Поиск Кабинет

Улучшение доставки комплексов плазмидной ДНК с поликатионом в клетки человека в присутствии блоксополимеров этилен- и пропиленоксида

Гены & Клетки: Том VII, №3, 2012 год, стр.: 101-104

 

Авторы

Мартынова А.Д.,  Шевченко В.Д., Бондарь О.В.,  Абдуллин Т.И.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Работа посвящена исследованию влияния новых блоксополимеров этилен- и пропиленоксида на доставку плазмидной ДНК и ее комплексов с катионными полимерами в клетки человека. В качестве систем доставки протестированы трехфункциональные амфифильные блоксополимеры на основе глицерина (лапролы), полиэтиленимин (25 кДа) и коммерческий трансфекционный реагент TurboFect. Установлено, что TurboFect образует более компактные и положительно заряженные полиплексы с плазмидной ДНК (pEGFP-N2) и обеспечивает большую экспрессию GFP в клетках HEK 293, чем полиэтиленимин. Лапролы слабо взаимодействуют с плазмидной ДНК и не улучшают ее внутриклеточную доставку, однако существенно усиливают трансфекцию клеток комплексами ДНК с полиэтиленимином. Результаты показывают, что лапролы обладают умеренной цитотоксичностью и представляют интерес для доставки геннотерапевтических препаратов в клетки.

Разработка эффективных систем доставки генетического материала является актуальной задачей клеточной биологии и генной терапии. В настоящее время в качестве геннотерапевтических векторов тестируют различные вирусы, которые, несмотря на эффективность трансформации клеток, обладают высокой иммуно- или туморогенностью [1–3]. Значительно более безопасной системой являются препараты на основе плазмидной ДНК, отличающиеся низкой себестоимостью, но, вместе с тем, характеризующиеся низкой эффективностью доставки терапевтических генов [4].

Для улучшения трансфекции клеток плазмидной ДНК общепринятым подходом является ее связывание с катионными липидами и полимерами. Эти вещества образуют компактные комплексы с нуклеиновыми кислотами, облегчая внутриклеточный перенос генов, их высвобождение из лизосом и защиту от расщепления нуклеазами [5–7]. Фундаментальным недостатком катионных липидов/полимеров является их высокая токсичность, обусловленная, в частности, мембраноповреждающим действием. Перспективным классом полимерных носителей генов являются амфифильные полимеры, такие как блоксополимеры этилен- и пропиленоксида. К настоящему времени подробно исследованы свойства двухфункциональных блоксополимеров, известных под торговой маркой Плуроники (Pluronics, BASF).

В зависимости от физико-химических свойств Плуроники способны оказывать различные биологические эффекты, в том числе, модулировать активность систем мембранного транспорта и усиливать доставку лекарственных средств в резистентные опухолевые клетки и клетки гематоэнцефалического барьера [8, 9]. Показано, что Плуроник Р85 усиливает пролиферацию и остеогенную дифференцировку мезенхимных стволовых клеток человека [10]. Зафиксировано повышение уровня экспрессии маркерных генов в клетках человека при трансформации невирусными векторами [8, 9], аденовирусами [11] и лентивирусами [12] в присутствии Плуроников. Обнаружено, что Плуроники F127, L61 и P85 повышают уровень трансфекции при инъекции «голой» плазмидной ДНК в скелетную мышцу [13, 14].

Настоящая работа посвящена исследованию возможности применения трехфункциональных блоксополимеров этилен- и пропиленоксида на основе глицерина для доставки плазмидной ДНК в клетки человека. Ранее установлено, что подобные полимеры более эффективны при усилении внутриклеточной доставки низкомолекулярных лекарственных средств и флуорофоров, чем Плуроники [15]. Нами охарактеризованы комплексы плазмидной ДНК с лапролами и катионными полимерами, оценена цитотоксическая активность лапролов и их влияние на эффективность трансфекции клеток HEK 293.

Материал и методы

В работе использовали плазмидную ДНК pEGFPN2 (Clontech, США) с геном зеленого флуоресцентного белка (GFP), разветвленный полиэтиленимин (ПЭИ) с молекулярной массой 25 кДа (Sigma-Aldrich, США), трехфункциональные блоксополимеры этилен- и пропиленоксида на основе глицерина: лапрол 3603, лапрол 5003, лапрол 6003 (ОАО «Нижнекамскнефтехим»), трансфекционный агент TurboFectTM (Fermentas, США), флуоресцентный краситель Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich, США).

Электрофоретическое разделение и анализ комплексов плазмидной ДНК с ПЭИ и лапролами проводили с использованием оборудования BioRad в 1% агарозном геле в ТАЕ-буфере. Для визуализации ДНК окрашивали специфичным флуоресцентным красителем (этидия бромидом).

Структуру комплексов плазмидной ДНК с полимерами исследовали методом динамического светорассеяния на анализаторе Zetasizer NanoZS (Malvern, США). ДНК смешивали с ПЭИ или реагентом TurboFect в конденсирующей концентрации в буфере. Смесь инкубировали 10 мин. при комнатной температуре и далее регистрировали гидродинамический диаметр и дзета-потенциал образовавшихся комплексов.

Цитотоксичность комплексов плазмидной ДНК с ПЭИ и блоксополимеров этилен- и пропиленоксида определяли с помощью MTT-теста. Для этого клетки аденокарциномы легких (А549) и первичные фибробласты кожи человека культивировали в среде DMEM и α-MEM соответственно, содержащей 10% сыворотки крови плода коровы, 2 мМ L-глутамин, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина при 37°С в атмосфере 5% СО2. Клетки рассеивали в 96-луночном планшете, добавляли блоксополимеры в различных концентрациях и культивировали 70 ч. После культивирования клетки обрабатывали реагентом MTТ согласно протоколу производителя (Sigma, США). Продукт восстановления МТТ жизнеспособными клетками – формазан – детектировали на микропланшетном анализаторе Infinite M200 Pro (Tecan, США) при 550 нм. Долю жизнеспособных клеток рассчитывали относительно контроля (необработанные клетки).

Исследование трансфекции клеток комплексами плазмидной ДНК с полимерами проводили на клетках линии HEK 293 (эмбриональные клетки почки человека). Клетки культивировали в стандартных условиях до достижения плотности около 70%. В культуральную среду DMEM с сывороткой и без сыворотки вносили комплексы ДНК с реагентом TurboFect, согласно рекомендациям производителя, а также смеси лапролов (100, 500 мкг/мл) с плазмидной ДНК с ее комплексами с ПЭИ в связывающих концентрациях (10, 20 мкг/мл). Трансфицированные клетки с флуоресценцией GFP визуализировали с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа Axio Observer.A1 (Carl Zeiss, Германия) и автоматизированного анализатора IN Cell Analyzer 2000 (GE Healthcare, США). Клетки дополнительно визуализировали в режиме дифференциальноинтерференционного контраста и путем окрашивания ядер Hoechst 33342. Изображения клеток анализировали с помощью програм-много обеспечения IN Cell Analyzer Workstation 3.7 и AxioVision (Carl Zeiss, Германия).

Результаты и обсуждение

В качестве модельной плазмидной ДНК (пДНК) использовали плазмиду pEGFP-N2 с геном «усиленного» зеленого флуоресцентного белка (egfp). Чистоту препарата контролировали с использованием спектрофотометрии и рестрикционного анализа. С использованием электрофореза в агарозном геле и динамического рассеяния света исследовано комплексообразование пДНК с синтетическими катионными полимерами – полиэтиленимином (ПЭИ) с молекулярной массой 25кДа, а также коммерческим трансфиционным реагентом TurboFect. По данным электрофореза, минимальная концентрация ПЭИ, связывающая 10 мкг/мл пДНК в неподвижный комплекс, составила 5 мкг/мл. В тех же условиях рекомендованная производителем концентрация TurboFect также полностью связывала пДНК. Исследуемые лапролы (3603, 5603, 6003) с различными характеристиками не изменяли электрофоретическую подвижность пДНК в широком диапазоне концентраций, свидетельствуя о том, что эти полимеры не образуют устойчивые комплексы с ДНК.

Метод динамического рассеяния света (фотонной корреляционной спектроскопии) применен для характеристики структуры комплексов пДНК с полимерами. В табл. 1 приведены значения гидродинамического диаметра и дзета-потенциала пДНК и ее комплексов с полимерами. Исходная пДНК имеет гидродинамический диаметр 130 нм и дзетапотенциал -24 мВ. В присутствии лапрола размер пДНК увеличивался незначительно, а отрицательный заряд понижался почти до -2 мВ. Подобные изменения указывают на наличие определенных взаимодействий между блоксополимерами этилени пропиленоксида с пДНК.

Образующиеся комплексы пДНК с ПЭИ в минимальной связывающей концентрации имели диаметр около 169 нм и дзета-потенциал +17 мВ (табл. 1).

При увеличении концентрации ПЭИ в 2 раза заряд полиплексов достоверно не изменялся, а их размер уменьшался почти в 3,4 раза (до 50 нм). Комплексы пДНК с TurboFect имели размер около 62 нм и дзета-потенциал +25 мВ. Результаты показывают, что комплексы пДНК с TurboFect обладают более положительным зарядом и большей однородностью (меньшим индексом полидисперсности, PdI), чем комплексы с ПЭИ; с увеличением концентрации поликатиона (ПЭИ) размер полиплексов уменьшается, по-видимому, вследствие конденсации молекул ДНК.

Представляло интерес оценить эффективность трансфекции клеток комплексами пДНК с исследуемыми полимерами и выяснить как структура комплексов влияет на этот процесс. Вначале нами исследована цитотоксичность полимеров на клетках легочной аденокарциномы (А549) и первичных фибробластах кожи человека с использованием МТТ-теста.

Установлено, что ПЭИ не проявляет цитотоксичности в связывающих ДНК концентрациях (данные не показаны). Цитотоксичность исследуемых лапролов уменьшалась с повышением гидрофильнолипофильного баланса и молекулярной массы (в ряду лапрол 3603, лапрол 5003, лапрол 6003). Лапрол 6003 обладал наименьшей среди других лапролов цитотоксичностью: его концентрация, ингибирующая рост человеческих фибробластов, составляет 135 мкг/мл (табл. 2).

Для анализа трансфекции использовали культуру эмбриональных клеток почки человека HEK 293. Установлено, что в условиях эксперимента для комплексов pEGFP-N2 с реагентом TurboFect экспрессия GFP наблюдалась почти в 40% клеток. В среде DMEM без сыворотки эффективность трансфекции была выше, чем при использовании среды с сывороткой, однако при этом наблюдалось уменьшение количества жизнеспособных клеток в культуре. В присутствии лапролов трансфекция клеток «голой» пДНК не наблюдалась.

На рисунке представлены микрофотографии клеток HEK 293, обработанных комплексами пДНК с ПЭИ и лапролами. Выяснено, что в связывающей концентрации (10 мкг/мл) ПЭИ характеризуется достаточно низкой эффективностью трансфекции (1,3% клеток с флуоресценцией GFP). Как показано выше (см. табл. 1), полиплексы на основе ПЭИ характеризуются большим размером и меньшим зарядом, чем комплексы с TurboFect. Можно предположить, что эффективность доставки полиплексов в клетки зависит от величины их положительного заряда, однородности и стабильности, которые выше в случае использования коммерческого трансфекционного реагента.

Установлено, что добавление лапролов к комплексам пДНК с ПЭИ приводило к существенному увеличению числа экспрессирующих GFP клеток (рис.). В частности, в присутствии лапролов 5003 и 6003 количество GFP-позитивных клеток в культуре повышалось до 9,4 и 5,8 %, соответственно. Исследованию внутриклеточного транспорта комплексов пДНК с полимерами и механизма влияния неионогенных лапролов на усиление трансфекции будет посвящена другая работа. Ранее мы установили, что полифункциональные лапролы обратимо повреждают клеточные мембраны и способны усиливать доставку низкомолекулярных веществ в резистентные опухолевые клетки [15]. Можно предположить, что усиление трансфекции клеток полиплексами в присутствии лапролов связано с облегчением переноса пДНК через плазматическую мембрану, а также последующего высвобождения ДНК из лизосом.

Подняться вверх сайта