Поиск Кабинет

Влияние фотодинамически индуцированной генерации АФК на состояние митохондрий и лизосом культивируемых мезенхимных стромальных клеток человека

Гены & Клетки: Том V, №4, 2010 год, стр.: 38-42

 

Авторы

Ударцева О.О., Андреева Е.Р., Рылова Ю.В., Буравкова Л.Б.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Исследовано влияние повышения уровня активных форм кислорода (АФК), индуцированного фотодинамическим воздействием (ФДВ), на состояние митохондрий и лизосом мезенхимных мультипотентных стромальных клеток из жировой ткани человека (жММСЮ, культивируемых при различном содержании 02 в среде (20% и 5% OfJ. Уровень АФК в клетках оценивали по интенсивности флуоресценции HSDCF — продукта HSDCFDA. Для визуализации митохондрий и лизосом в клетках использовали флуоресцентные зонды Mitotracker Red 580 и Lysotracker Green соответственно.

Показано, что при культивировании в среде с пониженным содержанием 02 увеличивалась как доля жММСК, содержащих АФК, так и уровень АФК в них. При этом жизнеспособность клеток, культивируемых при 20% и 5% 02, не отличалась. Культивирование жММСК при пониженном содержании 02 сопровождалось увеличением митохондриальной и снижением лизосомальной активности. ФДВ индуцировало повышение уровня АФК в жММСК и клеточную гибель. После ФДВ уменьшалось как количество функционирующих митохондрий и лизосом в клетках, так и доля жММСК, содержащих активные органеллы.

Таким образом, повышение уровня АФК в жММСК при пониженном содержании 02 не сопровождается уменьшением их функциональной активности, тогда как генерация АФК при ФДВ приводит к нарушению жизнедеятельности клеток.

Фотодинамическое воздействие[ФДВ] — двухкомпонентный метод, основанный на взаимодействии вещества-фотосенсибилизатора (ФСЭ и низкоинтенсивного лазерного излучения[1]. Под воздействием света определенной длины волны ФС переходит в возбужденное состояние и взаимодействует с молекулярным кислородом и макромолекулами клетки. В результате образуются активные формы кислорода (АФЮ, которые, как известно, влияют на различные клеточные процессы[2].

В настоящее время ФДВ широко используется в клинической практике для элиминации новообразований, после чего в месте прежней локализации опухоли происходит частичное или полное восстановление исходной тканевой структуры. Основными клеточными элементами тканевой репарации после ФДВ являются клетки стромы и паренхимы органов. Физиологический уровень 02 в тканях составляет 4—7%, а опухоли характеризуются еще более низким содержанием 02. Соответственно, репаративные процессы после ФДВ также будут происходить в условиях гипоксии. Однако исследования эффектов ФДВ на различных клеточных моделях проводятся, как правило, при стандартных условиях культивирования, подразумевающих нормоксический состав газовой среды[20% 02).

Ранее было показано, что культивирование мезенхимных мультипотентных стромальных клеток (ММСЮ, полученных из различных источников, в условиях пониженного содержания 02 стимулирует пролиферацию и повышает их устойчивость к различным повреждающим факторам, то есть значительно изменяет их функциональные свойства[3—5]. В настоящей работе было изучено влияние гипоксии на чувствительность ММСК к ФДВ, а также влияние ФДВ и пониженного содержания 02 в среде на состояние митохондрий и лизосом.

Материал и методы

Выделение и культивирование ММСК жировой ткани человека

ММСК выделяли из жировой ткани (жММСК) человека, полученной в ходе липосакции, путем ферментативной обработки 0,075% коллагеназой типа la (Sigma, США), согласно описанной ранее методике[5, 6]. Клетки культивировали в среде ДМЕМ с низким содержанием глюкозы (Биолот, Россия) с добавлением 10% ЗТС (HyClone, США), 2 мМ L-my-тамина (ПанЗко, Россия) и 100 мкг/мл пенициллин-стрептомицина (ПанЗко, Россия). После выделения одну часть клеток помещали в С02-инкубатор (5% С02, 20% 02, 75% N2), а другую — в мультигазовый инкубатор (5% С02, 5% 02, 75% N2). В экспериментах использовали жММСК 2-10 пассажей.

ФДВ

ФДВ проводили на жММСК, культивируемых в условиях 5% и 20% 02. В качестве фотосенсибилизатора использовали Фотосенс® (ФС®) (НИОПИК, Россия). Клетки, достигшие 70-80% конфлуентнос-ти, инкубировали в течение 24 часов с ФС® в конечной концентрации 10 мкг/мл. Далее краситель отмывали, клетки облучали лазером (л = 675 нм) (АЗОР ФДВ). Доза облучения составляла 1 и 2 Дж/см2.

Выявление АФК в клетках

Для выявления активных форм кислорода (АФК) использовали дихлордигидрофлуоресцеиндиацетат (H2DCFDA) (Invitrogen, США), который добавляли на 30 минут в среду культивирования в концентрации 10 мкМ. Этот зонд не обладает собственной флюоресценцией, но в присутствии АФК превращается во флуоресциирующий продукт H2DCF, который может быть визуализирован. При изучении повышения уровня АФК, индуцированного ФДВ, H2DCFDA добавляли к клеткам непосредственно после облучения. Через 30 минут клетки трижды отмывали ФСБ (Gibco, США) и анализировали методами флуоресцентной микроскопии (Leica DM В5000) или проточной цитофлуори-метрии Epics XL (Beckman Coulter, США). Содержание АФК в клетках оценивали в относительных единицах по среднему значению интенсивности флуоресценции H2DCF, приходящейся на клетку.

Оценка жизнеспособности клеток Жизнеспособность клеток оценивали с помощью набора AnnexinV-FITC^ Propidium Iodide (Immunotech, Франция). Клетки окрашивали по стандартному протоколу и анализировали на проточном цитофлуо-риметре. В случае ФДВ жизнеспособность клеток оценивали через 2 ч после облучения.

Оценка состояния митохондрий и лизосом Для определения функциональной активности митохондрий и лизосом использовали митотрекер (Mitotracker Red 580) и лизотрекер (Lysotracker Green) (Invitrogen, США) соответственно. Митотрекер — катионный потенциал-зависимый краситель, интенсивность флуоресценции которого определяется мембранным потенциалом. Лизотрекер является флуоресцентным индикатором закисления pH в различных клеточных компартментах. Красители добавляли в среду культивирования на 1 ч: митотрекер — в концентрации 500 нг/мл, лизотрекер — в концентрации 200 нг/мл. Далее клетки промывали ФСБ и анализировали методами флуоресцентной микроскопии и проточной цитофлуориметрии. Активность митохондрий и лизосом оценивали по среднему значению интенсивности флуоресценции зонда, приходящейся на клетку.

Результаты

Влияние пониженного содержания Os и ФДВ на содержание внутриклеточных АФК и жизнеспособность жММСК

При культивировании в условиях 20% 02 АФК в клетках практически не детектировались методом флуоресцентной микроскопии (рис. 1 А). Однако посредством проточной цитофлуориметрии было показано, что в среднем 38,5% жММСК при культивировании в стандартных условиях содержат АФК в небольших количествах (рис. 2А). При культивировании в среде с пониженным содержанием 02 92,9% жММСК содержали АФК и средняя интенсивность флуоресценции на клетку была выше, чем у клеток в условиях 20% 02 (рис. 1Б; 2Б). Несмотря на то, что содержание АФК в жММСК, культивируемых в условиях 5 и 20% 02, различалось, жизнеспособность этих клеток была одинаковой (рис. 3).

Облучение жММСК, нагруженных ФС®, приводило к образованию АФК, при этом уровень внутриклеточных АФК после ФДВ был выше, чем при снижении содержания 02 в среде. Количество клеток, содержащих АФК, зависело от дозы облучения. При облучении дозой 1 Дж/см2 практически все жММСК содержали АФК (см. рис. 1 В; 2В), а при облучении дозой 2 Дж/см2 ^только 72% клеток (рис. 2Г). Влияние ФДВ на жизнеспособность определялось дозой облучения (см. рис. 3). Так, ФДВ с использованием дозы 2 Дж/см2 обладало выраженным цитотоксичес-ким эффектом и снижало жизнеспособность жММСК до 70%, что объясняет уменьшение доли АФК-содер-жащих клеток при этой дозе облучения, поскольку при повреждении клеточных мембран H2DCF выходит из клеток.

Влияние пониженного содержания Os и ФДВ на состояние митохондрий и лизосом жММСК

При культивировании в среде с пониженным содержанием 02 интенсивность флуоресценции зонда в митохондриях возрастала, что свидетельствовало о повышении функциональной активности митохондрий (рис. 4Б, Д). Одновременно с этим, активность лизосом в клетках снижалась (рис. 4В, Е).

Накопление ФС® клетками, культивируемыми при различном содержании 02, не оказывало влияния на состояние митохондрий и активировало лизосомаль-ный компартмент жММСК (рис. 5).

Активация лизосом проявлялась как в увеличении количества окрашенных лизотрекером клеток, так и в повышении интенсивности их окраски. Облучение клеток, накопивших ФС®, приводило к одновременному снижению функциональной активности митохондрий и лизосом жММСК, что выражалось как в уменьшении количества окрашенных зондами клеток, так и в снижении интенсивности флуоресценции зонда на клетку (см. рис. 5).

Обсуждение

Одним из основных клеточных элементов, принимающих участие в тканевой регенерации и репарации, являются MMCK. В настоящее время практически все исследования, посвященные изучению функциональных особенностей этих клеток, проводятся при атмосферном содержании 02 в среде — 20%. Однако общеизвестно, что физиологический уровень 02 в тканях составляет 4—7%, а в очагах повреждения клетки находятся в условиях еще меньшего содержания 02. В нашей лаборатории ранее было показано, что культивирование MMCK при 5% 02 сопровождается изменением их морфологии, стимулирует пролиферативную активность и не влияет на иммунофенотип и жизнеспособность клеток[4, 5].

АФК постоянно образуются в живых клетках как продукты нормального метаболизма 02. АФК могут также возникать спонтанно в реакциях перекисного окисления макромолекул клетки. В образовании АФК участвуют не только митохондрии, но и эндоплазма-тический ретикулум, и другие органеллы. Кроме того, продукция АФК в клетках может быть вызвана внешним (например, фотодинамическим) воздействием. Биологический эффект АФК в зависимости от концентрации может быть регуляторным, защитным или токсическим[2, 7—Э], Патологические последствия возникают при чрезмерном накоплении АФК, пероксидов и их вторичных продуктов — состоянии, называемом обычно окислительным стрессом. В настоящей работе сравнивали эффекты увеличения внутриклеточного содержания АФК, происходящего при физиологических условиях (снижение содержания 02 в среде) и индуцированного ФДВ. Как ФДВ, так и культивирование жММСК при 5% 02 сопровождались повышением уровня АФК, однако эти факторы по-разному влияли на функциональное состояние клеток.

Известно, фотодинамический эффект обусловлен образованием АФК в клетках и определяется дозой облучения и концентрацией фотосенсибилизатора. С помощью метода ФДВ мы индуцировали контролируемую генерацию АФК в жММСК. После ФДВ 2 Дж/см2 окрашенных зондом клеток было меньше, чем после ФДВ 1 Дж/см2. Можно предположить, что этот эффект объясняется нарушением целостности клеток при избыточной генерации АФК, поскольку дозы ФДВ выше 1 Дж/см2 вызывали клеточную гибель. Уровень АФК в жММСК, культивируемых при 5%, был ниже, чем после ФДВ. Снижение содержания 02 в среде не оказывало влияния на жизнеспособность клеток.

При изучении влияния АФК на состояние митохондрий и лизосом жММСК было показано, что эффект АФК определяется способом их генерации. Так, при образовании АФК в условиях пониженного содержания 02 функциональная активность митохондрий в клетках возрастала, а лизосом — снижалась. Это свидетельствовало об усилении клеточного метаболизма. В частности, снижение активности лизосом может указывать на преобладание процессов анаболизма над процессами катаболизма в клетках. ФДВ приводило к снижению активности как митохондрий, так и лизосом, что может свидетельствовать о преобладании процессов клеточной деструкции и подтверждается данными по жизнеспособности клеток.

В отличие от ФДВ, механизмы образования АФК и клеточного сигналинга при снижении содержания 02 мало изучены и требуют дальнейших исследований. Согласно результатам некоторых исследователей, уменьшение содержания 02 в среде увеличивает продукцию АФК в клетках, что коррелирует с полученными нами данными[10—14]. Основную роль в продукции АФК при гипоксии отводят митохондриям, в частности, митохондриальному комплексу III[12, 13]. Предполагают, что супероксид-анион в этих условиях накапливается в межмембранном пространстве митохондрий, где и метаболизируется супероксиддис-мутазой. Образующаяся Н202, вероятно, способна стабилизировать фактор гипоксии (HIF), который инициирует синтез различных белков, обеспечивающих выживание и адаптацию клеток[10].

Можно предположить, что различие клеточных ответов жММСК на АФК объясняется следующими причинами. Известно, что биологический эффект АФК зависит от их концентрации[7—9], причем при низких концентрациях АФК наблюдается преимущественно регуляторный эффект, а при высоких — токсический. В нашей работе было показано, что количество АФК, образующихся после ФДВ, выше, чем при гипоксии. Соответственно, АФК, образующиеся при снижении концентрации 02 в среде, могут инициировать HIF-зависимую транскрипцию генов и адаптивный ответ[12]. В то же время ФДВ приводит к образованию избыточного количества АФК и индуцирует клеточную гибель. Локализация АФК, образующихся при гипоксии и после ФДВ, вероятно, также различается. Как упоминалось выше, при снижении концентрации 02 супероксид-анион продуцируется в межмембранном пространстве митохондрий[13], где в ходе ферментативных реакций он превращается в менее активные продукты. При ФДВ в зависимости от структуры фотосенсибилизатора образование АФК происходит в мембране, цитоплазме или различных органеллах[1 ], что приводит к одновременному повреждению различных клеточных структур.

Таким образом, в нашей работе показано, что уровень АФК в жММСК, культивируемых при 5% 02, выше, чем в клетках, культивируемых при 20% 02. Биологический эффект АФК зависит от их уровня в клетках и способа генерации. АФК, возникающие при гипоксии, не снижают функциональную активность жММСК, тогда как фотодинамически опосредованная индукция АФК приводит к нарушению жизнедеятельности клеток.

Подняться вверх сайта