Поиск Кабинет

Влияние аутотрансплантации различных клеток костного мозга на морфофункциональное состояние миокарда кролика после инфаркта

Гены & Клетки: Том II, №2, 2007 год, стр.: 52-61

 

Авторы

Давыденко В.В., Матюков А.А., Цупкина Н.В., Власов Т.Д., Гриценко В.В., Кузнецов АА., Аминева Х.К. |, Деев Р.В., Ялфимов А.Н., Пинаев Г.П.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

В работе представлены результаты исследования по сравнительной оценке влияния интрамиокардиальной аутотрансплантации культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга и ядросодержащих клеток костного мозга на морфофункциональное состояние миокарда после инфаркта. Эксперименты проведены на кроликах породы Шиншилла. Инфаркт миокарда моделировался путем лигирования передней нисходящей ветви левой коронарной артерии. Оценку результатов проводили с помощью функциональных [электрокардиография, эхокардиография) и морфологических методов. Были сформированы три группы животных. Животным 1-й группы [контроль, п = 13} в пораженную зону инъекционным способом вводилась ростовая среда а-МЕМ, животным 2-й группы [л = 14} вводилась культура мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга [BxW3}, животным 3-й группы [п= 14}—ядросодержащие клетки костного мозга лантация культуры мультипотентныъх мезенхимальных стромальных клеток костного мозга при экспериментальном инфаркте миокарда приводила к уменьшению площади зоны ишемического повреждения, нормализации показателей систолической функции сердца, а также к стимуляции ангиогенеза. В то же время интрамиокарди-альная аутотрансплантация ядросодержащих клеток костного мозга сопровождалась увеличением зоны ишемического повреждения и ухудшением показателей систолической функции сердца по сравнению с контрольной группой, хотя и сочеталась с активацией ангиогенеза.

Введение

Несмотря на значительные успехи современной меди цины, сердечно сосудистые заболевания по прежнему ос таются главной причиной смертности и инвалидизации на селения [1, 2]. Высокий уровень летальности во многом определяется особенностями регенерации миокарда. Отсут ствие пролиферативного потенциала у кардиомиоцитов при водит к тому, что, погибая в ходе различных патологических процессов, они замещаются соединительной тканью [3]. Используемые в настоящее время для лечения ишемии ми окарда консервативные и оперативные методы не всегда эффективны или не могут быть применены по ряду причин [4]. В связи с этим разрабатываются новые способы реге нерации пораженного миокарда на основе современных достижений молекулярной и клеточной биологии [2, 3, 5]. Таким новым направлением в кардиологии и кардиохирур гии является использование клеток костного мозга. Данный подход основан на способности этих клеток участвовать в регенерации поврежденного миокарда [2, 6]. В терапии ин фаркта миокарда используют различные клетки костного мозга [7 10]. Применяется как аллогенная, так и аутоген ная трансплантация клеток, причем наиболее перспектив ной считается трансплантация аутогенных клеток в связи с отсутствием необходимости иммуносупрессивной терапии и отсутствием этических и юридических проблем. В настоящее время ведется поиск оптимального типа клеток для клеточной терапии инфаркта миокарда. Чаще всего используются либо ядросодержащие клетки костного мозга, либо культура мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток ко стного мозга. Однако результаты по трансплантации этих ти пов клеток в поврежденный миокард противоречивы. Кроме того, во многих исследованиях изучалось влияние только од ного типа клеток, в то время как весьма важным является проведение сравнительного анализа по влиянию обоих ти пов клеток на течение инфаркта миокарда на одной модели.

Цель работы

Изучить и сравнить влияние аутотрансплантации куль туры мультипотентных мезенхимальных стромальных кле ток (ММСК) костного мозга и ядросодержащих клеток (ЯСК) костного мозга на морфофункциональное состояние мио карда кролика после инфаркта.

Материалы и методы

Эксперименты проведены на кроликах самцах породы Шиншилла массой 2,7 3,0 кг. Возраст животных к началу эксперимента составлял 3 4 мес.

Получение культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и ядросодержащих клеток костного мозга В работе использовали культуру ММСК и ЯСК, получен ные из аспирата костного мозга. Клетки культивировали в среде a MEM (ICN, США) с 10% сыворотки эмбрионов ко ров (Hyclone, Новая Зеландия).

Характеристику культуры проводили путем окрашивания её стандартной смесью реактивов BCIP NBT (Sigma, США) на щелочную фосфатазу (ЩФ) для идентификации клеток остеогенной дифференцировки и Суданом III (BDH Chemicals Ltd, Англия) для идентификации клеток адипоцитарной диф ференцировки [11, 12].

Моделирование инфаркта миокарда Инфаркт миокарда моделировался путем лигирования передней нисходящей ветви левой коронарной артерии на расстоянии 1,0 см от верхушки сердца. Сразу после коро нароокклюзии в зону предполагаемого инфаркта интрами окардиально вводили клетки или эквивалентное количество ростовой среды [11, 12].

Электрокардиографическое исследование Электрокардиография во всех группах животных выпол нялась до операции (норма), через 3 сут., 7 сут., 30 сут. после операции и перед выведением животного из эксперимента (1 год после операции). После премедикации (дроперидол 0,5 мг/кг, ксилазин 14 мг/кг) животное фиксировалось в специальном станке на спине. Использовали портативный одноканальный электрокардиограф ЭКГ 001 («Красно гвардеец», Россия) Амплитуда устанавливалась на 20 мм, а скорость лентопротяжного механизма - на 50 мм/с. Оцен ку ЭКГ проводили по второму стандартному отведению.

Ультразвуковое эхокардиографи чес кое исследование

Ультразвуковое эхокардиографическое исследование выполнено на эхокамере Sequoia 512 (Acuson, США) с ис пользованием линейного датчика 13 МГц. В каждой группе животных эхокардиографическое исследование выполнялось до операции, через 14 сут. и через 1 год после операции по стандартной методике. Эхокардиография проводилась с обязательной параллельной регистрацией ЭКГ сигнала. Из парастернального доступа по длинной оси левого желудочка (с контролем из этого же доступа по короткой оси левого желудочка) в режиме М модального сканирования регистри ровался конечно диастолический размер левого желудочка. Систолическую функцию левого желудочка регистрировали с помощью 2D сканирования из верхушечного доступа в четырехкамерной и двухкамерной позициях. Расчеты фрак ции выброса по модифицированному дисковому методу Simpson проводили, используя встроенные программы эхо камер. Кровоток в аорте оценивали в режиме импульсно волновой допплерографии.

Гистологическое исследование

После эвтаназии сердце кролика ниже лигатуры разре зали в поперечном направлении с помощью специального устройства на 3 сегмента одинаковой толщины - апикаль ный, средний, базальный. Затем срезы помещали в 10% раствор формалина на 4 сут. После фиксации каждый сег мент сердца заливали в парафин и изготавливали срезы толщиной 7 мкм по общепринятой методике. Гистологичес кие препараты окрашивали гематоксилином и эозином и по Маллори (13]. Препараты исследовали на микроскопе «Био лам» (Россия).

Количественная оценка васкуляризации

Оценивалась пограничная с рубцом зона. В каждом пре парате в пяти последовательных полях зрения при увели чении х400 (окраска по Маллори) производился подсчет количества всех сосудов: артериол, капилляров, венул, вен, синусов (14].

Все эксперименты на животных выполнены в соответ ствии с требованиями этического комитета СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова.

Результаты

Все животные были разделены на 3 группы. Животным сразу после коронароокклюзии в пораженную зону инъекци онным способом вводилась в 1 й группе (контроль, п = 13) При анализе ЭКГ оценивали сердечный ритм, проводи мость, желудочковый комплекс QRST.

До моделирования инфаркта миокарда во всех группах регистрировался правильный синусовый ритм с ЧСС 172±82 в 1 мин. При анализе комплекса QRST изменений не отмечалось. Нарушений проводимости выявлено не было (рис. 1 3). Сводные данные ЭКГ после операции представ лены в табл. 1.

Таким образом, во всех группах после коронароокклюзии развивались электрокардиографические признаки острого инфаркта миокарда, которые имели отчетливую закономер ную динамику. Однако в контрольной группе и в группе жи вотных, которым выполняли трансплантацию ЯСК костного мозга, регистрировались признаки трансмурального инфар кта миокарда, тогда как в группе животных, которым транс плантировали культуру ММСК костного мозга, ЭКГ данные указывали на развитие субэндокардиального инфаркта мио карда. Кроме того, в контрольной группе и в группе животных после трансплантации ЯСК костного мозга предсердные эк страсистолы возникали значительно чаще, чем в группе животных, которым выполняли трансплантацию культуры ММСК костного мозга. Нарушения проводимости развива лись только в первой и третьей группах.

По данным УЗИ сердца в динамике были проанализиро ваны показатели систолической функции сердца: фракция выброса (ФВ), размер левого желудочка в диастолу (конечно диастолический размер КДР), скорость кровотока через аор тальный клапан (VAo). Динамика изменений показателей си столической функции сердца представлена в табл. 2 и на рис. 4 6.

Анализ региональной сократимости левого желудочка показал, что в контроле и в третьей группе животных через 14 сут. после операции на передней стенке определялись акинетичные участки. Во второй группе выявлялись гипоки нетичные участки в области передней стенки левого желудоч ка. Через 1 год после операции в контрольной и в третьей группах сохранялись акинетичные участки на передней стенке левого желудочка. Во второй группе нарушений со кратимости выявлено не было.

Как видно из представленных данных, после интрами окардиальной аутотрансплантации культуры ММСК кос тного мозга наблюдались выраженные положительные изменения показателей систолической функции сердца, проявляющиеся в полной нормализации всех показателей через 1 год после операции. В то время как у животных после аутотрансплантации ЯСК костного мозга, наоборот, выявлялось резкое снижение показателей систолической функции левого желудочка по сравнению с контрольной группой. Морфологический анализ проводили по 3 препаратам (по одному препарату с каждого парафинового блока) с каждого сердца. В данных сериях эксперимента помимо контрольной группы, в которой животным вводилась ростовая среда, в качестве сравнения была введена группа неоперированных животных (норма).

Сводные данные гистоморфологической структуры мио карда кроликов контрольной и опытных групп представлены в табл. 3.

Гпатологическая характеристика миокарда кроликов контрольной группы

На гистологических препаратах миокарда апикального сегмента у всех животных определялась аневризма, состав ляющая 1/2 1/3 окружности левого желудочка и состоя щая из плотной фиброзной ткани. Фиброзная ткань состояла из грубых коллагеновых волокон и содержала артерии с утолщенными стенками. Субэндокардиально располагались группы или прослойка кардиомиоцитов. В пограничной зоне располагались сосуды синусоидного типа.

Подняться вверх сайта