следует отметить, что при моделировании ретинальной ишемии в отдаленные сроки наблюдения в глазах животных опытной группы и контрольной ритмическая ЭРГ на 30 Гц практически всегда имела субнормальные значения при минимальной амплитуде через 7 суток после лазеркоагу ляции. Изменения РЭРГ на мелькающий стимул были ста тистически достоверными но менее выраженными, чем на чальные альтерации волн ЭРГ на одиночные вспышки. Биопотенциалы сетчатки на высокочастотные мелькания имеют чисто нейральную (в большей степени фоторецеп торную) природу генерации. Учитывая также данные лите ратуры о селективной чувствительности РЭРГ с частотой 30 40 Гц к развитию в сетчатке человека изменений дистрофического характера, угнетение ритмических отве тов, по видимому, следует рассматривать как отражение очагов органических нарушений, что подтверждали данные наших офтальмоскопических наблюдений.

На фоне лечения НСПК через месяц амплитуда РЭРГ в глазах животных опытной группы соответствовала нормаль ным значениям (108% от исходных величин), в то время как в глазах животных контрольной группы на поздних сроках эксперимента она оставалась сниженной на 30% (таб.).

Заключение

По данным ЭРГ трансплантация НСПК на фоне ишемии обладает нейропротекторным действием, что выражается в больших величинах ЭРГ и РЭРГ в опытной группе.

В ранние сроки после лазерного воздействия транс плантация НСПК способствовала сохранению ретинальной функции и снижению выраженности ишемических и диет рофических изменений на глазном дне. В более поздние сроки, когда происходило частичное вое становление кровообращения сетчатки, эффект НСПК в опыт ной группе проявлялся в лучшей динамике восстановления ретинального электрогенеза по сравнению с контролем.

Таким образом, супрахориоидальная трансплантация НСПК проявила себя безопасным и эффективным способом введения клеток с целью лечения заболеваний сетчатки в эксперименте на кроликах.

Подняться вверх сайта