Поиск Кабинет

Цитофлуориметрическая характеристика влияния РНКаз на клетки про- и эукариот

Гены & Клетки: Том VII, №3, 2012 год, стр.: 62-65

 

Авторы

Зеленихин П.В., Мамедзаде К.Р., Ильинская О.Н.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Цитотоксичные рибонуклеазы (РНКазы) – перспективные препараты для терапии злокачественных новообразований. Расширение спектра модельных объектов, по отношению к которым охарактеризовано действие РНКаз, позволит дать точную оценку селективности действия данных препаратов.

С помощью проточной цитометрии оценивали действие рибонуклеазы Bacillus intermedius (биназы) и РНКазы А быка на клетки эпителия легкого эмбриона коровы (ЛЭК) и Escherichia coli K12. Апоптоз клеток ЛЭК выявляли с помощью двойного окрашивания Аннексином-FITC и йодидом пропидия (PI). Жизнеспособность клеток E. coli оценивали с помощью окрашивания PI.

Ни в одной из исследованных концентраций (100 и 300 мкг/мл) биназа и РНКаза А не проявили цитотоксических свойств в отношении клеток ЛЭК и E. coli K12. Низкая токсичность исследованных РНКаз в отношении E. coli позволяет предположить, что присутствие биназы и РНКазы А в концентрациях, способных проявлять противоопухолевую активность, не будет иметь значительного влияния на микробную флору тканей в перспективных исследованиях in vivo. Продемонстрированное отсутствие апоптозиндуцирующей активности биназы в отношении клеток ЛЭК подтверждает селективность действия данной РНКазы на опухолевые клетки.

Рибонуклеазы (РНКазы) – важнейшие ферменты метаболизма РНК, функции которых заключаются в расщеплении мРНК, превращении предшественников РНК в зрелые формы, продукции малых регуляторных РНК, деградации определенных типов РНК. Клетка содержит около 20 видов экзо- и эндорибонуклеаз, которые могут входить в состав надмолекулярных комплексов и проявлять высокую специфичность к определенным нуклеотидным последовательностям и структурам [1]. В последние годы особое внимание уделяется биологическим эффектам рибонуклеаз, таким как контроль роста кровеносных сосудов, токсичность по отношению к клеткам опухолей, противовирусная активность. Современные представления о роли и функциях РНКаз в клетках позволяют рассматривать эти ферменты как перспективную альтернативу традиционным химиотерапевтическим средствам в щадящей терапии злокачественных новообразований. На сегодняшний день известно значительное количество РНКаз, обладающих селективным цитотоксическим действием по отношению к клеткам опухолей [2–4]. Наиболее известным ферментом этого ряда является РНКаза лягушки Rana pipiens – онконаза [4], успешно проходящая клинические испытания как противоопухолевый препарат в терапии злокачественных новообразований почек, поджелудочной железы и легких. Для РНКаз, как агентов противоопухолевой терапии, основное значение имеет фактор избирательного действия по отношению к опухолевым клеткам. От деструктивного действия РНКаз млекопитающих клетку защищает эволюционно сложившаяся система защиты, опосредованная действием специфического цитозольного ингибитора РНКаз (ИР) [5]. Поэтому для разработки потенциальных противоопухолевых средств весьма перспективны РНКазы, не относящиеся к РНКазам млекопитающих и нечувствительные к действию ИР [6]. К таковым относятся микробные РНКазы. Кроме того, широкие возможности для биоинженерии и практической наработки этих ферментов делает их особо привлекательными для разработки новых терапевтических средств.

Определение молекулярных детерминант РНКаз, ответственных за проявление их цитотоксических свойств по отношению к злокачественным и нормальным клеткам человека, а также изучение их иммуногенной активности позволит обосновать возможность применения микробных РНКаз и биоинженерных конструкций на их основе в лечении злокачественных новообразований и наметить технологические подходы к решению проблемы получения функционально активных терапевтических белков. Ранее мы показали, что РНКаза Bacillus intermedius – биназа – обладает избирательным цитотоксическим действием в отношении клеток ряда опухолевых линий [7, 8], однако без расширения спектра приложения ферментного препарата невозможно дать точную оценку селективности его действия.

Целью настоящей работы явилась цитофлуориметрическая оценка действия биназы на клетки нормального эпителия легкого эмбриона коровы, как «модели» клеток эпителия легких млекопитающих, и бактерий Escherichia coli K12, как «модели» прокариотических клеток, в сравнении с воздействием панкреатической РНКазы А.

Материал и методы

Для экспериментальных исследований использовали две различные РНКазы: биназу – гуанилспецифичную РНКазу Bacillus intermedius 7Р дикого типа (молекулярная масса 12.3 кДа, 109 аминокислотных остатков, pI = 9.5) [9] и панкреатическую РНКазу А быка (Вектор, Россия). Высокая каталитическая активность биназы подтверждена как в отношении синтетических субстратов [10], так и природной высокополимерной РНК дрожжей рода Candida [11]. Уровень гидролизующей РНК активности РНКазы А (kcat/KM около 109/M×c) [12] сопоставим с активностью биназы.

Оценку цитотоксического действия РНКаз осуществляли с помощью клеточной линии эпителия легких эмбриона коровы (ЛЭК) (Российская коллекция клеточных культур позвоночных, Россия) и клеток Escherichia coli K12 (Коллекция кафедры микробиологии КФУ).

Клетки ЛЭК культивировали в питательной среде DMEM (Sigma), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Sigma, США), 2 мМ глутамина (Sigma, США) и по 100 единиц/мл пенициллина и стрептомицина, при 37°С в атмосфере 5% СО2. Культивирование Escherichia coli K12 осуществляли на среде Луриа-Бертани (LB-бульон) следующего состава: дрожжевой экстракт (Difco, США) – 5 г, триптон (Difco, США) – 10 г, NaCl – 10 г, H2O – 1000 мл, рН 7,0. Суспензию клеток ЛЭК засевали в 6-луночные планшеты для клеточных культур 3×105 кл./лунку и культивировали до образования 60% монослоя. Затем среду заменяли на свежую, содержащую РНКазы (100 и 300 мкг/мл), либо без РНКаз (контрольный вариант). Через 24 ч клетки диспергировали с помощью 0,25% раствора трипсина (Sigma, США), ресуспендировали осторожным пипетированием, дважды отмывали охлажденным натрий-фосфатным буфером (PBS, Sigma, США) и полученную суспензию использовали для цитофлуориметрического анализа. Ночную культуру Escherichia coli K12 ресуспендировали в свежем LB-бульоне (контрольный вариант), либо в среде, содержащей 100 и 300 мкг/мл биназы или РНКазы А, (конечная концентрация 106 кл./мл), инкубировали 24 ч при 37°С. Затем клетки отмывали охлажденным PBS и использовали для цитофлуориметрического анализа.

Изменение характеристик клеток фиксировали с помощью проточного цитофлуориметра FACSCanto II (BD, США).

Апоптогенное действие ферментных препаратов на клетки ЛЭК характеризовали с помощью FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I (BD Pharmingen, США) [13], в качестве позитивного контроля использовали классический индуктор апоптоза камптотецин в концентрации 50 мМ [14]. Изменение жизнеспособности клеток E. coli K12 под действием РНКаз определяли с помощью окрашивания йодидом пропидия (PI), как описано в работе L. Shi с соавт. (2007) [15].

Статистическую обработку результатов проводили в программе Statistica 6.0 с использованием непараметрического U-критерия Манна – Уитни (уровень статистической значимости р < 0,05).

Результаты

Цитометрическая оценка жизнеспособности клеток бактерий в присутствии биназы и РНКазы А показала, что ни в одной из исследованных концентраций (100 и 300 мкг/мл) ферментные препараты не оказывали достоверного токсического воздействия на культуру микроорганизмов (рис. 1). Жизнеспособность бактерий после 24 ч культивирования, определенная по числу PI-негативных клеток, составила 94,1%, 94,6%, 94,8%, 93,8% для вариантов с содержанием биназы 100 мкг/мл, 300 мкг/мл, РНКазы А 100 мкг/мл и 300 мкг/мл, соответственно, в то время как в варианте без добавления ферментов доля живых клеток составила 93,3%.

Анализ апоптозиндуцирующей активности биназы и РНКазы А в отношении клеток ЛЭК выявил сходный характер действия данных препаратов. Ни в одной из использованных концентраций биназа и РНКаза А не индуцировали апоптоз клеток эпителия легких эмбриона коровы (рис. 2). Доля клеток, находящихся в состоянии апоптоза, через 25 ч. культивирования составляла 6,5% и 7,2%, 6,4% и 6,8% для вариантов с концентрациями биназы 100 мкг/мл и 300 мкг/мл, РНКазы А 100 мкг/мл и 300 мкг/мл, соответственно, что не имело достоверных отличий от контрольного варианта, в котором доля апоптотических клеток составляла 6%. В то же время, известный индуктор апоптоза камптотецин обладал выраженной апоптозиндуцирующей активностью в отношении данных клеток, вызывая апоптоз у 31,7% клеток.

Обсуждение

Угнетающее рост бактерий действие определенных микробных РНКаз в высоких концентрациях установлено [16], однако, в отличие от биназы, токсичность непосредственно РНКазы А в отношении бактерий не изучалась. В то же время, для катионной РНКазы из эозинофильных гранул человека – члена семейства РНКазы А – известно, что она обладает антистафилококковой активностью [17]. Кожа человека обладает РНКазной активностью, что объясняется секрецией кератиноцитами РНКазы 7, проявляющей антимикробное действие в отношении широкого спектра патогенов [18]. Биназа способна оказывать токсическое действие на клетки бактерий, но лишь в значительно более высоких концентрациях (выше 1000 мкг/мл), чем использовалась в настоящем исследовании, также известны ростостимулирующие эффекты этого фермента в низких концентрациях 0,001–1 мкг/мл [16]. Таким образом, можно предположить, что присутствие биназы и РНКазы А в концентрациях, способных проявлять противоопухолевую активность [7], не будет иметь значительного влияния на микробную флору тканей в перспективных исследованиях in vivo.

Известно, что некоторые цитотоксичные РНКазы, такие как онконаза [19], BS-РНКаза [20], избирательно индуцируют апоптоз опухолевых клеток. Однако механизм относительной избирательности их действия не установлен. Выдвигаются предположения, что селективность действия цитотоксичных РНКаз связана с высокой катионностью молекул ферментов и их нечувствительностью к действию ИР [19, 20]. Частично данная гипотеза подтверждается установленной возможностью приобретения цитотоксических свойств нецитотоксичной РНКазой А при ее димеризации [21], что позволяет ей избежать действия ИР. В то же время, нами ранее показано, что в реализации избирательности действия цитотоксичных бактериальных РНКаз, помимо каталитической активности и катионности, имеют значение экспрессирующиеся опухолевой клеткой определенные онкогены, такие, как kit [8], AML1-ETO [22] или ras [23]. Отмечается также, что селективность цитотоксических РНКаз в отдельных случаях может быть невысокой [4], что приводит к индукции апоптоза не только малигнизированных, но и нормальных клеток в результате действия этих ферментов. Вышесказанное подчеркивает необходимость расширения спектра линий опухолевых и нормальных клеток, в отношении которых охарактеризовано действие данных потенциальных терапевтических агентов. Выявленное нами отсутствие цитотоксического действия биназы в отношении клеток нетрансформированного эпителия эмбрионального легкого является еще одним шагом в этом направлении, позволяющем в перспективе конструировать противоопухолевые агенты на основе РНКаз с максимальной селективностью действия.

Подняться вверх сайта