Поиск Кабинет

Участие клеток Ито в гистогенезе и регенерации печени

Гены & Клетки: Том II, №4, 2007 год, стр.: 39-46

 

Авторы

Гумерова А А., Киясов А.П., Калигин М.С., Газизов И.М., Абдулхаков С.Р., Андреева Д.И., Титова МА„ Сметанникова Т.С.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

В последнее десятилетие опубликован не один десяток работ, свидетельствующих о возможности образования гепатоцитов из кроветворных стволовых клеток, имеющих, как известно, мезенхимальное происхождение. В настоящей работе проведен анализ вероятности развития эпителия печени из других источников, нежели энтодерма. Ключевые этапы дифференцировки эпителиальных и синусоидных клеток печени в ходе её нормального онтогенеза и регенерации у человека и крысы изучены иммуногистохимически с использованием широкой панели моноклональных антител к маркерам эпителиальных, мезенхимальных и стволовых клеток и апоптоза. Результаты исследования позволяют сделать вывод, что одним из источников развития гепатоцитов могут быть десмин-позитивные мезенхимальные клетки, а следовательно, что перисинусоидальные клетки печени — основной претендент на роль стволовой клетки этого органа.

Устоявшаяся теория развития печени базируется на ис следованиях, проведенных в середине XX века. Считается, что предшественники гепатоцитов выселяются в мезенхиму поперечной перегородки из эпителия двенадцатиперстной кишки эмбриона. Из эпителиальных клеток образуются ге патобласты/гепатоциты и холангиоциты, а из клеток мезен химы дифференцируются синусоидные клетки [1—3]. На оп ределенных этапах развития часть гепатобластов, расположенных вокруг сосудов, образуют так называемую протоковую пластинку, из клеток которой формируются внутрипеченочные желчные протоки [4]. Существование ре гиональной стволовой клетки печени в настоящее время не вызывает сомнений. Традиционно считается, что она нахо дится среди клеток мельчайших внутрипеченочных желчных протоков - канальцев Геринга, а их непосредственными потомками являются так называемые овальные клетки, об ладающие свойствами бипотентности и дающие начало как гепатоцитам, так и холангиоцитам [5]. Однако в последние годы установлена возможность развития гепатоцитов из стволовой кроветворной клетки [6-8], т.е. клетки мезенхи мальной, а не энтодермальной природы. В связи с этим воз никает вопрос: не могут ли постоянно «прописанные» в пе чени клетки мезенхимального происхождения быть источником гепатоцитов в ходе развития и регенерации? Для ответа на этот вопрос было предпринято комплексное им муногистохимическое исследование, в котором с помощью выявления широкого спектра фенотипических и дифферен цировочных маркеров проведен детальный анализ всех эта пов гисто и органогенеза печени человека и закономер ностей дифференцировки гепатоцитов. Особое внимание было уделено изучению взаимодействия печени с окружаю щей ее мезенхимой и сопоставлению фенотипов эпителия пе редней кишки и гепатоцитов. Также была изучена динамика межклеточных взаимодействий в процессе репаративной ре генерации печени больных хроническими гепатитами и крыс после частичной гепатэктомии и повреждения печени нит ратом свинца. Выбранные экспериментальные модели от личаются тем, что ни в том, ни в другом случае не было опи сано появление овальных клеток в ходе регенерации.

Материал и методы

Печень эмбрионов и плодов человека различных сроков гестации (с 4 й по 33 ю неделю пренатального развития) получали в результате легальных медицинских абортов, са мопроизвольных выкидышей и индуцированных преждевре менных родов по медицинским показаниям (78 образцов). Так же были изучены биоптаты печени больных хроническими гепатитами (156 образцов). Во всех случаях использования для исследований тканей человека нами было получено ин формированное добровольное согласие родителей и больных. Регенерация у крысы изучена на двух моделях. Исследова ния проведены на белых лабораторных беспородных крысах -самцах. Операцию частичной гепатэктомии выполняли по методике Хиггенса и Андерсона [9]. Забой животных под эфирным наркозом и взятие печени производили через 1, 2, 3, 5, 7 сут. после операции. Нитрат свинца вводили внут ривенно однократно в хвостовую вену в дозе 100 мкМ/кг веса животного [10]. Забой животных под эфирным нар козом и извлечение печени производили через 24, 48, 72, 96, 120 часов после введения нитрата свинца.

Печень человека и крысы фиксировали в 10% нейтраль ном формалине и заливали в парафин по стандартной ме тодике. Иммуногистохимическое окрашивание срезов печени человека и крысы проводили стрептавидин биоти новым методом [11] с использованием коммерческих моноклональных антител и визуализационных систем фирм DAKO (Дания) и NOVOCASTRA (Великобритания). В работе исполь зованы антитела к эпителиальным маркерам — цитокерати нам 18, 19, эпителиальному мембранному антигену (Epithelial Membrane Antigen, ЕМА), эпителиальному специ фическому антигену (Epithelial Specific Antigen, ESA), специ фическому антигену гепатоцитов (Hepatocyte Specific Antigen, HSA), билиарному гликопротеину CD66a; к мезенхимальным маркерам - виментину, десмину, альфа гладкомышечному актину (a SMA); к маркерам стволовых и прогениторных клеток — Bel 2, С kit, С met. Также было проведено двой ное иммуногистохимическое окрашивание эмбриональной и плодной печени человека на десмин/цитокератины 18,19, десмин/HSA и десмин/Вс1 2.

Результаты и обсуждение

Развитие печени человека начинается с выселения неболь шого количества эпителиальных клеток из эпителия передней кишки в мезенхиму поперечной перегородки. Результаты изучения закономерностей экспрессии эпителиальных мар керов выявили различные паттерны их появления и дина мики. Так, уже на 4 й неделе развития эпителиальные клетки кишки экспрессируют эпителиальный специфический ан тиген - ESA. Можно видеть ряды интенсивно окрашенных клеток, тянущихся от двенадцатиперстной кишки в печень. Через неделю уже практически все эпителиальные клетки печени экспрессируют этот белок (рис. 1 А). Позднее, по мере дифференцировки гепатобластов, экспрессия ESA постелен но снижается, смещается к периферии печени и к крупным сосудам, а затем исчезает. В дефинитивной печени данный протеин присутствует только в клетках внутрипеченочных жел чных протоков. Таким образом, можно заключить, что эксп рессия ESA характерна для гепатобластов и незрелых гепато цитов. Подтверждением этого является и установленная нами экспрессия ESA в регенерирующей печени человека: мы наблюдали мелкие ESA^ клетки в зонах некрозов и воспале ния (рис. 1 Б), что может отражать процесс дифференциров ки стволовой клетки печени в гепатоциты. Учитывая, что ESA может экспрессироваться не только клетками энтодермы, но и клетками мезодермального эпителия [12], не исключено, что эта предполагаемая стволовая клетка может быть ло кализована в синусоидах печени.

Изучение динамики экспрессии специфического анти гена гепатоцитов и билиарного гликопротеина CD66a позво лило установить, что, появляясь на 4 5 неделях гестации, экспрессия этих протеинов нарастает, и к 13-14 неделям они присутствуют во всех гепатоцитах (рис. 1 В, Г). Таким об разом, данные белки появляются уже в достаточно диффе ренцированных гепатоцитах, и их присутствие характеризует зрелый фенотип этих клеток. Появление в регенерирующих гепатоцитах именно этих белков может быть использовано как признак завершения их дифференцировки и показатель функциональной зрелости данных клеток после повреждения печени.

Эпителиальный мембранный антиген экспрессируется в различных эпителиях преимущественно на апикальной по верхности клеток, в зрелой печени он присутствует на апи кальной поверхности холангиоцитов [13]. Эпителиальные клетки передней кишки с самых ранних сроков эмбриоге неза экспрессируют этот белок. Однако ни на одном из изу ченных сроков гестации ЕМА не был выявлен в гепатоцитах человека (рис. 1Д), Таким образом, с ранних сроков разви тия основной эпителиальный клеточный тип печени — гепато циты — имеет фенотипические отличия от энтодермального эпителия.

С другой стороны, мезенхимальные клетки в области закладки печени экспрессируют не только маркеры мезен химальных клеток виментин и десмин, но и белки цитоскелета эпителиальных клеток — цитокератины 18 и 19. Причем последние в клетках мезенхимы и в синусоидах в момент закладки печени экспрессируются намного интенсивнее, чем в гепатобластах (рис. 2А).

Более того, маркер перисинусоидальных клеток печени (имеющих мезодермальное происхождение) десмин на 4-7 неделях гестации присутствует не только в перисину соидальных клетках печени (клетках Ито) и в мезенхимных клетках поперечной перегородки, но и в гепатобластах. Уровень экспрессии десмина в последних — слабый, но отдельные гепатобласты окрашиваются достаточно интен сивно (рис. 2Б). После седьмой недели гестации экспрессия десмина в мезенхимных и перисинусоидальных клетках че ловека постепенно снижается и к 12 й неделе прекращает ся полностью. В дальнейшем десмин в печени человека мож но выявить только в гладкомышечных клетках кровеносных сосудов.

Интереснейшей находкой нашего исследования стало выявление клеток, одновременно экспрессирующих десмин и цитокератины (рис. 2В). Кроме того, клетки, экспрессиру ющие десмин, и HSA позитивные клетки находятся в непос редственной близости друг к другу (Рис. 2Г). Поскольку HSA -белок, который ранее обнаруживался только в фетальных и зрелых гепатоцитах [14, 15], такая картина позволяет пред положить, что десмин позитивные клетки могут дифферен цироваться в гепатоциты.

Установленный факт экспрессии клетками мезенхимы и синусоидными клетками печени цитокератинов, а гепатоци тами — десмина в одни и те же сроки гестации указывает на общность этих клеток и возможность трансдифференциров ки одного клеточного типа в другой. Похожие результаты были получены нами ранее [16] при изучении пренатально го развития печени крысы — на 11-13 дни гестации все клетки железы экспрессируют десмин, затем в цитоплазме большей части десмин^ клеток появляются цитокератины 8 и 18, а десмин постепенно исчезает, и клетки становятся типичными гепатобластами. Оставшаяся часть десмин^ клеток никуда не исчезает, они остаются в контакте с гепа тобластами, а затем с гепатоцитами, и представляют собой десмин^ клетки Ито.

Исходя из полученных результатов, можно предположить, что существует альтернативный кишечной энтодерме источ ник развития гепатобластов, а именно — мезенхима попе речной перегородки. Более того, наличие в гепатобластах и синусоидных клетках маркера перисинусоидальных клеток печени десмина позволяет выделить конкретную популяцию клеток, развивающихся из мезенхимы, а затем дающих на чало гепатоцитам. Такой популяцией, очевидно, являются перисинусоидальные клетки. В литературе имеются данные о тесной связи пролиферации овальных клеток, которые, с одной стороны, рассматриваются как потомки стволовых клеток печени [5], а с другой — ничем не отличаются от ге патобластов [17], с пролиферацией перисинусоидальных клеток [18, 19], что указывает на тесную функциональную взаимосвязь между ними. Более того, в последние годы опубликованы работы, прямо или косвенно свидетельству ющие о том, что перисинусоидальные клетки могут дифферен цироваться в эпителий. Так, установлено [20], что в период печеночного гемопоэза у мышей и у человека стромальные элементы микроокружения, основную массу которых со ставляют перисинусоидальные клетки, одновременно экс прессируют маркеры мезенхимных и эпителиальных клеток in vitro. Методами двойного иммуногистохимического окра шивания было показано, что покоящиеся перисинусоидаль ные клетки крысы и человека экспрессируют специфический маркер эпителиальных клеток Е кадгерин как in vivo, так и in vitro [21 ]. Также было обнаружено, что перисинусоидальные клетки человека in vitro [22] и перисинусоидальные клетки трески [23] экспрессируют цитокератины. Результаты ранее проведенных нами экспериментов по органотипическому культивированию эмбриональной печени крыс и по культи вированию чистой популяции перисинусоидальных клеток, в которых было показано, что in vitro они приобретают фе нотип гепатобластов/гепатоцитов, позволили впервые опи сать мезенхимально эпителиальную трансформацию пери синусоидальных клеток [24], что еще больше подтверждает наши предположения.

Для выяснения стволовых потенций мезенхимных кле ток печени были изучены закономерности экспрессии мар керов стволовых и прогениторных клеток в пренатальном онтогенезе печени человека и в ходе регенерации печени. Результаты изучения экспрессии маркеров прогениторных клеток показали, что почти во всех клетках мезенхимы, ок ружающей печень, и в большинстве её синусоидных клеток, в том числе и в десмин^ (рис. 2Д), происходит экспрессия антиапоптотического протеина Bel 2 с четвертой до седь мой недели гестации включительно. Этот белок присутство вал также в единичных гепатоцитах. Очевидно, что данный паттерн экспрессии Bel 2 (являющегося одним из марке ров прогениторных клеток) может свидетельствовать о стволовых потенциях синусоидных клеток печени и клеток окружающей её мезенхимы, в том числе и десмин позитив ных клеток.

С met является рецептором к фактору роста гепатоци тов (сильному митогену для этих клеток) и рассматривается в качестве одного из маркеров стволовых клеток (25). В кон це четвертой - начале пятой недели внутриутробного раз вития выявлена слабая экспрессия С met в гепатобластах, причём немного интенсивнее окрашивались клетки на пе риферии печени (рис. ЗА), особенно в области мезенхимы поперечной перегородки. На 6-8 неделях гестации эксп рессия С met в гепатоцитах становилась еще более нео днородной: более ярко окрашивались гепатобласты (рис. ЗБ)

и свободно лежащие гепатоциты, тогда как в «плотно упа кованных» гепатоцитах экспрессия была намного слабее. В центральных отделах печени также были выявлены С met* клетки. Они были близки по своим морфологическим при знакам к гепатоцитам, интенсивность их окрашивания была умеренной.

В эти же сроки (4 9 недель гестации) экспрессия С met была выявлена в мелких, очевидно, синусоидных, клетках, и в них она была намного более интенсивной, чем в гепатоб ластах и гепатоцитах. Синусоидные С met* клетки были ло кализованы в основном на периферии печени, а в некоторых местах клетки образовывали кластеры (рис. ЗВ). Такие же клетки внутри печени можно было видеть около сосудов, но они были единичными. С met* клетки выявлялись в синусо идах печени и в более поздние сроки пренатального разви тия (как минимум, до 14 й недели гестации).

В ходе регенерации печени человека мы также выявили С met позитивные синусоидные клетки в зонах некро воспалительных изменений (рис. ЗГ). Кроме того, клетки та кой же локализации и морфологии экспрессировали ESA (см. рис. 1Б). Присутствие С met в мезенхимных клетках (интенсив ная экспрессия), гепатобластах (умеренная экспрессия) и гепатоцитах (слабая экспрессия) позволяет говорить о су ществовании клеток с переходным фенотипом и предпо лагать, что синусоидные клетки, экспрессирующие С met, могут быть предшественниками гепатоцитов, то есть данный протеин появляется в клетках, которые, имея мезенхимное происхождение, становятся на путь дифференцировки в эпителий. Учитывая то, что С met является рецептором к фактору роста гепатоцитов, который также называют рассе ивающим фактором (26,27], можно предположить также, что экспрессирующие данный белок клетки являются подвиж ными и могут далее распространяться в другие области печени. По мере дифференцировки клеток экспрессия ре цептора к фактору роста гепатоцитов постепенно умень шается (о чем свидетельствует снижение интенсивности окрашивания дифференцированных клеткок — гепатоци тов). Наличие единичных С met* клеток около сосудов позволяет предполагать, что эти клетки могут поступать в печень не только из мезенхимы поперечной перегородки, но и с кровью.

С 4,5-5 недель гестации все гепатобласты слабо эксп рессировали С kit (CD117) — рецептор к фактору стволо вых клеток, маркер кроветворных стволовых клеток. Через неделю периферия печени на границе с мезенхимой окраши валась сильнее, а с 5,5-6 недели около сосудов появлялись ярко окрашенные единичные гепатоциты (максимальное число таких клеток выявлено на 7 й неделе гестации) и еди ничные отростчатые синусоидные клетки (рис. 4А). После дние сохранялись в печени на всех изученных нами сроках гестации.

Удивительной находкой стало обнаружение экспрессии С kit в гепатоцитах регенерирующей печени крысы. Через сутки после частичной гепатэктомии можно было видеть единичные и сгруппированные гепатоциты. Их число оста валось неизменным до конца эксперимента (рис. 4Б). Че рез двое суток после введения нитрата свинца появлялись единичные и сгруппированные С kit позитивные гепатоциты, через 3 суток их число снижалось, и к 5 суткам такие клетки исчезали. Мы также обнаружили экспрессию С kit в сину соидных клетках: через сутки после начала экспериментов выявлялись многочисленные мелкие вытянутые клетки, экспрессирующие этот белок (рис. 4В). По мере восстанов ления паренхимы печени в ходе регенерации число их несколько уменьшалось.

Похожие закономерности были установлены и при изу чении регенерации печени человека — С kit позитивные клетки выявлены в зонах портального некроза и воспале ния, также экспрессия этого рецептора обнаружена в сину соидных клетках (рис. 4Г). Число С kit* клеток зависело от тяжести гепатита: оно нарастало пропорционально тяжести заболевания, достигало максимума при умеренном гепати те, а затем постепенно снижалось.

Полученные результаты, таким образом, также подтвер ждают стволовые потенции синусоидных клеток печени. Присутствие С kit в гепатобластах на ранних сроках геста ции (4,5—5 недели), по видимому, указывает на чувствитель ность этих клеток к фактору стволовых клеток. Установлено, что выделенные из печени С kit* клетки делятся в культуре, и в них появляется альбумин (28), то есть они могут быть пред шественниками гепатоцитов. Учитывая, что С kit является маркером кроветворных стволовых клеток, можно предполо жить, что в период становления печеночного кроветворения (6-7 недели гестации), а также при регенерации печени часть гепатоцитов может образовываться из кроветворных стволовых клеток. Однако массовое участие кроветворных стволовых клеток в развитии гепатоцитов вызывает сомне ния, поскольку в гистогенезе печени число С kit* клеток не было достаточно большим, чтобы определять течение и ис ход данных событий. Более вероятно, на наш взгляд, что кро ветворные стволовые клетки играют определенную роль в восстановлении пула региональных стволовых клеток, по видимому — синусоидных. Это подтверждают и данные дру гих авторов. Показано, что в 3-8% CD34* клеток (CD34 — один из маркеров кроветворных стволовых клеток), изоли рованных из печени человека 14 22 недель гестации, могут экспрессироваться цитокератины, десмин и некоторые другие маркеры перисинусоидальных клеток [29], что не исключает возможности дифференцировки CD34* стволо вой кроветворной клетки в десмин позитивную перисину соидальную клетку, а затем — в цитокератин позитивный гепатобласт. Однако, учитывая малочисленность С kit по зитивных клеток в эмбриональной печени, очевидно, что число таких гепатоцитов вряд ли будет значительным.

Обнаружение экспрессии С kit в многочисленных сину соидных клетках печени и в единичных гепатоцитах в ходе регенерации также позволяет сделать вывод, что, несмотря на отсутствие в печени овальных клеток, может происходить активация регионального стволового компартмента, лока лизованного в синусоидах. Можно предположить, что С kit* синусоидные клетки дают начало гепатобластам, также эк спрессирующим С kit. Поскольку гепатобласты являются клетками дифференцирующимися, в ходе этого процесса они постепенно утрачивают способность экспрессировать рецептор к фактору стволовых клеток, и мы видим лишь еди ничные С kit* гепатоциты. Выдвинутая нами гипотеза о возможности развития ге патоцитов из мезенхимных клеток поперечной перегородки и о перисинусоидальных клетках, как региональных стволо вых клетках печени, находит в последние годы все больше подтверждений в работах других исследователей. Так, ус тановлена возможность образования гепатоцитов из мезен химных клеток, выделенных из жировой ткани человека in vitro и in vivo [30] и из мезенхимных стволовых клеток in vitro [31, 32]. Было показано, что после трансплантации летально облученным крысам клеток красного костного мозга после дние могут давать начало овальным клеткам и гепатоцитам [33]. Позднее подобные эксперименты с аналогичными ре зультатами были проведены на мышах [6, 34, 35]. Появи лись данные об образовании перисинусоидальных клеток из стволовых кроветворных клеток у мышей [36]. И, наконец, в 2006 году опубликована статья, в которой впервые пери синусоидальные клетки рассматриваются как стволовые клетки, поскольку экспрессируют один из маркеров крове творных стволовых клеток CD133 [37]. Подводя итог, можно сказать, что установленный нами факт существования в печени и окружающей ее мезенхиме клеток, сочетающих фенотипические признаки прогениторных клеток, периси нусоидальных клеток печени и гепатоцитов, свидетельствует о возможности развития гепатоцитов из десмин позитивных клеток мезенхимы поперечной перегородки, что вплотную приближает нас к разгадке вопроса о региональной стволо вой клетке печени, которой может являться популяция звёз дчатых перисинусоидальных клеток (клеток Ито).

Подняться вверх сайта