Поиск Кабинет

Тромболитическая и фибринолитическая активность бактериальных протеаз

Гены & Клетки: Том VII, №3, 2012 год, стр.: 49-51

 

Авторы

Данилова Ю.В., Черёмин А.М., Замалеева А.И., Марданова А.М., Замалютдинова Н.М.,  Шарипова М.Р.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

В медицинской практике все чаще применяют протеолитические ферменты микроорганизмов. Особое внимание исследователей привлекают протеиназы, обладающие фибринолитическими свойствами, а также способные лизировать тромбы. Ранее были выделены и очищены до гомогенного состояния глутамилэндопептидаза, субтилизиноподобная протеиназа и металлоэндопептидаза Bacillus pumilis 3-19, секретируемые рекомбинантным штаммом B. subtilis JB 2036. Проведен анализ тромболитических, фибринолитических и антикоагулянтных свойств рекомбинантных ферментов. Показано, что все исследуемые протеиназы способны эффективно лизировать тромб. В условиях in vitro субтилизиноподобная протеиназа и глутамилэндопептидаза рекомбинантного штамма B. subtilis обладают антикоагулянтной активностью. Металлопротеиназа же не способна повлиять на процесс тромбинообразования. Субтилизиноподобная протеиназа и глутамилэндопептидаза обладают фибринолитической активностью и активаторной способностью по отношению к плазминогену. Металлопротеиназа не проявляет фибринолитических свойств. В связи с широким распространением сердечнососудистых заболеваний актуальным является поиск новых ферментов с высокой биологической активностью, специфичностью и низкой токсичностью.

Сериновые протеиназы бактерий – одна из наиболее изучаемых групп протеолитических ферментов. Они интенсивно используются в фармацевтической промышленности, тканевой инженерии, системной энзимотерапии [1–3]. Одной из перспективных областей применения протеиназ является создание на их основе тромболитических препаратов.

Другой чрезвычайно интересной и перспективной с практической точки зрения группой ферментов являются метцинкиновые эндопептидазы.

Ранее было показано, что бактерии Bacillus pumilus 3-19 секретируют в среду несколько протеиназ, среди которых доминируют сериновые: субтилизиноподобная протеиназа и глутамилэндопептидаза [4]. Позже выяснили, что наряду с сериновыми протеиназами бактерии B. pumilus выделяют в среду также металлоэндопептидазу. Гены данных ферментов были клонированы и секвенированы, последовательности зарегистрированы в Международной базе данных. Была изучена экспрессия этих генов в рекомбинантном штамме B. subtilis [5–7]. Соответствующие белки были выделены в гомогенном состоянии и подробно охарактеризованы [8–10].

Разработка новых эффективных лекарственных препаратов на основе ферментов бактериального происхождения является перспективным направлением современной медицины, микробиологии и биотехнологии.

Представляет интерес изучение тромболитических, фибринолитических и антикоагулянтных свойств эндопептидаз B. pumilus 3-19, секретируемых рекомбинантным штаммом B. subtilis.

Материал и методы

Для определения тромболитических свойств протеиназ аликвоту крови крыс смешивали с раствором тромбина и выдерживали в течение 10 мин в водяном термостате при 37°С для образования сгустков. К сгусткам добавляли раствор препарата фермента и помещали в водяной термостат (в контрольные пробирки добавляли 0,145 М NaCl). Отмечали время полного лизиса свертков.

Способность белков предотвращать образование фибриновых свертков исследовали с помощью тромбоэластографа. Аликвоту плазмы крови человека смешивали с препаратом фермента и выдерживали в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем добавляли раствор CaCl2 (для запуска коагуляционного каскада). В контрольные пробирки вместо белка добавляли 0,145 М NaCl. За процессом тромбообразования следили по кривой тромбоэластографа («Hellige», Австрия).

Активность протеиназ по отношению к фибриновым пластинкам определяли по методу Аструпа [11]. Раствор фибриногена смешивали с раствором тромбина и переливали на чашку Петри, выдерживали при комнатной температуре до образования плотной пленки. Половину чашек с образованными фибриновыми пластинами прогревали в течение 30 мин при 85°С. На прогретые и непрогретые фибриновые пластины наносили каплю 0,145 М раствора NaCl, а поверх неё каплю раствора фермента. Фибриновые пластины инкубировали при 37°С и регулярно измеряли образующиеся зоны лизиса. Площадь зоны лизиса определяли как произведение двух взаимно перпендикулярных диаметров и выражали в квадратных миллиметрах.

Определяли площадь лизиса на прогретой пластине (фибринолитическую активность ферментов), а также активаторную активность протеиназ по отношению к плазминогену – разность между площадями лизиса на непрогретой и прогретой пластинах.

Результаты

Показано, что все исследуемые протеиназы эффективно лизировали тромб. При этом наибольшей активностью обладала субтилизиноподобная протеиназа (табл. 1).

После предварительной инкубации плазмы с металлоэндопептидазой образовывался сверток аналогичный контрольному вне зависимости от концентрации фермента. При инкубации плазмы крови с субтилизиноподобной протеиназой и глутамилэндопептидазой сгусток не образовывался (рис.).

Таким образом, в условиях in vitro субтилизиноподобная протеиназа и глутамилэндопептидаза рекомбинантного штамма B. subtilis обладают антикоагулянтной активностью, в отличие от металлопротеиназы, которая не способна повлиять на процесс тромбинообразования.

Была исследована способность протеиназ рекомбинантного штамма B. subtilis лизировать прогретые и непрогретые фибриновые пластинки. По разности площадей зон лизиса на непрогретой и прогретой пластинках определяли активаторную активность протеолитических ферментов рекомбинантного штамма B. subtilis. Было показано, что после внесения раствора, содержащего белок, небольшие зоны лизиса появились на прогретых чашках через 1,5 ч инкубации при 37°С. Через 20 ч площади зон лизиса фибрина значительно увеличились (табл. 2).

Следовательно, исследуемые белки обладают фибринолитической активностью.

Таким образом, субтилизиноподобная протеиназа и глутамилэндопептидаза обладают как фибринолитической, так и активаторной способностью по отношению к плазминогену. Металлопротеиназа не проявляет фибринолитических свойств.

Обсуждение

Одним из важнейших аспектов практического применения протеиназ является их использование в медицине, в частности, в тромболитической терапии.

Оказалось, что исследуемые протеиназы рекомбинантного штамма B. subtilis обладают дозозависимой тромболитической активностью. При этом наибольшей активностью обладала субтилизиноподобная протеиназа в концентрации 0,4 мг/мл: лизис тромба происходил в течение 125 мин. Наименьшей активностью обладали глутамилэндопептидаза и металлопротеиназа. Известно, что протеиназы B. amyloliquefaciens и B. pumilus в высоких концентрациях (1 мг/мл) эффективно лизируют тромб, при этом наибольшей активностью обладают субтилизиноподобные протеиназы B. pumilus, а наименьшей – глутамилэндопептидазы B. amyloliquefaciens [12].

Все исследованные протеиназы обладали выраженными антикоагулянтными свойствами, сопоставимыми с таковыми для протеиназы B. intermedius [13].

С целью выяснения влияния ферментов B. pumilus, секретируемых рекомбинантным штаммом B. subtilis на процесс тромбинообразования, мы проинкубировали их с плазмой крови человека. Выяснилось, что после предварительной инкубации плазмы с металлоэндопептидазой образовывался сгусток аналогичный контрольному вне зависимости от концентрации фермента, а при инкубации плазмы крови с субтилизиноподобной протеиназой и глутамилэндопептидазой сверток не образовывался. Очевидно, это связано с тем, что фермент, добавленный к крови, разрушает компоненты гемостаза, в результате чего образуется менее плотный сверток.

Ранее было показано, что субтилизиноподобные протеиназы B. amyloliquefaciens обладают высокой фибринолитической активностью [14]. Интересно, что узкоспецифичные глутамилэндопептидазы B. amyloliquefaciens также обладают фибринолитическими свойствами. Они способны не только расщеплять фибриноген, но и оказывают активирующее воздействие на плазминоген, превращая его в плазмин.

Оказалось, что субтилизиноподобная протеиназа и глутамилэндопептидаза обладают как фибринолитической активностью, так и активаторной способностью по отношению к плазминогену. Металлопротеиназа же не проявляет фибринолитических свойств.

Таким образом, субтилизиноподобная протеиназа и глутамилэндопептидаза B. pumilus могут рассматриваться как потенциально перспективные ферменты для применения в качестве тромболитических препаратов.

Подняться вверх сайта