Поиск Кабинет

Влияние интрамиокардиальной аутотрансплантации клеток костного мозга на перфузию ишемизированного миокарда в эксперименте

Гены & Клетки: Том I, №3, 2006 год, стр.: 42-47

 

Авторы

Матюков А.А.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

В работе представлены результаты изучения влияния аутологичной интрамиокардиальной трансплантации мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) костного мозга и ядросодержащей фракции костного мозга на перфузию ишемизированного миокарда кролика. Инфаркт миокарда моделировался путем лигирования нисходящей ветви левой коронарной артерии. Оценку перфузии миокарда проводили методом однофотонной эмиссионной компьютерной томографии с использованием радиофармацевти-ческого препарата (РФП) 99тТс-тетрафосмина (Муо^юм) перед моделированием инфаркта миокарда и спустя 10 суток, 1,5 месяца, 3 месяца, 6 и 12 месяцев. Были сформированы три группы животных: 1 группа (n=12), которым в ишемизированную зону вводились ММСК костного мозга (2^1СР), 2 группа (n=14) - вводилась ядросодержащая фракция костного мозга (2*10Р) и 3 группа (n=15, контрольная), которым вводилась ростовая среда.

У всех животных 1-й и 2-й групп через 1,5 месяца после операции отмечалось значительное улучшение перфузии. Средние значения накопления РФП составили 0,92+0,03 и 0,89+0,03, соответственно. В контрольной группе - 0,62+0,02. К 3 месяцам после операции полная нормализация перфузии отмечалась в опытных группах, где уровень накопления РФП составил 1,00+0,02 и 0,98+0,01, тогда как в контрольной группе этот показатель не увеличился и равнялся 0,61+0,01. Показатели равномерности перфузии в патологической и референтной зонах на 10-е сутки после операции составили: в 1-й группе - 2,7+0,2 и 2,1+0,2; во 2-й -2,6±0,2 и 1,8+0,3; в контрольной - 2,8±0,3 и 2,1+0,1. Через 3 месяца после моделирования инфаркта в 1-ой и 2-ой группах эти значения достоверно не отличались (1,9+0,2; 2,0+0,1 и 2,1 +0,1; 2,0+0,2); в контрольной группе неравномерность перфузии значительно выросла и составила 3,5+0,2 в пораженном сегменте по отношению к 2,0+0,1 в интактном сегменте.

Введение

Ишемическая болезнь сердца [ИБС] представляет собой широко распространенное заболевание и является основной причиной смертности в большинстве промышленно развитых стран мира [1 ]. Необратимое повреждение кардиомио-цитов и сосудистых структур вследствие ишемии миокарда приводит к нарушению функции сердца и, в конечном итоге, сердечной недостаточности. Используемые в настоящее время для лечения ишемии миокарда консервативные и оперативные методы не всегда эффективны или не могут быть применены по ряду причин [2]. В связи с этим разрабатываются новые способы влияния на регенерацию пораженного миокарда на основе современных достижений молекулярной и клеточной биологии. Так, в последние 5-7 лет успешно реализуется идея клеточной трансплантации для лечения ИБС. При этом многообещающим стал метод трансплантации клеток с целью замещения некротизированного миокарда вновь образованными кардиомиоцитами и стимуляции неоангиогенеза [3, 4]. Однако многие вопросы в этой области медицины остаются нерешенными и требуют дальнейшего исследования. Одним из них является вопрос о наиболее эффективном типе клеток для стимуляции ангиогенеза. В эксперименте на модели острого инфаркта миокарда было предложено использовать различные типы клеток для стимуляции неоангиогенеза в ишемизированой зоне: гемопоэтические стволовые клетки[5], эндотелиальные прогениторные клетки пуповинной крови[6], эндотелиальные прогениторные клетки, мобилизованные в периферический кровоток [7], эндотелиальные прогени-торные клетки костного мозга [8], ядросодержащие клетки [ЯСК] костного мозга [9] и периферической крови [10], муль-типотентные мезенхимные стромальные клетки (ММСК) костного мозга [11 ]. Из всего многообразия используемых типов клеток наиболее перспективным является трансплантация аутогенных клеток в связи с отсутствием необходимости им-муносупрессивной терапии, которая обычно требуется после трансплантации эмбриональных и фетальных клеток, а также в связи с отсутствием этических и юридических проблем. Данные литературы свидетельствуют, что в настоящее время среди аутогенного клеточного материала чаще всего используются ядросодержащая фракция костного мозга и ММСК костного мозга [12]. Однако экспериментальных работ по сравнительной эффективности трансплантации этих клеток мало, а полученные результаты противоречивы.

Большинство экспериментальных работ по изучению влияния трансплантации клеток на репарацию миокарда выполнялись на модели инфаркта миокарда у мелких грызунов, которые, как известно, обладают выраженными адаптационными способностями, что, с нашей точки зрения, не позволяет достоверно оценить эффект от проводимой терапии [13].

Для моделирования инфаркта в эксперименте используются разнообразные способы воздействия на миокард: низкие и высокие температуры, лазер, токсины, фармакологические препараты и т. п. [14]. К сожалению, эти способы не позволяют в полной мере воспроизвести ситуацию, возникающую в клинике. Достаточно точно данный патологический процесс удается имитировать путем перевязки коронарной артерии.

Для оценки эффективности влияния трансплантации клеток на кровоснабжение ишемизированного миокарда применяются различные методы. В настоящее время золотым стандартом в оценке уровня перфузии и метаболизма миокарда являются однофотонная эмиссионная компьютерная томография (ОФЭКТ) и позитронно-эмиссионная томография. Использование этих методов в эксперименте представляется весьма привлекательным, однако зачастую из-за величины изучаемого объекта получаемое разрешение не позволяет проводить оценку данных [1 5].

Кроме того, для определения эффективности и безопасности трансплантации клеток важно проводить оценку результатов не только в ближайшие, но и в отдаленные сроки. Однако большинство исследований отражает оценку результатов в среднем до полугода, а результаты на более поздних сроках представлены единичными сообщениями [12].

Цель работы - оценить влияние аутогенной трансплантации клеток костного мозга на перфузию миокарда у кроликов после инфаркта, моделированного путем коронароокклюзии, с использованием метода ОФЭКТ на разных сроках.

Материалы и методы

Эксперименты проведены на кроликах-самцах линии Шиншилла массой 2,7-3,0 кг. Возраст животных к началу эксперимента составлял 3-4 месяца.

1. Выделение, культивирование и характеристика полученных клеток

В работе использовали культуру ММСК и ЯСК, полученные из аспирата костного мозга.

Аспират костного мозга получали путем пункции крыла подвздошной кости после премедикации [дроперидол 0,5 мг/ кг, ксилазин 14 мг/кг) под местным обезболиванием 0,5% раствором новокаина. Аспират в количестве 10 мл помещали в пробирку, содержащую антикоагулянт CPDS [citrate phosphate dextrose solution). Полученный костный мозг фракционировали с помощью центрифугирования [1600g, 20 мин) в градиенте плотности Перколла (63%). Образовавшееся интерфазное кольцо с ЯСК костного мозга промывали в растворе Хенкса без Са2+ и Mg2+ и осаждали центрифугированием. Осадок суспендировали в среде аМЕМ и использовали либо для дальнейшего культивирования, либо для трансплантации без культивирования.

Жизнеспособность ЯСК костного мозга определяли в камере Горяева с помощью окраски трипановым синим.

Клетки культивировали в среде аМЕМ [ISN, США) с 10% сыворотки эмбрионов коров [Hyclone, Новая Зеландия) и гентамицина сульфата [50 мкг/ мл) в СО2-инкубаторе при 5% концентрации углекислого газа. Смену среды производили через каждые трое суток. После первой смены среды в нее добавляли аскорбиновую кислоту [50 мкг/мл). Клетки, достигшие субконфлюэнтного состояния, пересевали при помощи раствора трипсина и ЭДТА [Gibco, США).

Характеристику клеточных культур проводили путем окрашивания стандартной смесью реактивов BCIP-NBT [Sigma, США) на щелочную фосфатазу [ЩФ) для идентификации клеток остеогенной дифференцировки и суданом-III [BDH Chemicals Ltd, Англия) для идентификации клеток ади-поцитарной дифференцировки.

2. Моделирование инфаркта миокарда

Для моделирования инфаркта миокарда кроликам после премедикации [дроперидол 0,5 мг/ кг, метацин 0,8 мг/ кг) и эндотрахеальной интубации в условиях искусственной вентиляции легких под управляемым наркозом [кетамин 32 мг/ кг, ксилазин 14 мг/ кг, дитилин 3 мг/ кг) в четвертом межреберье слева выполнялась торакотомия. Затем осуществлялась пе-рикардиотомия и перевязка передней нисходящей ветви левой коронарной артерии на расстоянии 1,0 см от верхушки сердца [рис. 1). Сразу после коронароокклюзии в зону предполагаемого инфаркта интрамиокардиально с помощью инсулинового шприца вводили клетки или эквивалентное количество питательной среды [рис. 2). Рану послойно ушивали, пневмоторакс ликвидировали путем активной аспирации воздуха из плевральной полости. Интраоперационная летальность составила 10%, послеоперационная - менее 2%.

Все животные были разделены на 3 группы. Животным 1 -й группы [n=12) в пораженную зону инъекционным способом вводилась культура ММСК (2*106), животным 2-й группы (n=14) вводилась ядросодержащая фракция костного мозга (2*106), животным 3-й группы [контрольная, n=15) вводилась ростовая среда аМЕМ.

3. Окрашивание клеток

Окрашивание клеточных культур и ЯСК костного мозга проводили с помощью флуорохрома Hoechst [Sigma, США] в концентрации 1 мкг/мл. Идентификацию окрашенных клеток в сердце осуществляли после ферментативной обработки миокарда смесью трипсин-коллагеназы [Sigma, США). Меченые клетки выявляли с помощью флуоресцентного микроскопа «АхюБсор» [Zeiss, Германия).

4. Оценка перфузии миокарда

Оценку уровня перфузии миокарда проводили через 20-25 минут после внутривенного введения радиофар-мацевтического препарата (РФП) 99тТс-тетрофосмина (Myoview) в дозе 30-50 МБк методом ОФЭКТ [двухдетекторная гамма-камера E.Cam. var, Siemens). В каждой группе исследование осуществляли до выполнения операции и в определенные сроки после моделирования инфаркта: 10 суток, 1,5 месяца, 3 месяца, 6 месяцев и 12 месяцев. Для количественной оценки уровня перфузии использовали показатель соотношения среднего значения накопления РФП в зоне моделированного инфаркта к таковому в ин-тактной зоне. Оценку равномерности перфузии определяли по соотношению максимального и минимального значения пикселя в патологической и референтной зонах [рис. 3).

Все эксперименты на животных выполнены в соответствии с требованиями этического комитета СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова.

Результаты и обсуждение

В результате культивирования клеток, выделенных из аспирата костного мозга, была получена культура клеток -ММСК, которые образовывали колонии фибробластоподоб-ных клеток, а плотный монослой формировали к 7-10 суткам [рис. 4). После окрашивания ММСК смесью реактивов BCIP-NBT участков, положительно окрашенных на ЩФ, выявлено не было. Окрашивание культуры клеток суданом-III также дало отрицательный результат.

Для изучения влияния трансплантированных клеток на перфузию поврежденного миокарда, прежде всего, необходимо было определить местонахождение введенных клеток. Детекция флуоресцентно окрашенных клеток в миокарде кроликов показала присутствие меченых клеток в зоне ишемического повреждения [рис. 5) После трансплантации ММСК и ЯСК в ишемизированный миокард уровень перфузии определяли с помощью метода ОФЭКТ. Сводные данные уровня перфузии миокарда представлены в табл.

При количественной оценке перфузионных томосцинтиг-рамм миокарда кроликов через 10 суток после операции во всех группах отмечалось снижение перфузии в области передней стенки левого желудочка. В 1-й группе значения накопления РФП составили 0,81±0,01, во 2-й группе -0,75±0,03, в контрольной группе - 0,59±0,01.

Через 1,5 месяца после операции в 1-й и во 2-й группах наблюдалось существенное улучшение перфузии. Средние значения накопления РФП составили 0,92±0,03 и 0,89±0,03 соответственно. В контрольной группе - 0,62±0,02.

К 3-му месяцу после операции полная нормализация перфузии отмечалась в опытных группах, где уровень накопления РФП составил 1,00±0,02 и 0,98±0,01, тогда как в контрольной группе этот показатель не увеличился и равнялся 0,61 ±0,01.

На сроках 6 и 12 месяцев во всех группах уровень перфузии достоверно не отличался от показателей, выявленных при исследовании через 3 месяца после операции [рис. 6].

Показатели равномерности перфузии в патологической и референтной зонах на 10-е сутки после операции составили: в 1-ой группе - 2,7±0,2 и 2,1±0,2; во 2-ой - 2,6±0,2 и 1,8±0,3; в контрольной - 2,8±0,3 и 2,1 ±0,1.

Через 1,5 месяца после моделирования инфаркта в 1-й и во 2-й группах эти значения достоверно не отличались [2,1 ±0,1; 1,8±0,2 и 2,2±0,1; 1,9±0,2); в контрольной группе неравномерность перфузии нарастала и составила 2,9±0,2 в пораженном сегменте по отношению к 1,9±0,1 в интакт-ном сегменте.

На сроках 3 месяца, 6 и 12 месяцев в опытных группах динамики показателей равномерности перфузии не отмечалось. В контрольной группе по мере возрастания срока наблюдения происходило выраженное увеличение неравномерности перфузии в патологической зоне по отношению к референтной. К 3-му месяцу после операции этот показатель составил в патологической зоне 3,5±0,2, в референтной 2,0±0,1, через 6 месяцев 5,4±0,2 и 2,2±0,3, через 12 месяцев - 5,3±0,3 и 2,1±0,1 [рис. 7].

Представленные результаты показывают, что трансплантация ММСК и ЯСК костного мозга приводит к улучшению перфузии ишемизированного миокарда. Клетки, полученные из аспирата костного мозга, при культивировании образовывали колонии фибробластоподобных клеток, которые, по мнению А.Я. Фриденштейна [1991], являются потомками стволовой стромальной клетки [16]. Результаты окрашивания клеточной культуры реактивом BCIP-NBT и суданом-III показали отсутствие спонтанной остеогенной и адипоцитарной дифференцировки клеток, что подтверждает их низкую диф-ференцировку. D. Orlic et al. [2001 ] показали, что недифференцированные ММСК обладают тропностью к поврежденным тканям и при трансплантации в зону альтерации активно участвуют в репаративных процессах [17]. ММСК вырабатывают некоторые гемопоэтические и негемопоэтические ростовые факторы, интерлейкины и хемокины, а также экспрессируют рецепторы некоторых цитокинов и ростовых факторов. In vitro показано, что ММСК продуцируют цитокины: IL-1 a, IL-p, IL-6, IL-7, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, рецепторы для IL-1 а, IL-1p, IL-1, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, TNFa [tumor necrosis factor] [18,19]. Многие из этих цитокинов продуцируются конститутивно, а другие - только после стимуляции. P. Azarnous et al. продемонстрировали способность ММСК после трансплантации в поврежденный миокард крыс вырабатывать ци-токин HIF-1a [hypoxia-inducible factor-1 а), который оказывает цитопротективное действие и ингибирует апоптоз, что позволяет трансплантированным клеткам выжить в условиях ишемии [20]. Кроме того, ММСК могут продуцировать факторы SDF-1 [stromal cell derived factor-1), SCF [stem cell factor), G-CSF [granulocyte colony-stimulating factor), способные дополнительно вызывать мобилизацию и хоуминг ММСК костного мозга в ишемизированный миокард и пролиферацию трансплантированных ММСК [21 ]. Этот механизм позволяет увеличить количество ММСК в миокарде. Участие ММСК в неоангиогенезе связано со способностью этих клеток секретировать ангиогенные факторы, такие как VEGF [vascular endothelial growth factor), bFGF [basic fibroblast growth factor), HGF [hepatocyte growth factor), TGF-b [transforming growth factor b), ангиопоэтин-1 и экспрессировать на своей поверхности рецепторы для VEGF [VEGFR2), фибронектина, ламинина, молекулы адгезии ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1 [22]. Среди многочисленных факторов ключевую роль в неоангиогенезе играет VEGF, являясь важным пара-кринным фактором нормального развития коронарной сосудистой сети. Так, А. Al-Khaldi [2003) на модели острого инфаркта миокарда после введения ММСК с помощью моноклональных антител блокировал рецепторы к VEGF и не получал эффекта стимуляции ангиогенеза [11]. Вырабатываемые ММСК ангиогенные факторы способны мобилизовать про-гениторные эндотелиальные клетки из костного мозга, стимулировать пролиферацию эндотелиоцитов сосудов поврежденного миокарда и вызывать дифференцировку трансплантированных в миокард ММСК в эндотелиоциты, гладкие миоциты, перициты, фибробласты, которые затем становятся компонентами сосудистой стенки [23].

Таким образом, выявленное нами улучшение перфузии можно объяснить тем, что при попадании в поврежденный миокард ММСК способны активно участвовать в неоангиогенезе за счет продукции многочисленных ангиогенных факторов, мобилизации и хоуминга в инвалидизированный миокард ММСК и прогениторных эндотелиоцитов костного мозга, пролиферации и дифференцировки трансплантированных ММСК и регенерации эндотелия.

Трансплантация ЯСК костного мозга также приводила к полному восстановлению перфузии ишемизированного миокарда. Эти клетки представляют собой гетерогенную популяцию и содержат ММСК, гемопоэтические стволовые клетки, прогениторные эндотелиальные клетки, моноциты, лимфоциты и другие. ЯСК костного мозга после трансплантации в миокард секретируют ростовые факторы, создавая специфическое микроокружение, которое осуществляет контроль над процессами пролиферации и дифференцировки ММСК [9]. Однако роль этого механизма невелика, так как доля ММСК среди ЯСК минимальна. N. Takakura et al. [2000) показали, что гемопоэтические стволовые клетки способны продуцировать ангиогенные факторы роста, например, ангиопоэтин-1, который влияет на эндотелиальную дисфункцию путем повышения чувствительности эндотелия к ростовым факторам [24]. Присутствующие среди ЯСК костного мозга прогени-торные эндотелиальные клетки также вырабатывают факторы роста и участвуют в формировании новых сосудов. Основной механизм влияния ЯСК костного мозга на процессы неоангиогенеза реализуется через секрецию ангио-генных факторов в больших количествах: VEGF, bFGF, TGF-p, PDGF [platelet-derived growth factor] и другие. Эти факторы стимулируют пролиферацию эндотелиоцитов сосудов поврежденного миокарда и трансплантированных прогенитор-ных эндотелиальных клеток. Синтезируемые ЯСК костного мозга цитокины также способны вызывать регенерацию эндотелия [12]. Таким образом, трансплантация ЯСК костного мозга в ишемизированный миокард приводит к усилению ангиогенеза, скорее всего, за счет выработки большого количества ангиогенных факторов, стимуляции регенерации эндотелия, участия прогениторных эндотелиальных клеток в образовании новых сосудов, регуляции процессов пролиферации и дифференцировки ММСК.

В контрольной группе не было отмечено увеличения перфузии ишемизированного миокарда, а дефект перфузии сохранялся на всех сроках исследования. После коронароокклюзии в ишемизированный миокард из крови попадают нейтрофилы, лимфоциты и моноциты, которые вырабатывают разнообразные цитокины и ростовые факторы [VEGF, bFGF, TGF-p, IL-a, IL-1 p, IL-6, IL-7, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15] [25]. Однако в силу того, что в миокарде отсутствуют ММСК, а количество секретируемых ангиогенных факторов невелико, вероятно, процессы неоангиогенеза в поврежденном миокарде не выражены. Вместо этого развивается фибропластическая реакция стромы, проявляющаяся в пролиферации фибробластов, расположенных между группами кардиомиоцитов и вокруг сосудов.

Заключение

Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что интрамиокардиальная аутотрансплантация ММСК и ЯСК костного мозга приводит к полному восстановлению перфузии ишемизированного миокарда в эксперименте. Можно предположить, что трансплантированные ММСК, главным образом, влияют на процесс неоангиогенеза за счет их дифференцировки в сосудистые структуры и выработки ангиогенных факторов, а ЯСК - за счет секреции ростовых факторов. Однако механизм неоангиогенеза после трансплантации клеток до конца не изучен, что требует проведения дальнейших исследований.

Подняться вверх сайта