Поиск Кабинет

Влияние IL–3 на регенеративно–индукционную активность гемопоэтических стволовых клеток костного мозга при экспериментальном инфаркте миокарда

Гены & Клетки: Том IV, №4, 2009 год, стр.: 50-55

 

Авторы

Беляев Н.Н., Рысулы М.Р., Исабекова А.С., Северова Е.А., Поминова Н.М., Енин Е.А., Перфильева Ю.В., Супниязова Т.А., Тлеулиева Р.Т., Изахунова Э.А., Середа Е.Н., Федотовских Г.В., Денисов Ю.Д.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Целью исследования явилось изучение влияния гемопоэтических стволовых клеток (ГСЮ костного мозга в условиях культивирования ex vivo с цитокинами на их индукционно-регенеративную способность при экспериментальном инфаркте миокарда. Опыты проводили на беспородных белых крысах обоего пола. Модель мелкоочагового инфаркта миокарда создавали путем внутрибрюшинного введения р-адреномиметика изопротеренола. CD 117' ГСК выделяли из фракции костного мозга с плавучей плотностью 1,09 г/мл с помощью иммуно-магнитной сепарации и культивировали 48 ч в присутствии IL-3, после чего исследовали экспрессию рецептора CXCR4 и продукцию TGFp с помощью иммуноферментного анализа. Стимулированные IL-3 ГСК метили флуоресцентной меткой (CFSE) и вводили внутривенно животным с мелкоочаговым инфарктом миокарда. Оценивали продукцию фактора хоуминга SDF-1 в сердечной мышце после инфаркта, миграцию меченых ГСК в сердечную ткань и гистоморфологические изменения регенеративного характера. Установлено, что IL-3 достоверно усиливал экспрессию CXCR4 и секрецию TGFp при трехсуточном культиивровании. На 7-е сут. после введения изопротеренола наблюдалась тенденция к усилению продукции фактора хоуминга SDF-1 в сердечной мышце, которая затем исчезала по мере развития инфаркта миокарда. Локализация и характер изменений, происходящих в миокарде крыс, индуцированных изопротеренолом морфологически соответствовал мелкоочаговому инфаркту миокарда. Гистоморфологический анализ показал, что в случае введения стимулированных ГСК процессы репаративного моделирования миокарда и неоангиогенез усиливались. Проведенные эксперименты показывают перспективность использования новых подходов к усилению потенциальных регенеративных свойств ГСК костного мозга для лечения острого инфаркта миокарда.

Кардиоваскулярные заболевания в настоящее время лидируют среди причин смертности и инвалидиза-ции во всем мире. Из-за ограниченного потенциала миокарда к самовосстановлению и обновлению значительная часть сердечной мускулатуры в результате инфаркта теряет свою способность выполнять работу, обеспечивающую насосную функцию сердца, что приводит к хронической сердечной недостаточности [1]. Несмотря на успехи фармакологии в создании эффективных препаратов и развитие хирургических методов лечения, прогнозируется дальнейшее ухудшение ситуации.

Новейший подход к лечению сердечно-сосудистой недостаточности связан с восстановлением клеточной массы сердца с помощью трансплантации стволовых клеток [2—5]. В многочисленных экспериментальных и клинических исследованиях были получены многообещающие результаты по восстановлению функции сердца при введении стволовых клеток (СК) как эмбрионального, так и постнатального происхождения. Однако точный механизм этого эффекта остается неизвестным.

В качестве наиболее привлекательных источников постнатальных СК для целей клеточной терапии сердечной недостаточности в настоящее время рассматривают костный мозг, периферическую кровь взрослых и пуповинную кровь новорожденных.

В 2006 г. в ряде европейских стран были проведены клинические исследования влияния интракоронарного введения аутогенных мононуклеарных клеток костного мозга больным с ишемической болезнью сердца (ИБС) [6—8]. Результаты этих испытаний показали, что функциональное улучшение работы сердца (фракция выброса) у всех испытуемых не превышало 5%. В связи с этим ряд авторов высказался за мораторий на дальнейшие клинические испытания [9, 10] до тех пор, пока не будут получены ответы на три главных вопроса:

Какой тип клеток вызывает регенеративный эффект в миокарде? Каков оптимальный способ введения клеток? Каковы механизмы действия трансплантированных клеток? Полагают, что необходимо сконцентрировать усилия на разработке методов стимуляции СК в условиях ех vivo до введения в организм с целью усиления их регенеративного потенциала [11].

Целью исследования явилось изучение влияния стимуляции гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) костного мозга в условиях культивирования ex vivo ци-токинами на усиление их индукционно-регенеративной способности при экспериментальном инфаркте миокарда.

Материал и методы

Животные. Опыты проводили на беспородных белых крысах обоего пола весом 160^190 г. Животных содержали в виварии НИИ Кардиологии и внутренних болезней М3 РК в соответствии с общепринятыми нормами.

Получение суспензии клеток костного мозга (ККМ)[Л 2]. Интактных крыс обездвиживали эфирным рауш-наркозом и декапитировали. Костный мозг выделяли из бедренных и большеберцовых костей путем промывания их средой DMEM (Sigma, США). Во всех экспериментах жизнеспособность клеток в суспензии, оцениваемая по исключению трипанового синего, превышала 90%.

Приготовление перкола. Для приготовления перкола необходимой плотности, используемого для выделения мононуклеарных клеток из суспензии ККМ, к исходному перколу добавляли стерильный 10 объемных процентов 1,5 М раствора NaCI и затем доводили стерильной деионизированной водой до необходимого объема. Объем перкола рассчитывали согласно рекомендациям фирмы-производителя по следующей формуле:

Фракционирование ККМ на перколе [13]. Суспензию ККМ наносили на двухступенчатый градиент плотности (1,10 и 1,09 г/мл) перкола (Pharmacia, США) и центрифугировали при 1400 g в течение 20 мин. Фракцию с плавучей плотностью 1,09 г/мл отмывали от примеси перкола при 150 g в течение 10 мин средой DMEM и использовали для оценки влияния цитокинов на экспрессию рецепторов CXCR4 для хемокина SDF-1 и продукции TGFp, или подвергали иммуномагнитной сепарации.

Стимуляция ГСК цитокинами. Выделенные клетки в концентрации 2x108 кл./мл культивировали в 96-луноч-ных планшетах в культуральной среде Stemline II (Sigma, США), содержащей различные цитокины, и в течение 72 ч при стандартных условиях культивирования (+ 37°С, 80% влажности и 5% С02) в С02-инкубаторе. После окончания инкубации культуральную среду собирали и исследовали на наличие TGFp с помощью иммуно-ферментного анализа, используя коммерческую тест-систему (RS.D Systems, США). Клеточный осадок использовали для определения экспрессии рецептора CXCR4.

Иммуноферментный анализ CXCR4 на мононуклеарных клетках. По окончанию культивирования с цитокинами клетки собирали из ячеек, переносили в микропробирки типа «эппендорф», дважды отмывали в 5 мМ фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБР), содержащем 150 мМ NaCI и 0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) (Sigma, США), центрифугированием при 500 g в течение 5 мин., ресуспендировали в 0,1 мл в концентрации 10е кл./мл того же раствора и проводили иммуноферментный анализ на выявление поверхностных клеточных рецепторов CXCR4. Для этого сначала суспензию исследуемых клеток обрабатывали раствором IgG (10 мкг/мл) мыши в течение 15 мин при комнатной температуре, добавляли моноклональные антитела к CXCR4, меченные биотином (RS.D Systems, США), из соотношения 10 мкл/105 кл., инкубируя 1 ч при 8°С. После двухкратной отмывки ФСБР-БСА к клеточному осадку добавляли стрептавидин-пероксидазный полимерный конъюгат (Sigma, США) в разведении 1:3000 и инкубировали при 8°С в течение 30 мин. Затем после двухкратной отмывки к осадку добавляли раствор о-фенилендиамина (Sigma, США) в стандартном фос-фатно-цитратном буферном растворе и инкубировали в темноте 30 мин. Реакцию останавливали 4 н раствором серной кислоты. После завершения иммунофер-ментной реакции клетки осаждали центрифугированием, а надосадок переносили в 96-луночный планшет и ко-лориметрировали при 492 нм на иммуноферментном анализаторе. В качестве контроля использовали клетки, не активированные цитокинами.

Иммуномагнитная сепарация. Мононуклеарные клетки с плавучей плотностью 1,09 г/мл согласно инструкции фирмы-производителя (Miltenyi Biotec, США) ресуспендировали в стерильном ФСБР, содержащем 0,5% фетальной телячьей сыворотки (ФТС) (БиоЛот, РФ), добавляли к ним магнитные бусы, нагруженные моноклональными антителами к маркеру мышиных ГСК (CD117), и инкубировали 15 мин на льду. Затем взвесь клеток отмывали ФСБР-ФТС, центрифугируя при 300 g 10 мин, и ресуспендировали в 500 мкл ФСБР-ФТС. Взвесь пропускали через колонку MS + , помещенную в магнитный сепаратор Vario MACS (Miltenyi Biotec, США). Магнитно-меченные ГСК выдавливали плунжером из колонки после удаления ее из магнитного поля. Выделенные CD117+ ГСК подсчитывали в камере Горяева и использовали для экспериментов.

Флуоресцентное мечение ГСК. Для оценки тропизма стимулированных и нестимулированных ГСК в ткани сердца CD117+ клетки метили флуоресцентным прижизненным красителем [14]. Для этого клетки ресуспендировали в 1 мл стерильного ФСБР и добавляли 3,3 мкл 10 мМ водного раствора CFSE (5(6)carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester) (Sigma). После 30-минутной инкубации при 37°С клетки отмывали стерильным ФСБР центрифугированием при 300 g 10 мин, подсчитывали и доводили до концентрации 2x108 кл./мл.

Моделирование мелкоочагового инфаркта миокарда. Мелкоочаговый некоронарогенный инфаркт миокарда у крыс создавали путем внутрибрюшинного введения раствора изопротеренола из расчета 80 мг/кг в 0,2 мл физиологического раствора дважды в день с интервалом 24 ч. Согласно проведенным ранее исследованиям у нелинейных крыс наиболее выраженные морфологические изменения в миокарде (множественные мелкоочаговые некрозы) возникали при такой схеме и дозе введения [15].

В исследованиях были использованы CD117+ клетки, стимулированные и нестимулированные рекомбинантным крысиным IL-3 (PeproTech Asia/CytoLab) в дозе 50 МЕ/мл. 10е клеток, ресуспендированные в 0,5 мл ФБР вводили в бедренную вену через 9 сут. после последней инъекции изопротеренола.

Определение SDF-1 в гомогенатах сердца. Крыс обездвиживали эфирным рауш-наркозом и декапитировали. Извлеченные сердца помещали в ФСБР и тщательно ополаскивали, подсушивали фильтровальной бумагой и взвешивали на электронных весах. Затем дважды быстро замораживали в жидком азоте и размораживали, растирали в фарфоровой ступке в 2 мл ФСБР. Полученный гомогенат центрифугировали в течение 30 мин при 0°С при 30000 д. Супернатант подвергали иммуно-ферментному анализу на наличие SDF-1 с помощью коммерческой тест-системы (RS.D Systems, США). Проводили перерасчет концентрации SDF-1 на объем супернатанта и высчитывали удельное содержание SDF-1 в фг/г веса ткани сердца.

Гистоморфологический анализ. Материал для гистологического исследования фиксировали в 10% забу-ференном растворе формалина, для электронно-микроскопического — в 2,5% растворе глютаральдегида (Sigma, США). Проводку осуществляли по общепринятой гистологической методике. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофукси-ном по Ван Гизону. Препараты изучали на световом микроскопе «Leica» DM 4000В с цифровой фотокамерой «Leica» DFC 320.

Для оценки тропизма ГСК в тканях сердца CFSE-меченные CD34+ клетки вводили в бедренную вену и через 3 сут. животных выводили из эксперимета, извлекали сердца и готовили криостатные срезы на криокамере Leika СМ 151 OS при минус 30^35°С. Срезы исследовали под микроскопом Axiostar plus с ультрафиолетона цифровую камеру.

Статистический анализ. Полученные данные обрабатывали методами математической статистики, используя прикладную программу Microsoft Excel. Вычисляли среднюю арифметическую, среднюю квадратическую ошибку средней арифметической и достоверность различия средних (Р), используя функцию ТТЕСТ.

Результаты и обсуждение

С целью индукции у ГСК повышенной регенеративной активности инкубировали CD117+ клетки, полученные из фракции ККМ с плавучей плотностью 1,09 г/мл от интактных крыс, в присутствии различных рекомбинантных мышиных цитокинов IFNy, IL-2, G-CSF или кры- синым IL-3 (PeproTech Asia/CytoLab, Израиль) в течение 72 ч. Выбор цитокинов обусловлен предположением об их участии в активации ГСК и ранних прогениторов, экспериментальное обоснование которого мы сделали ранее [16]. Результаты иммуноферментного анализа экспрессии рецептора CXCR4 к хемокину SDF-1, под действием цитокинов в различных концентрациях представлены на рис. 1. Только IL-3 в концентрации 20 нг/мл способен достоверно индуцировать экспрессию рецептора к фактору хоуминга SDF-1.

Оценка продукции TGFp клетками CD117+ показала, что IL-3 достоверно стимулирует продукцию этого цито-кина (рис. 2). Таким образом, трехсуточная инкубация ГСК, выделенных из костного мозга, вызывала экс-прес-сию СХОМ-рецепторов и усиление продукции ангиоген-ного фактора TGFp, что расценивается нами как увеличение их индукционно-регенеративного потенциала.

Регенеративные изменения в тканях сердца при экспериментальном инфаркте миокарда у крыс, индуцированные ГСК, активированными IL-3, мы оценивали с помощью гистологических исследований.

Как было показано ранее, введение изопротеренола вызывает структурные изменения миокарда у всех исследуемых животных [15]. Причем множественные очаги некрозов при введении данной дозы изопротеренола наблюдаются в стенке левого и правого желудочков, меж-желудочковой перегородке и верхушке сердца. Локализация и характер изменений, наблюдаемых в миокарде крыс, морфологически соответствует мелкоочаговому инфаркту миокарда.

Животных с экспериментальной моделью мелкоочагового инфаркта миокарда разделили на 3 группы. В первой группе животным внутривенно вводили стерильный ФСБР, во второй — неактивированные ГСК, в третьей — активированные IL-3 ГСК. Гистологические исследования тканей сердца проводили на 12-е и 21-е сут. от последнего введения изопротеренола.

На 12-е сут. в контрольной группе животных наблюдалась классическая картина мелкоочагового инфаркта миокарда (рис. ЗА). Микроскопия полутонких срезов показала некроз отдельных кардиомиоцитов, отек стромы, исчезновение гликогена в цитоплазме кардиомиоцитов (рис. 4А). Отмечались уменьшение поперечной исчерчен-ности миофибрилл, расслабление саркомеров и очаговая контрактурная дегенерация кардиомицитов. Наблюдались также дефекты плазматической мембраны, выраженный отек стромы, гомогенизация цитоплазмы, начало организации рубцовой ткани.

В группе животных с введением неактивированных клеток световая микроскопия показала нечеткие границы ядер, сохранение уплотнения хроматина (рис. ЗБ). В отдельных участках наблюдалось восстановление поперечной исчерченности миофибрилл. Микроскопия полутонких срезов выявила в зоне инфаркта в кардио-миоцитах накопление гликогена, увеличение поперечной исчерченности миофибрилл, что свидетельствовало об улучшении энергетического обмена и восстановлении сократимости. При этом сохранялись контрактурные изменения и сближение анизотропных дисков (рис. 4Б).

В группе животных с введением IL-3-активированных ГСК в зоне повреждения миокарда выявлялись очаги образования новых микрососудов (рис. ЗВ). На полутонких срезах видны четкие мембраны ядер кардиомиоцитов (рис. 4В). Местами наблюдался отек ткани, появлялся «капельный» гликоген, поперечная исчерченность миофибрилл была хорошо выражена (значительное улучшение энергетического обмена и сократимости), но сохранялись единичные участки со сближением анизотропных дисков.

Через 21 сут. после введения изопротеренола были выявлены с помощью световой микроскопии следующие изменения в миокарде.

В контрольной группе (рис. ЗГ) в зоне рубцующегося инфаркта миокарда появились немногочисленные сосуды. Мышечные волокна непосредственно внутри соединительнотканного очага выглядели атрофичными, кардиомиоциты, расположенные вокруг соединительнотканного рубца, напротив, были гипертрофированы. У отдельных особей встречались и более тяжелые изменения кардиомиоцитов, имеющие дистрофический и некробиотический характер, локализующиеся вблизи эндокарда, которые характеризовались прогрессивным исчезновением саркоплазмы.

В группе животных после введения неактивированных ГСК в области верхушки сердца наблюдалась неправильной формы зона инфаркта миокарда в стадии организации (рис. ЗД). Зона некроза кардиомиоцитов замещалась новообразованной рыхлой соединительной тканью, в которой определялись немногочисленные тонкостенные сосуды, а также островки сохранившихся кардиомиоцитов. Мышечные клетки, прилежащие к зоне поражения, были гипертрофированы.

В группе животных после введения активированных ГСК в миокарде обнаруживались множественные очаги пролиферации соединительнотканных элементов вокруг погибших групп мышечных волокон. Кроме лейкоцитов среди пролиферирующих клеток наблюдались макрофаги, фибробласты, единичные лимфоидные клетки. Среди сформированной фиброзной ткани отмечались многочисленные тонкостенные сосуды. Мышечные волокна в непосредственной близости от зоны инфаркта были гипертрофированы и содержали крупные полиморфные ядра. Таким образом, в сердце стимулировался процесс появления в поврежденном миокарде макрофагов, активно фагоцитирующих клеточный детрит, а также усиленное формирование новых микрососудов.

Анализ удельного содержания SDF-1 в тканях интакт-ных и инфарктных сердец представлен на рис. 5. В течение первых 7 сут. после введения изопротеренола наблюдается тенденция к усилению продукции фактора хоуминга SDF-1 в сердечной мышце, которая затем исчезает по мере развития ИМ. С целью оценки усиления тропизма активированных ГСК в ткани сердца при инфаркте миокарда мы вводили флуоресцентно-меченные ГСК интактным крысам и крысам опытных групп на 9-е сут. после последнего введения изопротеренола. Оказалось, что меченые клетки через 3 сут. наблюдались только в препаратах сердец животных с моделью мелкоочагового инфаркта. На рис. 6 отчетливо видно, что флуоресценция выглядит значительно ярче в случае использования стимулированных IL-3 клеток (рис. 6Б).

В основу идеологии усиления регенеративных эффектов постнатальных стволовых клеток в сердечной ткани при инфаркте миокарда мы заложили три методических приема:

1) использование «очищенных» CD117+ ГСК;

2) стимуляция экспрессии CXCR4;

Установлено, что CD117, маркер ранних ГСК, присутствует также на эндотелиальных прогениторных клетках [17, 18], мобилизация которых из костного мозга наблюдается на ранних стадиях развития инфаркта миокарда [19]. Ранее мы показали присутствие в костном мозге мышей CD34+ клеток с плавучей плотностью 1,09 г/мл [16]. Поэтому в настоящем исследовании для выделения CD117+ клеток с помощью иммуномагнит-ной сепарации мы использовали более тяжелую моно-нуклеарную фракцию ККМ, чем это принято в подобных исследованиях (1,077 г/мл).

Вопрос об усилении направленной миграции ГСК в область повреждения ткани интенсивно обсуждается [20]. Самым изученным хемоаттрактантом для ГСК на сегодняшний день является белок SDF-1 (stroma-derived factor-1). В норме он продуцируется стромальными клетками костного мозга и удерживает ГСК в своей стволовой нише за счет экспрессии на их поверхности рецептора для хемокинов CXCR4. Имея такой рецептор, ГСК мигрируют в сторону большей концентрации SDF-1 [21-23]. В нашем исследовании отмечается усиление продукции SDF-1 в миокарде в ранние сроки развития инфаркта. Мы также показали, что IL-3 индуцирует усиление экспрессии рецептора CXCR4 на CD117+ клетках. Оба этих события, по-видимому, приводят к увеличению численности вводимых флуоресцентно-меченных ГСК в сердечной мышце. Одним из многочисленных плейотропных эффектов вание кровеносных сосудов, влияя на миграцию, пролиферацию эндотелиоцитов, а также образование трубчатых структур [24]. Способность ГСК к индуцированной нее [16, 25]. Таким образом, доказано, что ГСК, стиму именно с этим связано усиление неоваскуляризации в миокарде крыс, наблюдаемое нами после введения стимулированных ex vivo клеток.

Проведенные нами эксперименты показывают перспективность использования новых подходов к усилению потенциальных регенеративных свойств ГСК костного мозга для лечения острого инфаркта миокарда.

Подняться вверх сайта