Поиск Кабинет

Участие мононуклеаров пуповинной крови человека в физиологической регенерации почки крысы

Гены & Клетки: Том VII, №3, 2012 год, стр.: 69-71

 

Авторы

Йылмаз Т.С., Мавликеева А.В., Гумерова А.А., Андреева Д.И., Файрушина И.Ф., Киясов А.П.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

В настоящее время активно изучается возможность использования гемопоэтических стволовых клеток для лечения различных заболеваний, в том числе, заболеваний почек. В качестве источника гемопоэтических клеток все большее значение приобретает пуповинная кровь. Целью исследования стало изучение хоуминга и путей дифференцировки мононуклеаров пуповинной крови человека в интактных почках крыс. Исследование проведено на крысах, которым в хвостовую вену вводили фракцию мононуклеаров пуповинной крови человека, обогащённую гемопоэтическими стволовыми клетками. Через 2, 5, 7 и 14 сут. после введения проводили иммуногистохимическое окрашивание антителами к лейкоцитарному антигену человека (HLA-ABC) для изучения миграции и дифференцировки введенных клеток. Результатом окрашивания стало обнаружение HLA-ABC+-клеток в эпителиальной выстилке дистальных канальцев нефрона на всех контрольных сроках. При этом, HLA-ABC экспрессировался не во всех дистальных канальцах и не всеми клетками. Таким образом, мононуклеары пуповинной крови человека, трансплантированные в системный кровоток крыс, мигрируют в неповрежденную почку и встраиваются в эпителиальные клетки дистальных канальцев нефрона, что позволяет рассматривать дистальные канальцы как «нишу» стволовых клеток.

Одной из актуальных проблем современной нефрологии является поиск новых, патогенетически обоснованных и эффективных методов лечения хронических заболеваний почек. В связи с этим, исследователями ведётся интенсивное изучение участия стволовых клеток в регенерации тканей и восстановлении органов и возможности применения этих клеток для патогенетической терапии различных заболеваний [1], в том числе заболеваний почек [2]. Для обоснования целесообразности применения стволовых клеток необходимо изучение их распределения после трансплантации в неповреждённом органе, а именно – оценка возможности миграции введенных клеток в интактную почку, путей этой миграции и дальнейшей дифференцировки в почке реципиента.

В последнее время, как в эксперименте, так и в клинике, в качестве источника гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) наибольшее значение приобретает пуповинная кровь. Это связано как с абсолютной безопасностью их получения и возможностью длительного их хранения, так и с рядом качественных свойств самих клеток. Как известно, ГСК, выделенные из пуповинной крови, обладают значительно более высокой пролиферативной и клоногенной активностью и меньшей иммуногенностью по сравнению с клетками, полученными из взрослого организма [3]. В связи с этим, целью нашего исследования стало изучение хоуминга и дифференцировки мононуклеаров пуповинной крови человека после трансплантации в интактной почке крысы.

Материал и методы

Выделение мононуклеаров из пуповинной крови производили в пробирках объемом 50 мл. В каждую пробирку наливали по 25 мл фиколла плотностью 1,077 г/мл, на который аккуратно при помощи автоматического дозатора наслаивали равный объём пуповинной крови с антикоагулянтом (соотношение крови и антикоагулянта колебалось в пределах 1:1–1:3) [4]. Пробирки центрифугировали при 720g в течение 20 мин, получали чёткое разделение крови на 3 фракции: эритроциты, лейкоциты и плазму. Лейкоцитарную фракцию забирали в отдельную пробирку, ресуспендировали раствором Версена в соотношении 1:2 и центрифугивали при 305g в течение 15 мин. Полученный клеточный осадок ресуспендировали 10 мл раствора Версена и повторно центрифугировали при 305 g 15 мин. Таким образом, клеточный осадок был отмыт от фиколла [4].

Исследование проведено на 15 белых беспородных крысах-самцах весом 180–220 г., находящихся на стандартном рационе вивария и имеющих свободный доступ к воде. Крысам в хвостовую вену вводили по 1×106 клеток-мононуклеаров, ресуспендированных в 0,5 мл стерильного физиологического раствора. Крысам из группы контроля (n = 3) вводили только физиологический раствор в равном объёме. Ксенотранслантация проведена в связи с невозможностью получения пуповинной крови у крыс. Кроме того, введение клеток человека позволяло не проводить дополнительного мечения трансплантируемых ГСК. Естественной меткой служил лейкоцитарный антиген человека (HLA-ABC), не экспрессирующийся клетками крыс.

Через 2, 5, 7, 14 сут. после введения клеток (по 3 крысы на каждом сроке) животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом и извлекали почки для морфологического исследования. Максимальный экспериментальный срок обусловлен его достаточностью для того, чтобы убедиться в истинности заселения мононуклеарами пуповинной крови человека здоровых почек крыс и отсутствием в течение первых 2-х нед. реакции «трансплантат против хозяина». После выведения из эксперимента у животных извлекали почки для морфологического исследования, фиксировали в формалине и заливали в парафин по стандартной методике. Парафиновые срезы почек крыс окрашивали антителами к HLA-ABC (клон W6/32-HL, фирма Novokastra; разведение 1:160).

Результаты и обсуждение

Результатом окрашивания срезов почки крыс после введения мононуклеаров пуповинной крови человека стало обнаружение HLA-ABC-позитивных клеток в эпителии канальцев на всех исследованных сроках (рис.). На основании того, что эти канальцы были сравнительно небольшого диаметра, с широким просветом и невысокими, чётко очерченными эпителиоцитами [5], что характерно для дистальных извитых канальцев, мы сделали заключение о заселении человеческими клетками именно этого отдела нефрона. Интересно, что не все дистальные канальцы были окрашены, и в каждом окрашенном дистальном канальце могли присутствовать как HLAABCпозитивные, так и HLA-ABC-негативные эпителиальные клетки (рис. Б–Г). Кроме того, необходимо отметить, что клетки, экспрессирующие антиген человека, не были обнаружены в интерстиции почки, собирательных трубочках и в клубочках. В канальцевой же части нефрона характерный для клеток человека антиген присутствовал только в дистальных извитых канальцах.

Данные литературы по вопросу миграции в почку ГСК и встраиванию их в структуры нефрона весьма противоречивы. С одной стороны, есть работы, в которых полностью опровергается участие костномозговых клеток в физиологической регенерации почки, но не исключается их участие в репаративной регенерации органа [6]. С другой стороны, в экспериментах на здоровых мышах показано, что костномозговые клетки вовлечены в образование только мезангиальных клеток [7]. Однако полученные нами результаты указывают на то, что ГСК способны восстанавливать или встраиваться в эпителий канальцев нефрона. Ранее было также показано, что через 12–13 нед. после трансплантации ГСК костного мозга 8% эпителиальных клеток канальцев имеют костномозговое происхождение [8]. В работе, проведенной на мышах с боковым амиотрофическим склерозом, которым вводили клетки пуповинной крови человека, было обнаружено, что человеческие клетки заселяют почки животных и спустя 10–12 нед. после трансплантации располагаются как среди эпителия канальцев, так и между канальцами, демонстрируя морфологию эндотелиоцитов [9]. В нашем исследовании мы не обнаружили эндотелиальных клеток, экспрессирующих антигены человека, в кровеносных сосудах почки.

Таким образом, несмотря на противоречивость полученных результатов, мы подтверждаем тот факт, что мононуклеары пуповинной крови человека мигрируют в почку и встраиваются в эпителиальную выстилку канальцев. Кроме того, результаты исследования позволили уточнить, что отделом нефрона, в который заселяются введённые клетки, являются дистальные извитые канальцы. Однако, попадая в здоровую почку, вероятно, ГСК не находят «точки приложения» (поврежденного клеточного типа) и поэтому остаются в органе в качестве дополнительного резерва для последующих процессов физиологической и репаративной регенерации. Как известно, в органах стволовые клетки располагаются в специальных «нишах» [10]. Относительно локализации «ниши» стволовых клеток в почке нет единого мнения. По мнению разных авторов, в этой роли могут выступать почечные сосочки [11], проксимальные канальцы [12], канальцы кортикомедуллярного перехода [12], а также клетки мочевого полюса капсулы Шумлянского – Боумена [13]. Полученные нами данные позволяют высказать предположение, что еще одним кандидатом на роль «ниши» стволовых клеток могут быть дистальные канальцы нефрона.

На основании результатов проведенного исследования можно сделать вывод, что мононуклеары пуповинной крови человека, трансплантированные в организм здоровой крысы, способны мигрировать в почку и встраиваться в эпителиальную выстилку дистальных канальцев, которые, вероятно, служат «нишей» прогениторных клеток почки. Таким образом, применение данных клеток может быть перспективно для разработки методов регенеративной медицины с целью восстановления эпителия канальцев нефрона при тубулопатиях.

Подняться вверх сайта