Поиск Кабинет

Влияние криоконсервированных ядросодержащих клеток пуповинной крови на состояние гомеостаза у животных разных возрастных групп при стресс-индуцированной артериальной гипертензии.

Гены & Клетки: Том IX, №4, 2014 год, стр.: 88-94

 

Авторы

Бабийчук Л.В., Бабийчук В.Г., Сиротенко Л.А., Малова Н.Г., Коваль С.Н.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Артериальная гипертензия (АГ) по своей распростра ненности, влиянию на качество жизни и вклад в смертность населения может быть в полной мере отнесена к числу социально значимых патологий. В настоящий момент на коплено большое количество данных, свидетельствующих о положительном терапевтическом влиянии клеточных препаратов, полученных из пуповинной крови, как на раз ные органы и системы, так и на организм в целом. Целью данной работы являлось изучение динамики изменений показателей спектрального анализа вариабельности сер дечного ритма (ВСР) и липидного гомеостаза в сыворотке крови животных различных возрастных групп при невро генной стресс-индуцированной АГ до и после введения криоконсервированного препарата ядросодержащих клеток пуповинной крови (ЯСК ПК). Установлено, что неврогенная стресс-индуцированная АГ, вызванная эмоционально-боле вым стрессом, сопровождается значительным снижением всех исследуемых параметров ВСР, а также нарушениями липидного состава сыворотки крови крыс независимо от их возраста. Наблюдалось уменьшение активности вегета тивной регуляции сердечного ритма, а также имела место тенденция к снижению гуморально-метаболических влия ний. Было показано, что введение криоконсервированного препарата ЯСК ПК приводит к повышению тонуса симпати ческого и парасимпатического отделов вегетативной нерв ной системы, а также гуморального звена регуляции, что свидетельствует о наличии у экспериментальных животных развитой сбалансированной вегетативной регуляции. Кро ме того, применение препарата нивелировало состояние показателей липидного профиля, которые наблюдались на фоне стресс-индуцированной АГ, а сам препарат обладал антиатерогенным действием и был способен существенно улучшать реологические свойства крови.

Введение

Артериальная гипертензия (АГ) – одно из широко распространенных, клинически и социально значи мых заболеваний в мире, которое особенно часто встречается в пожилом возрасте [1]. АГ представ ляет собой хроническое патологическое состояние, приводящее к таким поражениям сердечно-сосуди стой системы, как инфаркт миокарда, инсульт, анев ризмы крупных артерий, сердечная и почечная недостаточность, микроваскулярные нарушения.

Прогноз больных АГ в значительной степени определяется наличием дополнительных факторов риска, среди которых большую роль играет дисли пидемия. Согласно статистике нарушения липид ного обмена встречаются у 40–85% больных АГ [2, 3]. При сочетании АГ и дислипидемии риск раз вития ишемической болезни сердца увеличивает ся в 8 раз, а риск внезапной сердечной смерти – в 10 раз [4]. Установлена прямая связь между уров нем общего холестерина и смертностью от сердечно сосудистой патологии у больных АГ [5]. Не вызывает сомнения наличие тесной взаимосвязи между мета болическими нарушениями и кардиоваскулярными заболеваниями [6, 7].

При АГ возникают выраженные изменения ва риабельности сердечного ритма (ВСР), связанные с нарушениями вегетативной регуляции сердечно сосудистой системы. Система кровообращения мо жет рассматриваться как чувствительный индикатор адаптационных реакций организма в целом [8], а ВСР хорошо отражает степень напряжения регуля торных систем, обусловленного возникающей в от вет на любое стрессорное воздействие активацией системы «гипофиз-надпочечники» и реакцией симпатоадреналовой системы [9].

Изучению ВСР при АГ посвящено множество ра бот [10, 11]. У пациентов с АГ отмечается повыше ние симпатического тонуса и снижение парасимпа тического, что рассматривается в качестве одного из ключевых механизмов формирования и становления как пограничной, так и стабильной АГ.

Успешное развитие клеточных технологий явля ется чрезвычайно перспективным для создания эф фективных терапевтических средств [12]. Однако необходимо учитывать, что пролиферативная актив ность и высокий дифференцировочный потенциал стволовых и прогениторных клеток уменьшаются с возрастом [13]. В связи с этим, использование пуповинной крови (ПК) как источника различных по пуляций «молодых» клеток разрабатывается для ле чения более 70 заболеваний [14]. Научные иссле дования последних лет подтверждают значительный потенциал применения в медицине ПК, содержащей гемопоэтические стволовые клетки (ГСК). В клини ческой практике накоплено значительное количество данных о положительном влиянии клеточных препа ратов, полученных из ПК, как на разные органы, си стемы, так и на организм в целом. Благодаря своему биологическому составу она является уникальной «субстанцией» с разнонаправленной биологической активностью [14].

Установлено, что ГСК ПК характеризуются муль типотентностью, дают начало предшественникам лимфоидного и миелоидного рядов, которые спо собны образовывать форменные элементы крови, ряд специализированных клеток иммунной системы. ГСК ПК обладают более высоким пролиферативным потенциалом в сравнении с клетками костного мозга взрослого человека. В организме реципиента ГСК мо гут делиться, продуцировать биологически активные вещества, дифференцироваться, что позволяет в ко роткие сроки восстанавливать функцию поврежденного органа или ткани.

Учитывая небольшие объемы забранной после рождения ребенка ПК (в среднем, не более 100 мл), важным является как наиболее полное выделение ядросодержащих клеток (ЯСК) (в том числе ГСК) из нее, так и разработка технологии криоконсервирова ния ПК c сохранением ее структурно-функциональной полноценности. Всем этим требованиям отвечает разработанная в ИПК и К НАН Украины технология выделения и криоконсервирования ядросодержащих клеток ПК, позволяющая сохранять до 85% CD45+ клеток и до 98% CD34+-клеток в жизнеспособном состоянии [15, 16].

В связи с уникальной способностью ПК (в частно сти ее ГСК) к поддержанию гомеостаза в организме, целью данного исследования было изучение особен ностей состояния вегетативной и гуморальной регуля ции сердечного ритма, а также липидного гомеостаза в сыворотке крови животных различных возрастных групп при неврогенной стресс-индуцированной АГ до и после введения криоконсервированного препарата ЯСК ПК.

Материал и методы

Исследование проводили на белых молодых (6-месячных) и старых (28–30-месячных) нели нейных крысах-самцах. Все манипуляции с лабора торными животными выполнялись в соответствии с Общими принципами работы на животных, одобрен ными 1-м Национальным конгрессом по биоэтике (Киев, Украина, 2001) и согласованными с положе нием Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Страсбург, Франция, 1986). Каждая возрастная группа животных была разделена на 3 подгруппы (по 7 крыс в каждой):

– подгруппа 1 – 6- и 28–30-месячные интактные крысы;

– подгруппа 2 – 6- и 28–30-месячные крысы с неврогенной стресс-индуцированной АГ;

– подгруппа 3 – 6- и 28–30-месячные животные с АГ после введения криоконсервированного препарата ЯСК ПК.

Неврогенную стресс-индуцированную АГ модели ровали по запатентованному методу Л.В Бабійчук и соавт. (2011) [17] до получения стойких повышен ных цифр артериального давления (АД): у старых животных – 179,25±2,29/95,42±2,08 мм рт. ст., (при норме – 103,92±2,96/74,42±2,44 мм рт. ст.), у молодых – 161,98±5,47/80,1±2,12 мм рт. ст. (при норме – 99,72±3,57/69,15±1,06 мм рт. ст.) путем комплексного периодического воздействия на организм животных различными видами раздражи телей: светового, звукового, электрического. АГ кон тролировали по стабильно высокому, по сравнению с контрольными животными, уровню АД, которое измеряли непрямым методом по принципу медицин ской тонометрии с применением электрокардиогра фа «Поли-Спектр» (Нейрософт, Россия), используя специальные прижимные манжетки и датчики пульса кровеносных сосудов хвоста животного.

Животным со стресс-индуцированной АГ вво дили криоконсервированный препарат ПК [15, 16]. ПК получали во время родоразрешения путем естественных родов или операции кесарево сече ние. Все доноры подписывали добровольное ин формированное согласие и проходили тщательный дородовый скрининг на наличие противопоказаний к донорству.

После забора ПК производили выделение ЯСК ПК, включающих в себя стволовые гемопоэтические CD 34+-клетки. С целью уменьшения общего объ ема крови и удаления эритроцитов был использо ван метод седиментации в растворе декстрана Д-60 [15]. После этого выделенные клетки в аутоплазме замораживали по разработанному нами методу с использованием криопротектора ДМСО в конечной концентрации 5% [16]. Замораживание клеток про водили на програмном замораживателе (Cryoson, Германия) по четырехэтапной программе с исполь зованием медленных скоростей охлаждения и вре менной экспозиции при субнулевых температурах. На длительное хранение препараты закладывали в криобанк при температуре -196°С. Перед использо ванием криоконсервированные препараты ЯСК ПК размораживали при температуре 37–40°С на водяной термостатируемой бане.

Фенотип клеток CD45+, CD45+CD34+, а также их жизнеспособность (CD45+7ААД--, CD34+7ААД--) определяли методом проточной цитофлуориметрии (FACS Calibur, Becton Dickinson, США) с использо ванием реагентов BD по ISHAGE протоколу фирмыпроизводителя.

Вводимый после криоконсервации препарат пред ставлял собой взвесь ЯСК ПК в аутоплазме человека с концентрацией стволовых CD34+-клеток 2–4×105 в 1 мл. Размороженный препарат вводили внутрибрю шинно, однократно в дозе 1×105 CD34+ клеток на килограмм массы на 7-е сут. после развития АГ. Жи вотных выводили из эксперимента путем декапитации на 3, 7 и 30-е сутки после введения препарата ЯСК ПК. Перед выведением у животных регистрировали электрокардиограмму на электрокардиографе серии «Поли-Спектр» (Нейро-Софт, Россия) в шести стан дартных отведениях. Длительность записи составляла 5 мин. Спектральный анализ ВСР проводили с помо щью программы «Поли-Спектр-Ритм» (Нейро-Софт, Россия). Согласно основной системе спектрального анализа ВСР у крыс [18, 19], нами были выделены и проанализированы следующие показатели:

– ТР (мс2) – полная мощность спектра колебаний кардиоритма;

– HF (мс2) – мощность высокочастотных колеба ний в диапазоне (1–3 Гц);

– LF (мс2) – мощность низкочастотных колебаний в диапазоне (0,04–1 Гц);

– VLF (мс2) – мощность спектра кардиоритма в области очень низких частот (0–0,04 Гц).

Для оценки липидного профиля крови крыс со стресс-индуцированной АГ до и после введения ЯСК ПК определяли уровень общего холестерина (ОХ), триглицеридов (ТГ), холестерина липопроте инов высокой плотности (ХСЛПВП), холестерина липопротеинов низкой плотности (ХСЛПНП), хо лестерина липопротеинов очень низкой плотности (ХСЛПОНП) и коэффициент атерогенности (КА). Уровень ОХ, ТГ, ХСЛПВП в сыворотке крови опре деляли при помощи стандартных коммерческих на боров (DAC-SpectoMed, Молдова) по прилагаемой фирмой производителем методике. Измерение оп тической плотности выполняли на биохимическом анализаторе Stat Fax 1904 plus (США). Содержание ХСЛПОНП, ХСЛПНП и (КА) рассчитывали по формулам Фридвальда [20]:

КА(усл.ед.) = (ОХ – ХСЛПВП)/ХСЛПВП;

ХСЛПОНП = ТГ/2,2; ХСЛПНП = ОХ – (ХСЛПВП – ХСЛПОНП).

Данные представлены как среднее значение и стандартная ошибка среднего значения. При ста тистической обработке данных проверяли характер распределения цифрового материала в выборках с помощью критерия Шапиро – Уилка. В основном данные соответствовали закону нормального рас пределения. Равенство дисперсий в группах про веряли с помощью критерия Фишера. Сравнение средних арифметических значений проводили с по мощью t-критерия Стьюдента для независимых вы борок. Различия считали статистически значимыми при p<0,05 [21, 22].

Результаты и обсуждение

Ведущая роль в развитии АГ и нарушений углевод ного и липидного обмена принадлежит нарушениям взаимосвязей в системе регуляции энергетического гомеостаза, где центральным интегрирующим орга ном является гипоталамус и подкорковые центры, а одним из основных эффекторных звеньев – вегетативная нервная система (ВНС).

Важнейшей функцией ВНС является ее способ ность управлять энергетическими и метаболически ми процессами в организме, осуществлять мобили зацию адаптационных резервов и функциональных возможностей при стрессорных воздействиях. Меха низмы вегетативной регуляции играют ведущую роль в развитии адаптивных реакций организма, а также в сохранении гомеостаза его основных систем. Спек тральный анализ ВСР позволяет выделить диапазо ны частот, отражающих активность разных уровней системы управления сердечным ритмом. Вагусную активность отражает высокочастотный компонент (HF) спектра ВСР. Низкочастотный компонент (LF) характеризует активацию вазомоторного центра про долговатого мозга. Очень низкочастотные волны (VLF) тесно связаны с психоэмоциональным напряжением и являются индикатором управления гуморально-ме таболическими процессами. Суммарная мощность спектра нейрогуморальной регуляции (ТР) – один из наиболее информативных показателей, который ис пользуется при анализе функциональной адаптации сердечно-сосудистой системы в ответ на действие стрессов различного генеза [18].

Было установлено, что у молодых крыс со стресс индуцированной АГ значения общей спектральной мощности нейрогуморальной регуляции существен но снижались по сравнению с контрольными живот ными без гипертензии (рис. 1). Данные изменения были четко выражены как через 3 и 7 сут. от на чала моделирования АГ, так и спустя 7 сут. и 1 мес. после развития данного патологического состояния. В вышеуказанные сроки отмечалось значительное уменьшение активности вегетативной регуляции сердечного ритма, а также наблюдалась тенденция к снижению гуморально-метаболических влияний. На спектрограмме это подтверждалось уменьшени ем удельного веса высоко-, низко- и очень низкоча стотных волн (HF, LF, VLF-компонент). Через 1 мес. после развития стойкой АГ показатели ТР возрастали по отношению к предыдущим срокам, однако оставались значительно ниже контрольных.

Представленные результаты исследования показа телей спектрального анализа ВСР у молодых крыс в динамике позволяют предположить, что психоэмоци ональное напряжение, вызванное эмоционально-бо левым стрессом на раннем этапе может проявляться избыточным тонусом симпато-адреналовой системы. По мере ее истощения, а также развития и прогресси рования АГ вегетативное обеспечение сердечной дея тельности все в большей степени осуществляется за счет перехода регуляции на медленный, но более ста бильный гуморально-метаболический уровень. Кроме того, полученные нами экспериментальные данные согласуются с литературными [23, 24], свидетель ствующими о том, что АГ эссенциального генеза (в том числе неврогенная), в отличие от симптома тической, приводит к значительному снижению исследуемых параметров ВСР.

Уже через 3 сут. после введения молодым живот ным с АГ криоконсервированного препарата ЯСК ПК отмечалось увеличение общей спектральной мощно сти до контрольных значений. (рис. 1) Ее рост был результатом повышения тонуса симпатического и парасимпатического отдела ВНС на фоне практически не меняющейся активности гуморальной регуляции. Аналогичные показатели ТР имели место через 1 и 2 нед. после введения ЯСК ПК, однако отмечалось увеличение гуморально-метаболических влияний на сердечный ритм.

В отдаленные сроки наблюдения у молодых крыс с АГ (3 нед. и 1 мес. после введения ЯСК ПК) уро вень общей мощности спектра нейрогуморальной регуляции существенно возрастал не только отно сительно предыдущих этапов экспериментального исследования, но и по отношению к показателям контроля. По нашему мнению, благоприятным яв ляется тот факт, что подъем спектральной мощно сти, был результатом активации деятельности как вегетативных центров, так и гуморального звена регуляции. Полученные данные, такие как высокий уровень вагальных, симпатических влияний в моду ляции сердечного ритма на фоне введения криокон сервированного препарата ЯСК ПК, свидетельствуют о наличии у молодых крыс с АГ развитой сбаланси рованной вегетативной регуляции.

Проведенный спектральный анализ ВСР у старых крыс контрольных групп показал, что показатели ТР у них были ниже чем у молодых (рис. 2). Через 3 сут. после начала моделирования АГ достоверных отличий в ее значениях, по отношению к контролю, отмечено не было. Однако спустя 1 нед. от начала эксперимента, а также через 3, 7 сут. и 1 мес. по сле развития стойкой гипертензии уровень общей спектральной мощности нейрогуморальной регуляции уменьшался относительно интактных старых живот ных. Имело место снижение симпатической и гумо рально-метаболической регуляции, соответственно (уменьшался удельный вес LF и VLF волн). Резкое падение тонуса парасимпатического отдела ВНС у животных данной возрастной группы наблюдалось лишь через 7 сут. от начала моделирования стресс индуцированной АГ.

Анализ волновой структуры сердечного ритма у старых крыс с АГ на фоне введения криоконсерви рованного препарата ЯСК ПК продемонстрировал существенный рост ТР благодаря синхронной акти вации всех регуляторных звеньев организма экс периментальных животных. В структуре спектра в большей степени превалировал тонус симпатиче ского и парасимпатического отделов ВНС, а также прослеживалась динамика увеличения гуморально метаболических влияний. Данные изменения были ярко выражены как через 3 и 7 сут. после введения ЯСК ПК, так и в отдаленные сроки (через 2, 3 нед. и 1 мес. после введения).

Таким образом, у старых животных нами отмечена аналогичная динамика изменения основных показа телей спектрального анализа ВСР, как и у молодых. Развитие патологического состояния сопровожда лось резким снижением всех исследуемых параме тров ВСР, а введение препарата ЯСК ПК приводило к активации ВНС и гуморального звена регуляции. Данные изменения являются физиологически зна чимыми, поскольку гомеостатические свойства це лостного организма являются результатом одновре менного действия многих сложно организованных регуляторных механизмов, среди которых одно из важных мест занимает вегетативная регуляция, обес печивающая постоянство уровней обмена веществ и энергии в организме, отдельных органах и тканях.

Как отмечалось, тяжесть течения АГ тесно связа на с наличием дополнительных факторов риска, од ним из которых является дислипидемия. У больных с АГ дислипидемия проявляется повышением уровня холестерина ЛПОНП и снижением уровня холесте рина ЛПВП. Содержание холестерина ЛПНП обычно остается в пределах нормы или слегка повышенным [3]. Однако даже незначительное повышение концен трации фракции ХСЛПНП, является фактором для атерогенного процесса и увеличивает риск развития сердечно-сосудистых осложнений у больных с АГ [5]. На 3 сут. после развития стресс-индуцированной АГ у старых животных отмечались достоверные изменения липидного состава сыворотки кро ви (табл. 1). Наблюдалось повышение уровня ТГ, ХСЛПОНП и ХСЛПНП, что может указывать на акти вацию энергетического обеспечения организма при стрессе. Также имело место достоверное повыше ние ОХ. Такие изменения липидного состава крови в состоянии стресса вполне объяснимы [5]. Уровень ХСЛПВП был достоверно ниже, чем у интактных животных. Эта фракция липидов крови отвечает за обратный транспорт холестерина от периферических тканей в печень. По всей видимости, при стрессе этот процесс менее активен. Соответственно такое соотношение липидов в сыворотке крови приводит к повышению КА и смещению липидного профиля в сторону атерогенности.

Через 7 сут. после развития АГ уровень ТГ оста вался достоверно высоким, так же происходило статистически значимое повышение ОХ, ХСЛПНП, ХСЛПОНП и КА [7], то есть увеличивалось количе ство липидов и тех фракций липопротеинов, которые участвуют в переносе холестерина и ТГ от печени к периферическим тканям. Уровень ХСЛПВП повы шался, однако по отношению к другим фракциям это увеличение не было существенным. Отмечалась патологическая гиперлипидемия, которая впослед ствии может приводить к атеросклеротическим из менениям в сосудах.

Через 1 мес. после развития АГ уровень атеро генных фракций липидов в крови животных оста вался достоверно высоким, что подтверждает про грессирование патологического процесса. Введение препарата ЯСК ПК экспериментальным животным на фоне стресс-индуцированной АГ сопровождалось изменениями липидного профиля сыворотки крови (табл. 1).

На 3 сут. после введения препарата ЯСК ПК оста вался высоким уровень только ТГ, остальные пока затели липидного гомеостаза приближались к пока зателям здоровых животных. Через 7 сут. состояние липидного профиля полностью соответствовало зна чениям в группе интактных животных. Через 1 мес. после введения препарата ЯСК ПК отмечалось до стоверное повышение ХСЛПВП и снижение ХСЛПНП относительно контролей.

На основании полученных результатов можно предположить, что применение препарата ЯСК ПК нивелировало состояние показателей липидного профиля, которые наблюдались на фоне стресс индуцированной АГ, а сам препарат обладает анти атерогенным действием и способен существенно улучшать реологические свойства крови [12, 14]. Определение уровня липидов у молодых крыс через 3 сут. после развития АГ (табл. 2) показа ло достоверное увеличение ТГ, ОХ, ХСЛПНП и КА. Причем на фоне повышения атерогенных фрак ций липидов одновременно увеличивался и уро вень ХСЛПВП. Рост содержания свободных жиров в сыворотке крови молодых животных приводил к незамедлительному повышению их переносчика (ХСЛПВП) к месту трансформации, то есть к печени. КА, как и у старых животных, был достоверно выше, чем у контрольных. Это указывает на то, что стресс индуцированная АГ усиливает атерогенный риск независимо от возраста.

На 7 сут. происходило нарастание уровня ТГ, сни жался ХСЛПВП, содержание других фракций липи дов соответствовало предыдущему сроку наблюде ния. Через 1 мес. показатели липидограммы имели аналогичную тенденцию, как на 3 и 7 сут. после раз вития устойчивой АГ. Таким образом, АГ приводит к смещению липидного состава крови в сторону атеро генности в обеих возрастных группах.

На 3 и 7 сут. после введения молодым животным криоконсервированного препарата ЯСК ПК, наблюда лось достоверное снижение уровня ТГ (табл. 2). Нор мализовался КА и содержание ОХ в сыворотке крови. Через 1 мес. липидный профиль молодых животных с АГ соответствовал показателям контрольных крыс. В это же время показатели АД также возвра щались к нормальным значениям. У старых жи вотных с АГ на фоне введения препарата ЯСК ПК – 113,75±3,75/73,75±2,39 мм рт. ст., у молодых – 115±2,89/72,5±1,44 мм рт. ст. В группе крыс с АГ (без введения препарата ЯСК ПК) АД через 1 мес. оставалось достаточно высоким: у старых крыс – 157,5±2,5/95,0±5,0 мм рт. ст., у молодых – 145,0±2,89/82,5±1,44 мм рт. ст.

Данные проведенных нами экспериментальных исследований согласуются с результатами других авторов об эффективности применения ПК человека с целью снижения выраженности поражения сердеч но-сосудистой системы и восстановления функции нервной системы [25, 26].

Заключение

Проведенные исследования показали, что невро генная стресс-индуцированная АГ, вызванная эмоци онально-болевым стрессом, сопровождается значи тельным снижением всех исследуемых параметров ВСР (полной мощности спектра колебания ритма, мощности высокочастотных, низкочастотных, очень низкочастотных колебаний), а также нарушениями липидного состава сыворотки крови в виде снижения ХСЛПВП, повышения уровня ХСЛПНП, ХСЛПОНП, ТГ и ОХ у экспериментальных животных. Происходит смещение липидного профиля крови в сторону ате рогенности за счет повышения КА. Изменения, воз никающие во фракциях липидов, зависят от возраста животных и сроков развития заболевания. Введение криоконсервированного препарата ЯСК ПК приводит к повышению тонуса симпатиче ского и парасимпатического отделов ВНС, а также гуморального звена регуляции, что свидетельству ет о наличии у экспериментальных животных раз витой, сбалансированной вегетативной регуляции. Кроме того, имеет место нормализация липидного состава крови за счет повышения ХСЛПВП, кото рый переносит ОХ из периферических тканей в печень. Происходит снижение уровня ТГ, норма лизация КА и возвращение к контрольным пока зателям ОХ в сыворотке крови, что указывает на антиатерогенные свойства изучаемого препарата. Данные изменения особенно выражены в группе старых животных.

Подняться вверх сайта