Поиск Кабинет

Влияние биназы на форболмиристатацетат- индуцированный апоптоз в гранулоцитах и моноцитах венозной крови человека

Гены & Клетки: Том VII, №3, 2012 год, стр.: 108-111

 

Авторы

Миронов В.А.,  Ширшиков Ф.В., Калачева Н.В., Черепнев Г.В.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Изучено влияние нетоксичной (40 мкг/мл) и токсичной (400 мкг/мл) концентраций биназы (РНКазы Bacillus intermedius) на развитие форбол-миристатацетат(ФМА)индуцированного апоптоза в гранулоцитах и моноцитах крови человека in vitro методом лазерной проточной цитофлуориметрии. Конечный эффект биназы зависит от субпопуляционной принадлежности клеток-мишеней и концентрации препарата. B гранулоцитах биназа в концентрации 400 мкг/ мл выраженно активирует ФМА-индуцированный апоптоз. В моноцитах в концентрации 40 мкг/мл биназа проявляет протекторный эффект, увеличивая долю жизнеспособных клеток и замедляя переход клеток из фазы раннего в фазу позднего ФМА-индуцированного апоптоза.

В течение последнего десятилетия общая фармакология апоптоза становится областью пристального внимания, а понимание возможностей медикаментозного контроля апоптоза приобретает растущее значение для фармацевтической промышленности [1].

Восстановление чувствительности клеток к индукции апоптоза имеет терапевтическое значение при неоплазиях, лимфопролиферации и аутоиммунных болезнях. Напротив, если ведущим компонентом патологического процесса является клеточная гибель (ишемия тканей, нейродегенерация, депрессия гемопоэза, ВИЧ-инфекция, ожоговая болезнь и др.), то патогенетически обосновано подавление апоптоза. Учитывая социальное значение апоптоз-зависимых заболеваний, фармакологи и клиницисты считают приоритетным поиск соединений с направленным воздействием на программированную клеточную гибель [2, 3].

Объект настоящего исследования – РНКаза Bacillus intermedius (биназа), которая обладает целым рядом биологических эффектов, в том числе, способностью избирательно подавлять рост некоторых линий онкотрансформированных клеток, переводя их на путь апоптоза [4]. Кроме того, нами показано, что биназа в зависимости от концентрации избирательно модулирует пероксид-индуцированый апоптоз в моноцитах крови человека [5]. В продолжение этих исследований мы изучили влияние биназы на развитие форболмиристатацетат-индуцированного апоптоза в моноцитах и гранулоцитах крови человека.

Материал и методы

РНКаза Bacillus intermedius (биназа) – катионный белок с молекулярной массой 12,3 кДа, изоэлектрической точкой pI 8,9 и максимальной каталитической активностью при рН 8,5. В работе использовали гомогенный препарат РНКазы, полученный по методу [6]. Апоптоз моноцитов и гранулоцитов крови человека исследовали методом лазерной проточной цитометрии с помощью флуорохромов – мероцианина 540 (МС-540) (Sigma) и TO-PRO-3 дийодида (Invitrogen). Индуктором апоптоза служил форбол12-миристат-13-ацетат (ФМА).

Выделение суспензии лейкоцитов венозной крови. Лейкоциты выделяли из венозной крови здоровых доноров добровольцев, от которых было получено информированное согласие. Протокол исследования одобрен этическим комитетом ГАУЗ РКБ-2 МЗ РТ. Гепаринизированную венозную кровь отстаивали в течение 30 мин при 37°С, отбирали слой сыворотки с лейкоцитами и отмывали клетки центрифугированием (200 g, 10 мин). Полученный осадок лейкоцитов ресуспензировали в фосфатно-солевом буфере (pH 7,4) до конечной концентрации 106 клеток/мл и раскапывали по 250 мкл в пробирки для проточной цитометрии (Falcon 352054, BD).

Подготовка клеточных проб для анализа ФМАиндуцированного апоптоза. В опытные пробы вносили раствор биназы в фосфатно-солевом буфере (конечная концентрация 400 и 40 мкг/мл), инкубировали 30 мин и добавляли ФМА (конечная концентрация 10-7 М). В контрольные пробы вместо биназы и ФМА вносили фосфатно-солевой буфер в эквивалентном объеме. Клетки инкубировали 3 ч в СО2-инкубаторе при 37°C и 100% влажности. После инкубации клетки дважды промывали в фосфатносолевом буфере центрифугированием при 250 g в течение 5 минут, ресуспензировали в 500 мкл буфера и вносили флуорохромы МС540 и TO-PRO-3 дийодид. Пробы инкубировали 10 минут в атмосфере 5% СО2 при 37°C и анализировали на проточном цитофлуориметре.

Определение экспрессии фосфатидилсерина и проницаемости цитоплазматической мембраны методом проточной цитометрии. Цитометрический анализ субпопуляций лейкоцитов проводили на проточном лазерном цитофлуориметре FacsCalibur (Becton Dickinson, USA), оснащенном двумя лазерами с длиной волны 488 нм и 635 нм. Экспрессию фосфатидилсерина (ФС) и проницаемость плазматической мембраны на уровне отдельной клетки оценивали по модифицированному протоколу [7]. В суспензию, содержащую 106 клеток/мл, за 10 мин перед цитометрическим анализом вносили ФС-связывающий флуорохром МС-540 в конечной концентрации 0,2 мкг/мл. Для оценки проницаемости плазматической мембраны в клеточную суспензию одновременно с MC-540 вносили TO-PRO-3-йодид в конечной концентрации 0,2 мкM. МС540 связывается с остатками фосфатидилсерина, экспонированного на мембране апоптозных клеток. ДНК-тропный флуорохром TO-PRO-3 через поврежденную цитоплазматическую мембрану проникает внутрь клетки и окрашивает ДНК. Моноцитарную и гранулоцитарную субпопуляции выделяли по показателям прямого (FSC, диаметр клетки) и бокового (SSC, гранулярность клетки) светорассеяния. После исключения дебриса и выделения моноцитарного и гранулоцитарного гейтов, определяли долю: 1) интактных клеток [фенотип MC540(-)TO-PRO-3(-)]; 2) клеток на ранней стадии апоптоза [фенотип MC540(+)TO-PRO-3(-)]; 3) клеток на поздней стадии апоптоза [фенотип MC540(+)TO-PRO-3(+)]; 4) некротических клеток [фенотип MC540(-)TO-PRO-3(+)].

Статистический анализ. На каждый вариант опыта просчитывали не менее 25000 клеточных событий. Измерения проводили в программе CellQuest Pro (BD Biosciences), статистический анализ полученных результатов выполняли по критерию КолмогороваСмирнова и критерию χ2 с коррекцией Yates в пакете прикладных программ STATISTICA 6.0.

Результаты

Форболовые эфиры, в их числе и ФМА, являются модуляторами активности протеинкиназы С (ПКС), которая регулирует пролиферацию, дифференцировку и апоптоз ряда клеток [8]. В связи с этим мы исследовали влияние биназы на ФМА-индуцированный апоптоз в моноцитах и гранулоцитах периферической крови человека. Согласно схеме, принятой нами ранее, эксперименты проводились с двумя концентрациями биназы: 40 мкг/мл (Bi-40) – нетоксичная и 400 мкг/мл (Bi-400) – токсичная [9].

При действии биназы в концентрации 40 мкг/ мл распределение моноцитов по стадиям апоптоза не отличается от контрольного (рис. 1Б, В). В концентрации 400 мкг/мл биназа стимулирует апоптоз, не меняя существенно соотношение между ранним и поздним апоптозом по сравнению с контролем (рис. 1В). ФМА индуцирует апоптоз моноцитов (рис. 1А, Б, В). В концентрации 40 мкг/мл биназа тормозит переход клеток из фазы раннего в фазу позднего ФМА-индуцированного апоптоза, вызывая двукратное увеличение доли клеток в раннем апоптозе по сравнению с ФМА (13,2% против 6,4%, P < 0,01) и 1,5-кратное уменьшение доли клеток в стадии позднего апоптоза (21,3% против 31,9%, р < 0,01). Доля жизнеспособных клеток для варианта ФМА + Bi-40 также увеличивается. Суммарный (ранняя+поздняя стадия) ФМА-индуцированный апоптоз больше, чем (ФМА + Bi-40)-индуцированный апоптоз. Биназа в токсичной концентрации (400 мкг/мл) усиливает ФМАиндуцированный апоптоз в моноцитарной фракции лейкоцитов (рис. 1Б, В). Однако это усиление скорее всего является результатом простого суммирования двух апоптогенных эффектов, обусловленных независимым действием биназы и ФМА. Поэтому, логично говорить об аддитивном влиянии биназы в концентрации 400 мкг/мл на ФМА-индуцированный апоптоз в моноцитах.

В гранулоцитах Bi-40 и Bi-400 не модифицируют структуру стадийного распределения клеток при спонтанном апоптозе (рис. 2). ФМА увеличивает долю клеток в фазе позднего апоптоза по сравнению с контролем (6,4% против 3,4%). Bi-40 умеренно стимулирует апоптогенный эффект ФМА, преимущественно на ранней стадии апоптоза (рис. 2Б). Комбинация Bi-400 + ФМА вызывает драматическое увеличение клеток в фазе позднего апоптоза (рис. 2В), а доля интактных клеток выраженно сокращается (6,2% против 92,6%, P < 0,01). При раздельном действии на гранулоциты биназа и ФМА незначительно повышают количество апоптотических клеток, а их совместное действие намного превышает эффект от простого суммирования изолированного влияния каждого в отдельности, т.е. имеет место синергизм действия Bi-400 и ФМА.

Результаты влияния биназы на ФМА-индуцированный апоптоз моноцитов и гранулоцитов обобщены в схеме на рис. 3.

Обсуждение

Рибонуклеазы, как важнейшие ферменты, участники клеточного метаболизма, являются традиционными объектами исследования молекулярной биологии. Вместе с тем, в мире широко изучаются биологические эффекты экзогенных рибонуклеаз, которые не перестают удивлять своим многообразием и неоднозначностью проявления. На сегодняшний день известен целый ряд эффектов этих ферментов (противовирусный, противоопухолевый, апоптогенный, иммуносупрессорный и другие) [4, 10, 11], в связи с чем рибонуклеазы привлекают к себе внимание исследователей как потенциальные терапевтические препараты нового поколения. Молекулярные механизмы многих из перечисленных эффектов до конца не ясны и интенсивно исследуются. Однако уже сейчас очевидно, что действие рибонуклеаз на клетки избирательно и индивидуально, и зависит как от типа клетки-мишени, так и от используемого фермента.

Результаты, полученные в настоящей работе, не являются исключением. Они показали, что биназа различным образом действует на ФМАиндуцированный апоптоз моноцитов и гранулоцитов. Конечный эффект биназы зависит от субпопуляционной принадлежности клеток-мишеней и концентрации фермента (рис. 3).

Биназа в концентрации 400 мкг/мл выраженно активирует ФМА-индуцированный апоптоз гранулоцитов, проявляя синергизм действия с ФМА. Поскольку проапоптогенное действие ФМА реализуется через активацию ПКС, то биназа может представлять интерес в качестве позитивного модификатора ПКС-опосредованного апоптогенного эффекта.

В моноцитах биназа в концентрации 40 мкг/мл проявляет протекторное и апоптоз-модулирующее действие в отношении развития ФМА-индуцированного апоптоза. Эти эффекты биназы (протекторный и апоптоз-модулирующий) отмечались нами и ранее. При изучении влияния биназы на апоптоз субпопуляций лейкоцитов крови человека нами было установлено, что биназа избирательно активирует апоптоз моноцитов крови человека и не влияет на программированную клеточную гибель лимфоцитов и гранулоцитов. В условиях окислительного стресса Bi-40 увеличивает субпопуляцию жизнеспособных моноцитов и меняет динамику пероксид-индуцированного апоптоза, повышая долю моноцитов в стадии раннего апоптоза [9]. Таким образом, оба эффекта биназы наблюдаются в моноцитах независимо от индуктора апоптоза. Более того, аналогичные результаты нами были получены и с перитонеальными макрофагами крысы [12]. В этой работе показано, что в условиях индуцированного окислительного стресса биназа защищает от некроза перитонеальные макрофаги, смещая клеточный ответ в сторону апоптоза. Сходство обнаруженных эффектов у моноцитов и макрофагов и их независимость от индуктора апоптоза позволяют предположить, что, вероятнее всего, эти эффекты обусловлены особенностями взаимодействия биназы с мембраной моноцита [12].

Полученные результаты в очередной раз демонстрируют избирательность действия биназы в отношении клеток-мишеней и обосновывают апоптозмодифицирующий потенциал биназы в фагоцитах человека. Исследование механизмов избирательности действия и апоптоз-модулирующего эффекта биназы заслуживает продолжения.

Подняться вверх сайта